1 轉基因生物 第四章 Transgenicbiology 龔青副教授 基因 是一個特定的DNA片段 編碼一種特定的多肽或蛋白質 是遺傳信息的功能單位 一般說來 從細菌到哺乳動物的全部生命有機體 它們的基因都是由DNA構成的 由于所有生物的DNA的基本結構是一致的 因此 來自兩種生命形態的基因可以融為一體 由此可見 基因的DNA共性 是進行基因工程的重要理論基礎之一 DNA分子是遺傳物質和基因的載體 基因是細胞中所有的RNA及蛋白質分子的 藍圖 一旦基因發生突變 那么由它指導合成的蛋白質也將隨之發生變化 甚至可能導致活性的喪失 1 轉基因 將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中 2 轉基因技術 Transgenetechnology 指利用分子生物學技術 將某些生物的基因轉移到其它物種中 改造生物的遺傳物質 并使其在性狀 營養和消費品質等方面向人類需要的目標轉變 轉基因技術 自然選擇 人工定向改造 轉基因技術 將希望轉入的基因注射到小鼠的受精卵的細胞核中 使注射的DNA整合到受精卵的基因組中 然后將該卵細胞注射 移植 到宿主鼠的子宮中 使其發育 產下子代小鼠 從子代鼠中提取DNA樣品 檢測外源基因 轉移基因 是否整合到了子代鼠中 成功移植 不成功移植 探針檢測到轉移基因 將注射外源基因的卵移植到宿主鼠子宮中 向受精卵中注射外源基因 通常都是將提取的DNA用限制性內切酶進行酶切 然后電泳 將電泳后凝膠上的核酸物質轉移到薄膜 硝酸纖維素薄膜 上 用探針檢測是否存在轉移基因 探針是能夠與轉移基因結合的一段單鏈DNA或RNA 著名的轉基因鼠實驗是讓小鼠攜帶額外的生長激素基因 結果接受了外源生長激素基因的受精卵發育的小鼠的體重是正常小鼠體重的兩倍 利用蘇云金芽孢桿菌在西紅柿細胞DNA內引入一段基因 這段基因能夠編碼出對毛毛蟲有毒性的蛋白 抑制蟲害 抗毛毛蟲西紅柿 正常鼠 轉入生長激素基因的小鼠 轉基因微生物 分解石油的假單孢桿菌等 轉基因動物 轉基因牛 豬 雞 鯉魚等 轉基因植物 轉基因大豆 轉基因抗蟲棉 轉基因玉米 轉基因水稻 轉基因抗除草劑農作物等 轉基因動物 以實驗方法將外源基因導入動物染色體基因組內穩定整合并能遺傳給后代的一類動物 第一節轉基因動物 特點分子及細胞水平操作 組織及動物整體水平表達 轉基因動物的研究歷史 1974年 美國學者Jaenisch首次應用顯微鏡注射法獲得轉基因小鼠 1981年 美國科學家成功地將外源基因導入動物胚胎 創立了轉基因動物技術 1982年獲得轉基因小鼠 1982年 Palmiter將大鼠的生長激素基因導入小鼠受精卵中 獲得體重是對照組2倍的 超級鼠 1985年 Wagner等利用拼接有新霉素抗性基因的逆轉錄病毒感染胚胎干細胞 ES細胞 獲得嵌合體小鼠 為利用ES細胞制備轉基因小鼠開辟了先河 轉基因超級鼠 1982年 英國的 自然 雜志發表了一篇文章 有兩個美國實驗小組利用轉基因技術 將大鼠生長激素重組基因導入到小鼠受精卵中 培育出具快速生長效應的 轉基因超級鼠 轉基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2 3倍 體積大一倍 1989年 意大利學者用精子作為載體轉移目的基因 成功地獲得了純系轉基因小鼠 1987年 世界上第一只商業化轉基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生 這只轉基因母羊的乳汁中可以分泌 抗胰蛋白酶 含量高達30毫克 升 1997年2月 英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊 多利 培育成功 1999年2月 上海遺傳研究所宣布轉基因試管牛 滔滔 誕生 其體內被檢測到帶有人的血清白蛋白基因 這項成果被評為當年 中國十大科技進展 之一 1997年10月 英國羅斯林研究所 Roslin 宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子 基因轉染綿羊 二 基本原理 獲取外源目的基因 實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中 目的基因整合到基因組中 再植入受體動物輸卵管 子宮 揭示外源基因的功能 顯微注射等基因轉移方法 發育成攜帶有外源基因的轉基因動物 培育優良的動物品種 轉基因技術操作的具體流程 一 目的基因的設計轉基因可分為隨機整合型基因和基因敲除 geneknockout 型載體基因 隨機整合型基因要求結構完整 包括5 上游啟動子區和3 下游區等 多用基因組文庫篩選或人為改造基因 改造基因可選擇不同的啟動子來控制外源基因表達的組織特異性 基因敲除 geneknockout 型載體基因要設計與待剔除基因的同源性的載體基因 三 轉基因的基本方法 二 重組載體的構建選擇合適的基因載體 要求載體序列不干擾外源基因的表達 能接受外源DNA 穩定 對宿主細胞無威脅 三 重組載體的體外驗證 invitro 重組載體的正確性驗證 如拷貝數 連接方向等 對于連有組織特異性啟動子或局部體細胞轉染的載體需先在同類型的體外離體培養細胞中初步驗證表達特性 四 基因轉移1 化學法2 物理法3 生物法 五 轉基因動物模型的驗證從基因組 mRNA 蛋白質和整體表型各個層次進行驗證 用核酸雜交 聚合酶鏈反應 免疫印跡雜交 酶聯免疫法 免疫熒光法和Western雜交法等多種方法 篩選出有外源基因整合的陽性動物 傳代后檢測外源基因在轉基因動物中的表達情況 對外源基因表達產物的生物活性和生化性質進行鑒定 以及檢查轉基因動物的生理功能和是否出現某些疾病癥狀的表型等 六 組建轉基因系第一代轉基因動物是半合子轉基因動物 因為外源基因僅在一條染色體上穩定整合 只有通過選種選配 將兩個半合子轉基因動物成功交配 才能得到純合子轉基因動物 建立轉基因動物家系 外源DNA才能在后代中穩定遺傳 1 顯微注射法 以單細胞受精卵為靶細胞 利用顯微注射技術將構建好的外源DNA直接注射到受精卵的原核內 再把接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管 使之發育成正常的幼仔 獲得轉基因動物個體 目前應用較廣泛 最早最經典的方法 操作技術性很強 受過嚴格訓練的專業人員操作 發育成轉基因動物的受精卵也只占注射卵的5 因此用增大微注射受精卵的數目的辦法提高成功率 轉基因的主要技術 1 顯微注射法microinjection它是創造轉基因動物的有效途徑 microinjection 顯微注射法將外源基因導入生殖細胞和體系胞后 在染色體上的整合位置是隨機的外源基因甲基化程度在胚胎發育過程中會影響其活性某些外源基因的表達程度可受到個體細胞正常調節機制的控制由于受到宿主組織分化的影響 外源基因還具有一定的組織特異性 顯微注射法獲得轉基因鼠的成活率 優點 外源DNA大小基本不受限制 1 50kb 導入過程直觀 無需載體缺點 設備昂貴 環節較多對操作人員有較高的技術要求效率低 尤其是大家畜 對卵子傷害大 胚胎存活率低轉基因沉默 2 胚胎干細胞 ES細胞 法 ES細胞是早期胚胎的內細胞團經過體外培養建立起來的多潛能細胞系 它是一種含正常二倍體染色體的具有發育全能性的細胞 可以在體外進行人工培養 擴增 并能以克隆的形式保存 將攜帶有外源基因的ES細胞注射入動物的早期胚胎內 將來出生的動物的生殖系統就有可能整合上外源基因 再通過雜交繁育得到純合目的基因的個體 即為轉基因動物 目前 胚胎干細胞介導法在小鼠上應用比較成熟 在大動物上應用較晚 優點 1 外源基因整合情況的可控性高 可預先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數 定位 表達的水平及插入的穩定性2 外源基因導入ES細胞的方法多樣 如逆轉錄病毒感染法 電擊法等 細胞鑒定及篩選方便缺點 1 ES細胞系建立及培養困難2 維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易 將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上 制成高滴度病毒顆粒 人為感染著床前后的胚胎 也可直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共同培養以達到感染目的 獲得轉基因動物的方法 目前這種方法主要應用于雞胚胎操作 3 逆轉錄病毒感染法 反轉錄病毒感染法的載體的構建 提取病毒未整合的環狀形式DNA 將環狀DNA克隆到適當的載體中 選擇適當的酶將病毒結構蛋白編碼區切除 將外源目的基因克隆到載體中 通過物理方法將重組DNA分子轉入包裝細胞 反轉錄病毒載體的工作原理 寄生在受體細胞中的重組病毒由于沒有包裝信號 能生產病病毒RNA和所有蛋白質 但不能包裝成病毒顆粒 病毒載體轉化受體細胞后 載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒 優點 受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單 避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎 感染率及胚胎存活率高 缺點 容納大小有限潛在致癌性 載體復雜整合率不高 胚胎自我保護機制對其有抗性 4 體細胞核移植方法 將外源基因導入到體細胞中 篩選 培養 擴增 用這種細胞的細胞核進行核移植 即把體細胞核植入一個去了核的卵母細胞中 融合并激活 將重構胚胎進行體外培養或者植入同步化的假孕動物的輸卵管 1997年2月17日英國Roslin研究所的Wilmut從1只六歲母羊的乳腺上皮細胞成功的克隆到了一只綿羊一多利 Dolly 這是人類第一次采用分化的體細胞作為供體細胞 它的成功是20世紀生物學重大突破之一 學術意義在于證明分化的體細胞甚至是分化終端的體細胞核仍有全能性 優點 轉基因效率顯著超過顯微注射可以方便的建立生產畜群可以預測基因表達水平可以使用定點整合目標基因的技術對體細胞進行基因改造后 用于核移植可以提高轉基因的效率 具有 ES細胞途徑 的全部優點 且物種適用面廣 缺點 技術上難度大 成功率極低 胚胎死亡率高 非一般實驗室可以開展 直接以精子為載體的轉基因方法 將成熟精子與外源 共培養 成熟精子與外源DNA預培養之后使精子有能力攜帶外源DNA進入卵子中 使之受精 并使外源DNA整合到染色體中 目前國際上只有1例成功模型 國內也很少有相關報道 精子載體法很少被應用 5 精子載體法 染色體及基因水平 斑點雜交 Southern雜交 PCR轉錄水平 Northern雜交蛋白質水平 Western印跡 轉基因動物中外源基因的檢測 轉基因動物研究存在的問題 轉基因動物的低效性轉入基因造成宿主基因突變問題轉入基因的表達問題病毒轉基因研究存在的問題轉基因動物模型與預期不符問題乳腺生物反應器的問題社會問題 轉基因動物研究出現的問題 1 制作轉基因動物效率低 如顯微注射法生產轉基因動物小鼠 大鼠 兔 牛 豬 綿羊 轉基因陽性率分別為26 44 15 0 7 0 9 0 9 2 外源基因在宿主基因組中的行為難以控制 轉基因隨機整合于動物基因組中 有可能引起宿主細胞染色體的插入突變 可造成插入位點的基因片段的丟失及位移 也可能激活正常情況下處于關閉的基因 其結果導致轉基因陽性個體出現不育 胚胎死亡 流產 畸形等異常現象 3 轉基因表達水平低 許多轉基因的表達水平受到宿主染色體上整合位點的影響 出現異位表達 影響轉基因的表達能力 從而使大部分轉基因表達水平較低 轉基因動物的應用 一 轉基因動物在生命科學基礎研究中的應用 研究基因的結構與功能研究基因的組織特異性表達研究發育相關基因的表達與調控克隆在發育中起重要作用的基因基因多級調節系統的研究細胞功能研究 基因敲除 geneknockout 是指對一個結構已知但功能未知的基因 從分子水平上設計實驗 將該基因去除 或用其它順序相近基因取代 然后從整體觀察實驗動物 推測相應基因的功能 這與早期生理學研究中常用的切除部分 觀察整體 推測功能的三部曲思想相似 基因敲除的技術路線如下 1 構建重組基因載體 2 用電穿孔 顯微注射等方法把重組DNA轉入受體細胞核內 3 用選擇培養基篩選已擊中的細胞 4 將擊中細胞轉入胚胎使其生長成為轉基因動物 對轉基因動物進行形態觀察及分子生物學檢測 二 轉基因動物在醫藥研究領域中的應用 研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉基因動物模型轉基因動物與基因治療生產天然活性藥物蛋白 1 轉基因動物是對多種生命現象本質深入了解的工具 如研究基因的結構與功能的關系 細胞發育的潛能性 細胞核與細胞質的相互關系 胚胎發育調控 腫瘤 神經與發育等 2 可用來建立多種疾病的動物模型 進而研究這些疾病的發病機理及治療方法 如代謝病高歇氏 Gaucher 病轉基因小鼠的應用 3 轉基因動物技術可由于改造動物的基因組而改良其經濟性狀 提高經濟效益 4 轉基因動物可作為醫用或食用蛋白的生物反應器 如轉基因山羊抗凝血酶III 轉基因綿羊 1 抗胰蛋白酶 轉基因兔的 葡萄糖苷酶 5 通過轉基因動物可以生產人體或動物進行器官或組織移植時所需的器官和組織 如家畜胎兒神經細胞可替代人類神經細胞用于帕金森癥的治療 第三軍醫大學西南醫院將轉基因乳豬皮用于皮膚移植 豬器官的體積和形狀以及DNA基本與人類相似 是理想的腎 心 肝等器官供應者 但存在免疫排斥 可通過轉基因技術和克隆技術培育大量不含免疫排斥的轉基因克隆豬的器官 乳腺生物反應器的研究1987年 Gordon首次報道小鼠乳腺中表達tPA蛋白 至今國際上轉基因羊 轉基因牛等的成功報道實例已有10多種 生產出抗胰蛋白酶 乳鐵蛋白 人凝血蛋白因子 蛋白質C等藥用蛋白 國外經濟學家預期 10年后 轉基因動物生產的藥物銷售額超過250億美元 基因藥物生產 基因藥物生產第一階段是細菌基因工程 第二階段是動物細胞基因工程 第三階段是轉基因動物 乳腺生物反應器 三 轉基因動物研究進展1 英格蘭羅斯林研究所 Roslin 1997年成功培育轉基因綿羊 其乳汁中含有人的凝血因子IX 用來治療血友病 含有的 抗胰蛋白酶可治療北美肺氣腫 2 日本培育的轉基因雞含有白血病阻止因子 可能成為生產抗癌藥品的 動物工廠 3 湖北省農科院魏慶信研究員2000年培育轉基因豬 能合成人血清白蛋白 為治療因失血 創傷 癌癥等引起的休克 水腫等提供醫用血清白蛋白開辟了新途徑 4 華中農業大學和中國農業大學合作 用轉基因小鼠乳腺表達人瘦蛋白的研究 5 用轉基因技術生產的基因工程小鼠已經達到很高的水平 如將特定的外源基因插入小鼠的基因組 可得到轉基因小鼠 transgenicmice 將小鼠的基因組中特定內源基因定點突變 可得到基因剔除小鼠 geneknockoutmice 將小鼠的基因組中特定內源基因進行定向重組 可得到基因替換小鼠 geneknockinmice 為醫學研究提供了豐富的動物模型 如BALB C HSF1用于熱休克研究 Smad3用于研究粘膜免疫缺陷和骨性關節炎等 6 轉基因研究已經滲透到醫學 遺傳學 發育生物學 畜牧學等領域 轉基因動物的應用前景1 研究外源基因在動物整體水平的表達調控規律 2 轉基因動物疾病模型可用來進行疾病發病學和治療性研究3 改善動物生產性能 提高動物育種效率 4 改變動物基因使其表現型更適合人類需要 用轉基因動物生產一些人類所需的生物活性物質 第二節轉基因植物 轉基因植物 transgenicplant 是指利用重組DNA技術將克隆的優良目的基因導入植物細胞或組織中進行表達 從而獲得新性狀的植物 這一技術使基因交流的范圍無限擴大 可將從細菌 病毒 動物 遠緣植物 人工合成的基因導入植物 所以其應用前景十分廣闊 一 基本方法 獲取外源目的基因 克隆到表達載體 培養受體細胞 如培養懸浮細胞 將轉化細胞進行適當培養 篩選陽性轉化細胞 轉基因植株的鑒定 電擊法 基因槍法 顯微注射法 培植陽性轉化植株 抗蟲基因 1 技術路線 目的基因分離 植物表達載體的構建 受體材料的準備 遺傳轉化 轉化組織 組織脫分化 轉化植株篩選 煉苗 1 目的基因的分離 1 已知基因的獲得 化學合成法 PCR擴增 2 未知基因的獲得 構建基因組文庫 篩選目的基因 構建cDNA文庫 篩選目的基因 mRNA差異顯示技術篩選差異表達基因 差異蛋白質譜表達技術篩選功能基因 pGEM T 銀杏葉RNA提取 反轉錄cDNA 全長cDNA的克隆 克隆及測序 兩端引入酶切位點 雙酶切 定向克隆 導入農桿菌 2 植物表達載體的構建 例pBI121 chs構建 pBI121圖譜 3 遺傳轉化 1 間接轉化法 農桿菌介導轉化法 2 直接轉化法A 基因槍轉化法B 電擊法C 花粉管通道法D PEG介導基因轉化法 根癌農桿菌 Agrobacteriumtumefaciens 是一種革蘭氏陰性土壤桿菌 它含有Ti質粒 能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤 即誘發冠癭瘤 Ti質粒 包括Ri質粒 上有一段轉移DNA 在農桿菌侵染宿主植物時 這段DNA可以轉移進植物細胞 并穩定地保留在植物細胞染色體中 變為植物細胞新增加的一群基因 最終能通過有性世代遺傳給子代 基因槍轉化法由美國Cornell大學的Sanfor 1987 提出 它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒 鎢粒或金粒 表面 通過高壓驅動力加速微粒穿透植物細胞壁 導入受體組織細胞內 然后通過組織培養再生出完整的植株 微粒上的外源DNA進入細胞后 整合到染色體上并得到表達 從而實現基因的轉化 電擊法的主要原理是將原生質體在溶液中與DNA混合 然后利用高壓電脈沖作用 使原生質體膜的某些部位被擊穿而產生可回復的小孔 外源DNA可通過小孔進入原生質體內 而且不影響經電擊處理的原生質體再生植物的能力 花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道 直接將外源目的基因導入尚不具備正常細胞壁的卵 合子或早期胚胎細胞 實現目的基因轉化 PEG介導基因轉化的主要原理是聚乙二醇 PEG 多聚 L 鳥核苷酸 pLO 磷酸鈣及高pH值條件下誘導原生質體攝取外源DNA分子 PEG可促使細胞膜與DNA間接觸與粘連 并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細胞間的識別 利于細胞膜間的融合以及外源DNA進入原生質體 表1幾種植物轉基因方法比較 4 轉化組織 農桿菌介導之葉盤轉化法 帶有轉化基因的農桿菌活化 受體植物 葉盤 侵染 共培養 篩選培養 誘導成苗 5 煉苗 6 轉基因苗的篩選與鑒定 培養過程中利用標記基因篩選 標記基因 選擇標記基因 Slectivegene 報告基因 Reportgene 抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標記類選擇基因 例Gus檢測 原理 葡萄糖酸苷酶基因 Gus 催化 葡萄糖苷酯類物質水解 其中很多水解產物具有發色團或形成熒光物質 例 組織化學法測定Gus活性作用底物為X gl