班級：植物092 姓名：徐煒佳 學號：0901080223淀粉酶活性的測定一、研究背景及目的酶是高效催化有機體新陳代謝各步反應的活性蛋白，幾乎所有的生化反應都離不開酶的催化，所以酶在生物體內扮演著極其重要的角色，因此對酶的研究有著非常重要的意義。酶的活力是酶的重要參數，反映的是酶的催化能力，因此測定酶活力是研究酶的基礎。酶活力由酶活力單位表征，通過計算適宜條件下一定時間內一定量的酶催化生成產物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，按照其水解淀粉的作用方式，可分為-淀粉酶和-淀粉酶等。-淀粉酶和-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。-淀粉酶存在于休眠的種子中，而-淀粉酶是在種子萌發過程中形成的。-淀粉酶活性是衡量小麥穗發芽的一個生理指標,-淀粉酶活性低的品種抗穗發芽,反之則易穗發芽。目前,關于-淀粉酶活性的測定方法很多種,活力單位的定義也各不相同,國內外測定-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠擴散法、3,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法。這3種方法所用的材料分別是新鮮種子、萌動種子和面粉,獲得的-淀粉酶活性應該分別是延遲(內源)-淀粉酶、萌動種子-淀粉酶和后熟面粉的-淀粉酶活性。測定方法優點缺點DNS靈敏、準確、精確度高,適宜精確測量小樣品-淀粉酶活性大小測定步驟較繁,不便分析大量樣品,測定范圍較窄凝膠擴散法簡便、快速、省時、省力,消耗材料和藥品較少,不需要特殊儀器,測定范圍較寬邊界不清晰,靈敏度與準確度較低,不適宜精確測量-淀粉酶活性的大小降落值法快速、省時、重現性好、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測量大量樣品消耗的材料多,間接測定-淀粉酶活性大小本實驗的目的在于掌握-淀粉酶和-淀粉酶的提取和測定方法。二、實驗原理萌發的種子中存在兩種淀粉酶，分別是-淀粉酶和-淀粉酶，-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下則發生鈍化。本實驗的設計利用-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下（70）下處理使得-淀粉酶鈍化而測定-淀粉酶的酶活性。酶活性的測定是通過測定一定量的酶在一定時間內催化得到的麥芽糖的量來實現的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時間內生成麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得兩種淀粉酶的總活性。實驗中為了消除非酶促反應引起的麥芽糖的生成帶來的誤差，每組實驗都做了相應的對照實驗，在最終計算酶的活性時以測量組的值減去對照組的值加以校正。在實驗中要嚴格控制溫度及時間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，四支測定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實驗材料：萌發的小麥種子（芽長1厘米左右）儀器：722光柵分光光度計(編號990695) DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(編號L-304056) 離心機(TDL-40B) 容量瓶：50ml1，100ml1小臺秤研缽具塞刻度試管：15ml6試管：8支移液器燒杯試劑： 1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸餾水，加熱熔解，冷卻后定容至100ml）； pH5.6的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液； 3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）； 麥芽糖標準液（稱取0.100克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； 0.4M NaOH四、實驗步驟1. 酶液的制備稱取2克萌發的小麥種子與研缽中，加少量石英砂，研磨至勻漿，轉移到50ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，混勻后在室溫下放置，每隔數分鐘振蕩一次，提取15-20分鐘，于3500轉/分離心20分鐘，取上清液備用。2.-淀粉酶活性的測定 取4支管，注明2支為對照管，另2支為測定管 于每管中各加酶提取液液1ml，在70恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應超過0.5）準確加熱15min，在此期間-淀粉酶鈍化，取出后迅速在冰浴中徹底冷卻。 在試管中各加入1ml檸檬酸緩沖液 向兩支對照管中各加入4ml 0.4M NaOH，以鈍化酶的活性 將測定管和對照管置于40（0.5）恒溫水浴中準確保溫15min再向各管分別加入40下預熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40水浴中準確保溫5min后取出，向兩支測定管分別迅速加入4ml 0.4M NaOH,以終止酶的活性，然后準備下步糖的測定。3. 兩種淀粉酶總活性的測定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數視樣品酶活性大小而定，一般為20倍）。混合均勻后，取4支管，注明2支為對照管，另2支為測定管，各管加入1ml稀釋后的酶液及pH5.6檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復-淀粉酶測定的第及第的操作。4. 麥芽糖的測定標準曲線的制作取15ml具塞試管7支，編號，分別加入麥芽糖標準液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸餾水補充至1.0ml，搖勻后再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準確保溫5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計于520nm波長下比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標，以麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。樣品的測定 取15ml具塞試管8支，編號，分別加入步驟2和3中各管的溶液各1ml，再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計于520nm波長下比色，記錄消光值，根據標準曲線進行結果計算。五、數據整理及計算麥芽糖標準液濃度mg/ml00.10.30.50.70.91.0OD520項目 (測)(測)(對)(對)+(測)+(測)+(對)+(對)OD520平行組數據均值OD520 樣品麥芽糖濃度mg/ml 上表中前4行數據為實驗的原始數據。以表中前兩行數據繪制標準曲線（見下頁），計算上表中第4行數據（各樣品的OD值）均值，填入上第5行中，根據標準曲線的方程，計算第5行OD值所對應的麥芽糖濃度，填入最后一行，如上表。根據以上的數據整理的結果，結合以下公式計算兩種淀粉酶的活性：A-淀粉酶測定管中的麥芽糖濃度A-淀粉酶對照管中的淀粉酶的濃度B(-+-)淀粉酶總活性測定管中的麥芽糖濃度B(-+-)淀粉酶總活性對照管中的麥芽糖濃度計算結果如下： -淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1） (-+-)淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）-淀粉酶活性= （毫克麥芽糖克-1鮮重分鐘-1）六、結果分析七、思考題1、酶活力測定實驗的總體設計思路是什么？實驗設計的關鍵你認為是什么？為什么？答：利用酶的專一性或酶活力的影響因素抑制除待測酶以外的其它酶活性，通過測酶促反應的產率推算酶活力大小。關鍵在于抑制其它酶的活力而不影響測定酶，這樣可以減小或避免其它酶產物給測定結果帶來的誤差。2、本實驗最易產生對結果有較大誤差影響的操作是哪些步驟？為什么？怎樣的操作策略可以盡量減少誤差？答：浸提步驟。70溫度或15min時間控制不嚴格不準確則可能導致淀粉酶未完全鈍化使測得活性偏大。應嚴格控制溫度和時間。70水浴后需要立即冰浴，否則淀粉酶復性使測得淀粉酶活性結果偏大。向測定管中加入NaOH時應迅速，否則酶與底物繼續反應使結果偏大。3、a-淀粉酶活性測定時70水浴為何要嚴格保溫15分鐘？保溫后為何要立即于冰浴中驟冷？答：由于b-淀粉酶不耐熱，在70下處理一定時間可以鈍化，嚴格保溫15分鐘可以達到理想的鈍化效果，時間過長，a-淀粉酶活性也會受到影響；時間不足，b-淀粉酶鈍化不完全。保溫后立即驟冷是為了通過劇烈的溫變改變b-淀粉酶的結構以防止在隨后的反應中復性，這樣就保證了在隨后的40溫浴的酶促反應中b-淀粉酶不會再參與催化反應。此外我認為冰浴使酶迅速降溫，便于嚴格控制高溫處理時間的長短。4、pH5.6檸檬酸緩沖液的作用？各管于40水浴準確保溫15分鐘的作用？答：酶實驗體系的pH值變化或變化過大，會使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的緩沖液調至酶促反應的最適pH，同時穩定溶液的pH不至于在反應過程中大幅波動。40水浴準確保溫15分鐘為調整酶促反應的最適溫度5、眾多測定淀粉酶活力的實驗設計中一般均采取鈍化b-淀粉酶的活力而測a-淀粉酶和測總酶活力的策略，為何不采取鈍化a-淀粉酶活力去測b-淀粉酶活力呢？這種設計思路說明什么？答：淀粉酶與淀粉酶的催化特性是有差異的。淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開始，切斷至-1,6-鍵的前面反應就停止了；而淀粉酶則無差別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的-1，4-糖苷鍵，所以淀粉酶需要淀粉酶淀粉支鏈的-1，4-糖苷鍵后才能完全體現其催化能力。此外我認為在實驗中溫度比酸度更易控制，鈍化淀粉酶難度遠遠高于淀粉酶，而且若提高酸度鈍化淀粉酶，則回調最適pH時淀粉酶也有可能由于復性恢復活力。這種設計思路說明在測定酶的比活力時要綜合考慮各種可能出現的酶的性質以及它們之間的聯系，也要考慮到實驗操作的可行性。6、本實驗中所設置的對照管的作用？它與比色法測定物質含量實驗中設置的空白管有何異同？本實驗可否用對照管調分光光度計的100%T？為什么？答：消除非酶促反應（如淀粉酸性環境下加熱水解）和非測定時間內的酶促反應引起的麥芽糖的生成帶來的誤差。兩種都是為了消除非測定部分對光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對光的吸收，而對照管是為了消除非測量所需反應所得的多余溶質對光的吸收。不可，因為標準曲線的確定是在空白的基礎上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關系7、我們所測定得到的總酶活力減去所測定得到的a-淀粉酶活力是否就等于b-淀粉酶活力？為什么？你的結論說明什么？答：不等于。因為淀粉酶和淀粉酶作用于-1,4糖苷鍵，但二者都不能水解支鏈的-1，6-糖苷鍵，而我們所測定得到的總酶活力是二者在與R酶的共同作用下測得的酶活力，R酶能夠降解支鏈淀粉，斷裂-1,6-糖苷鍵，從而增大了淀粉酶和淀粉酶可水解的底物濃度，使測得的總活力大于淀粉酶和淀粉酶單獨作用的酶活力之和。我的結論說明實驗時要考慮各種酶協同作用的綜合因素 七、參考文獻1生物化學實驗指導 中國農業大學生物化學實驗室 中國農業大學自編教材2基礎生物化學 趙武玲 中國農業大學出版社3 岳海鳳1,2,郜慶爐2,薛香2 小麥-淀粉酶活性測定方法比較(1.河南農業大學,河南鄭