第十三章 表觀遺傳學第一節 概 述一表觀遺傳學(epigenetic)：DNA的序列不發生變化、基因表達改變、并且這種改變可穩定遺傳。二表觀遺傳學研究的內容： 1. 基因選擇性轉錄、表達的調控。2. 基因轉錄后調控。(表觀遺傳通常被定義為DNA的序列不發生變化但是基因表達卻發生了可遺傳的改變，也就是說基因型未變化而表型卻發生了改變，這種變化是細胞內除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質的改變，并且這種改變在發育和細胞增殖的過程中能穩定的傳遞下去。表觀遺傳學研究內容具體來說主要包括DNA甲基化表觀遺傳、染色質表觀遺傳、表觀遺傳基因表達調控、表觀遺傳基因沉默、細菌的限制性基因修飾等。從更加廣泛的意義上來說，DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙酰化、基因沉默、基因組印記、染色質重塑、RNA剪接、RNA編輯、RNA干擾、x染色體失活等等都可以歸入表觀遺傳學的范疇，而其中任何一個過程的異常都將影響基因結構以及基因表達，導致某些復雜綜合癥、多因素疾病或癌癥。)三表觀遺傳修飾從多個水平上調控基因表達： 1.RNA水平：非編碼RNA可通過某些機制實現對基因轉錄以及轉錄后的調控，例如microRNA、RNA干擾等2.蛋白質水平：通過對蛋白質的修飾或改變其構象實現對基因表達的調控，例如組蛋白修飾3.染色質水平：通過染色質位置、結構的變化實現對基因表達的調控，例如染色質重塑以上幾個水平之間相互關聯，任何一方面的異常都將影響染色質結構和基因表達。四表觀遺傳學的研究意義：1. 表觀遺傳學補充了“中心法則”所忽略的兩個問題，即哪些因素決定了基因的正常轉錄和翻譯以及核酸并不是存儲遺傳信息的唯一載體。2. 表觀遺傳信息可以通過控制基因的表達時間、空間和方式來調控各種生理反應。所以許多用DNA序列不能解釋的現象都能夠找到答案。3. 與DNA序列的改變不同，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這使表觀遺傳疾病的治愈成為可能。第二節 表觀遺傳修飾一.DNA甲基化(DNA methylation)DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式。通過甲基供體S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環上5位置的氫被活性甲基所取代，從而轉變成5-甲基胞嘧啶(5-mC) 。DNA復制后甲基化型的維持 胞嘧啶甲基化反應真核生物中存在兩種甲基轉移酶：一種起維持甲基化的作用，主要是甲基轉移酶1（DNMT 1），在模板鏈的指導下，它能使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化；另一種起形成甲基化的作用，主要是甲基轉移酶3a和3b（DNMT 3a、DNMT 3b），它們能在未發生甲基化的DNA雙鏈上進行甲基化，并且該過程不需要模板鏈的指導。圖：CpG島（CpG island）在某些區域CpG序列的密度比平均密度高出許多，其長度大于200個堿基，這些區域命名為CpG島。CpG島位于基因上游調控區的啟動子，這些基因為管家基因或組織特異表達基因。 圖：甲基化抑制基因的表達(一般而言，DNA甲基化會抑制基因的表達。發生在基因啟動子或其附近區域的甲基化將直接阻礙轉錄因子與啟動子結合，使基因不能轉錄或降低基因的轉錄水平。同時，基因5端的調控元件發生甲基化后能結合特定甲基化CpG序列結合蛋白（methyl CpG binding protein，MBP），從而間接阻止轉錄因子與啟動子形成轉錄復合體。甲基化還能改變染色質的構象，使染色質凝縮成非活性的高級結構。) DNA甲基化基因沉默(gene silence) 非甲基化(non-methylation)基因活化(gene activation) 去甲基化(demethylation)沉默基因的重新激活（reactivation）DNA高甲基化：基因啟動子區的CpG島在正常狀態下一般是非甲基化的，當發生甲基化時，基因轉錄沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修復基因等喪失功能，從而導致正常細胞的生長分化調控失常以及DNA損傷不能被及時修復，這與多種腫瘤形成密切相關。DNA低甲基化：整個基因組普遍低甲基化，這種廣泛的低甲基化會造成基因的不穩定，這與多種腫瘤的發生有關。DNA的低甲基化也可能在異常組蛋白修飾的協同下引起某些T細胞基因的異常活化、導致自身免疫性疾病的發生。整個基因組中普遍存在著低甲基化，主要發生在DNA重復序列中，如微衛星DNA、長散步元件(LINES)、中度重復順序Alu順序等。二 組蛋白修飾DNA以染色質的形式存在，染色質通常由DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA包裝而成，其中組蛋白是染色質的基本結構蛋白。 組蛋白的N-末端可通過共價作用從而發生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻譯后的修飾，這些修飾的信息構成了豐富的組蛋白密碼，其中乙酰化和甲基化是最為重要的修飾方式。組蛋白乙酰化：是由組蛋白乙酰基轉移酶(HAT)和組蛋白去乙酰基酶(HDAC)協調催化完成，修飾的部位一般位于N-末端保守的賴氨酸殘基上。組蛋白乙酰化是一個可逆的動力學過程，可以調節基因的轉錄。組蛋白甲基化：組蛋白甲基化多發生于組蛋白H3、H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由特異的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histone methyltransferase, HMT)催化完成，也是一個可調控的動態修飾過程。而組蛋白的去甲基化是由賴氨酸去甲基酶(lysine-specific demethylase 1, LSD1)催化完成。組蛋白的其他修飾：組蛋白泛素化由E1、E2、E3級聯酶催化修飾，也是一個可逆的動力學過程。 所有組蛋白的組分均能磷酸化。 組蛋白的各種修飾不是相互獨立的，而是互相聯系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促進H3-K14乙酰化，而H3-K9的甲基化則會阻止H3-Serl0的磷酸化。三染色質重塑(remodeling) 染色質重塑是指染色質位置、結構的變化，主要包括緊縮的染色質在核小體連接處發生松動造成染色質的解壓縮，從而暴露了基因轉錄啟動子區中的順式作用元件，為反式作用因子的結合提供了可能。染色質重塑與基因轉錄染色體重塑的過程由兩類結構所介導：ATP依賴型的核小體重塑復合體和組蛋白共價修飾復合體。前者通過水解的作用改變核小體構型；后者則對核心組蛋白N-末端尾部的共價修飾進行催化。這種修飾直接影響核小體的結構，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結合位點四非編碼RNA調控(ncRNA) 功能性非編碼RNA在表觀遺傳修飾中發揮極其重要的作用。ncRNA按照大小可分為兩類：長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。 長鏈非編碼RNA在基因簇乃至于整個染色體水平上發揮順式調節作用，短鏈RNA在基因組水平對基因的表達進行調控。1)長鏈非編碼RNA X染色體的失活就是長鏈ncRNA所介導的甲基化和組蛋白修飾共同參與的一個復雜的過程。x染色體上的失活基因編碼出相應RNA，這些RNA包裹在x染色體上，達到某一水平后，在甲基化和組蛋白修飾的參與下共同導致并維持x染色體的失活。 此外長鏈ncRNA常在基因組中建立單等位基因表達模式，在核糖核蛋白復合物中充當催化中心，對染色質結構的改變發揮著重要的作用。2)短鏈非編碼RNA短鏈非編碼RNA(又稱小RNA)能夠介導mRNA的降解，誘導染色質結構的改變，決定著細胞的分化命運，還對外源的核酸序列有降解作用以保護本身的基因組。五不同表觀遺傳學修飾之間的相互調控:表觀遺傳修飾從多個水平上調控基因表達，而不同水平的調控之間也是相互關聯的，任何一方面的異常都可能影響到其他水平的表觀遺傳修飾。事實上不同水平的表觀遺傳修飾在真核細胞中構成了一個完整的表觀遺傳調控網絡。第三節 表觀遺傳疾病一.DNA甲基化與疾病 DNA甲基化與腫瘤腫瘤細胞中的DNA甲基化一般表現為總體的低甲基化水平和特定區域的高甲基化，這些變化可以同時發生在同一腫瘤組織內。基因總體甲基化水平降低導致染色體不穩定、DNA修復基因、細胞周期調控基因、細胞凋亡基因相應的CpG島的甲基化沉默，進而促進了腫瘤細胞的形成。原癌基因(oncogene)：較低水平的原癌基因對于細胞的生長、發育、分化和信號傳導都是必需的，當發生突變或基因異常表達時癌癥就產生了。研究發現原癌基因通常在腫瘤新生物中呈現低甲基化狀態。腫瘤抑制基因(tumor suppression gene)：腫瘤抑制基因的產物能夠抑制細胞的生長，失去其功能將促進細胞的轉化；與原癌基因在激活方式上的不同在于腫瘤抑制基因的激活必須有等位基因的兩次突變或缺失。藥物：葉酸和維生素B12都是甲基的供體，能影響甲基化的狀態，主要是對全基因組甲基化上調的影響。環境因素：環境因素亦可影響腫瘤中基因的甲基化，從而間接的促進或影響腫瘤的發生。 DNA甲基化與自身免疫性疾病DNA甲基化的改變可以影響一些與黏附分子和細胞因子表達相關的基因，導致T細胞的自身反應性改變，因此對維持T細胞的功能至關重要。研究證實，沒有維持DNA甲基化水平和模式的成熟T細胞，在體內、外均能發生自身反應性，因此表觀遺傳的失控可以引起自身免疫性疾病。系統性紅斑狼瘡(, SLE)、類風濕性關節炎(RA)、強直性脊柱炎(, AS)、系統性硬化癥(SSc) DNA甲基化與衰老DNA:甲基化作為哺乳動物細胞基因組修飾和表達調控的后遺傳方式，在細胞的衰老過程中總體水平下降，同時又伴隨著某些基因的高甲基化。永生化細胞基因組的甲基化水平較高，因此甲基化水平過高又是腫瘤細胞的表現。目前年齡相關的甲基化已作為細胞生命歷史的標簽。 DNA甲基化與心血管疾病:心血管疾病被認為是受甲基化控制的人類重要疾病，對心血管疾病的DNA甲基化調控機制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同時DNA甲基化的可逆性，為采用控制飲食及其他環境手段干預心血管疾病的進程提供了新的方法 DNA甲基化與精神疾病1972年Gottesman就將外遺傳這一概念引入精神病遺傳學研究。近些年當傳統遺傳研究在精神疾病的研究中困難重重時，外遺傳與精神疾病尤其是DNA甲基化與精神分裂癥的關系，引起了研究者的重視。雖然目前還處于假說階段，但不少研究已提示DNA甲基化參與了精神分裂癥的發生。二組蛋白修飾、染色質重塑與疾病染色質重塑復合物、組蛋白修飾酶的突變均與轉錄調控、DNA甲基化、DNA重組、細胞周期、DNA復制和修復的異常相關，這些異常可以引起生長發育畸形，智力發育遲緩，甚至導致癌癥。三 基因組印記與疾病基因組印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時發生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。四 。X染色體失活與疾病女性有兩條X染色體，男性只有一條X染色體，為保持平衡，女性一條X染色體被永久失活“劑量補償”效應。 X染色體隨機失活是X失活中心(X inactivation center, Xic)調控的。 X染色體失活相關疾病多是由X染色體不對稱失活使攜帶有突變等位基因的X染色體在多數細胞中具有活性所致。五非編碼RNA與疾病ncRNA對細胞自身穩定和發育起著重要作用，而它們在腫瘤發生過程中的作用機制正在逐漸被認識。其中miRNA能夠調控那些與發育、增殖、凋亡及應激反應相關基因的表達，而且它們的表達異常是人類惡性腫瘤的一個共同特征。第四節 表觀遺傳學研究技術人們對于表觀遺傳過程的關注程度日益增強，以DNA甲基化和組蛋白修飾為靶向的治療方法也初露端倪；在表觀遺傳修飾分析技術發展的基礎之上，我們可以進一步了解表觀遺傳過程的機制并設計出針對這一過程的治療性干預手段。.DNA甲基化的檢測 基因組整體水平的甲基化分析A高效液相色譜柱相關方法 B.SssI甲基轉移酶法 C.氯乙醛法 基因特異位點的甲基化分析A甲基化敏感性限制性內切酶-PCR/Southern法 B直接測序法 C甲基化特異性的PCR法 D甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法E結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法F甲基化敏感性單鏈構象分析G甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳H甲基化敏感性解鏈曲線分析IMethylight JDNA微陣列法 K.甲基化敏感性斑點分析 L. MS-MLPA 新甲基化位點的篩查A限制性標記基因組掃描B.MBD柱層法C.COMPARE-第三章 人類基因組學一.Human genome Projecto 1986年Dulbecco提出腫瘤問題有待人類基因組測序o 1991年人類基因組測序啟動15年、30 億美元 、3109 堿基對生物醫學領域的阿波羅登月計劃，遺傳學革命o 2001年2月完成人類基因組94草圖o 2004年10月人類基因組完成測序，覆蓋了99的常染色質區域，錯誤率小于1/10 萬二.人類基因組的結構特征：o 2萬2.5 萬個編碼基因，不到線蟲和果蠅的兩倍o 許多特征在基因組上分布不均一：基因、轉座子、GC含量、CpG 島和重組率等o 大部分轉座子活性明顯下降，但是長散在核元件（LI