細胞培養技術進階 1 細胞培養技術 1 細胞原代培養2 細胞生長狀況的觀察3 細胞傳代4 細胞凍存 復蘇和運輸5 細胞活力檢測6 細胞周期檢測7 細胞凋亡檢測8 細胞凋亡的流式分析 2 1 細胞原代培養 原代培養也叫初代培養 是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養 1 取材2 漂洗3 剪切4 消化5 過濾6 清洗7 計數8 接種 3 2 細胞生長狀況的觀察 培養細胞生長狀況常規檢查 1 培養液 顏色與透明度的變化2 細胞生長狀況 3 細胞形態變化 4 微生物污染 4 1 培養液PH值 顏色變化 變黃 表示PH值下降 細胞生長旺盛 代謝產生的酸性物不斷積累導致 變紅或紫紅色 表示PH值上升 細胞生長停滯 死亡 一般生長穩定的細胞需要2 3天換液1次 生長慢的細胞需要3 4天換液一次 原代細胞換液通常每周兩次 每次換半量或1 5 1 3量 原代細胞第1次換液時 切記不要把培養液全部倒掉 5 2 細胞系 株 換液 條件合適時生長迅速 過夜就變黃 可進行全量換液 這種情況下 最好減少細胞接種數 延長換液的時間 方法 6 2 細胞形態變化 生長良好細胞 透明度大 折光性強 輪廓不清 生長狀態不良時 細胞折光性變弱 輪廓增強 胞質中常出現空泡 脂滴 顆粒樣物質 細胞之間空隙加大 7 3 微生物污染 培養液顏色與透明度 培養液混濁 液體內漂菌絲或細胞菌 支原體污染 沒有明顯癥狀 但細胞生長卻明顯變緩 8 細胞培養的污染和檢測 細胞污染的種類細菌 酵母菌 霉菌和病毒污染源無菌操作技術不當操作室環境不佳污染之血清污染之細胞 9 細菌培養液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了 洋蔥佰克霍爾德菌 Burkholderiacepacia 原屬假單胞菌屬 是植物病原菌 10 白色念珠菌污染 11 真菌感染 12 支原體污染電鏡照片 煎蛋狀和其他形狀 13 3 細胞傳代 貼壁細胞 1 吸光培養瓶中的培養液2 加入0 5 2ml0 25 的胰蛋白酶液 以消化液能覆蓋整個瓶底為準 然后兩種方式處理 一種30S后 吸去消化液 剩余的酶液繼續作用 后在相差顯微鏡下觀察 第二種 不吸去消化液 靜置2 10min 顯微鏡下動態監測 在倒置鏡下觀察被消化的細胞 如果胞質回縮 細胞變圓 相互之間不再連接成片 3 吸去胰蛋白酶液 加入含血清的培養液 14 4 用吸管吸取瓶內培養液 反復吹打瓶壁細胞 形成細胞懸液 按順序 然后離心沉淀細胞 5 吸取1 2 5細胞懸液 接種于新的培養瓶內 6 加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶內 7 將后者放入培養箱中培養 15 4 細胞凍存 復蘇和運輸 16 凍存和復蘇的原則 慢凍快融 當細胞冷到零度以下 可以產生以下變化 細胞器脫水 細胞中可溶性物質濃度升高 并在細胞內形成冰晶 如果緩慢冷凍 可使細胞逐步脫水 細胞內不致產生大的冰晶 相反 結晶就大 大結晶會造成細胞膜 綱胞器的損傷和破裂 復蘇過程應快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重結晶 17 低溫保護劑的應用 常用的低溫保護劑是DMSO 它是一種滲透性保護劑 可迅速透入細胞 提高胞膜對水的通透性 降低冰點 延緩凍結過程 能使細胞內水分在凍結前透出細胞外 在胞外形成冰晶 減少胞內冰晶 從而減少冰晶對細胞的損傷 18 細胞凍存方法 1 預先配制凍存液 含20 血清培養基10 DMSO2 取對數生長期細胞 經胰酶消化后 加入適量凍存液 用吸管吹打制成細胞懸液 1 106 5 106細胞 ml 3 加入1ml細胞于凍存管中 密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期 19 冷凍保存要點 冷凍過程要緩慢 4 30 60分鐘 20 30分鐘 80 16 18小時 或過夜 液氮長期保存凍存細胞必須處在對數生長期 活力大于90 無微生物污染 細胞濃度控制在 1 107 5 107 ml 20 細胞復蘇方法 l 從液氮中取出冷凍管 迅速投入37 38 水浴中 使其融化 1分鐘左右 2 5分鐘內用培養液稀釋至原體積的5 10倍以上 3 低速離心10分鐘 4 去上清 加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞 21 細胞運輸 1 長距離運輸 幾天 選擇生長良好細胞 換細胞液 補充新培養液至瓶頸部 保留微量空氣 擰緊瓶蓋 瓶子口用膠密封 并用棉花包 放在攜帶者貼身口袋帶回 或用包裝盒空運 2 短距離運輸 幾小時 去掉大部分生長液 僅留少量液體覆蓋單層細胞 防止細胞干燥 將細胞附著面朝上帶回 3 液氮凍存運輸 22 5 細胞活力檢測 在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞 總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力 應用 由組織中分離細胞復蘇后的細胞藥物篩選方法 細胞計數 臺盼蘭染色MTT法 23 1 細胞計數 將血球計數板及蓋片用擦試干凈 并將蓋片蓋在計數板上 將細胞懸液吸出少許 滴加在蓋片邊緣 使懸液充滿蓋片和計數板之間 靜置3分鐘 鏡下觀察計數 24 細胞濃度的計算 Volume 體積 長x寬x深度 1mmx1mmx0 1mm 0 1mm3 1x10 4cm3 ml 細胞密度 個 mL 4個大方格的細胞總數 4 10 4 4個大方格的細胞總數 4 104 25 2 臺盼蘭排斥染色 原理 死細胞能被臺盼蘭染上色 鏡下可見蘭色的細胞 活細胞不被染色 呈透明狀 步驟 制備單細胞懸液 并適當稀釋 105 ml 9滴細胞懸液 1滴0 4 臺盼蘭染液 混勻染色 吸取少許懸液涂于計數板上 3分鐘內計數活細胞和死細胞 26 細胞數 ml 4大格細胞數之和 4 104 稀釋倍數細胞活力 未著色細胞數 總細胞數 100 27 3 四唑鹽 MTT 比色法 四唑鹽 MTT 噻唑藍原理 活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物 并沉淀在細胞中 而死細胞沒有這種功能 二甲亞砜 DMSO 能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物 溶液顏色深淺與活細胞數成正比 優點 簡單快速 靈敏 經濟應用 新藥篩選 細胞毒牲試驗 腫瘤放射敏感性實驗等 28 操作流程 細胞接種96孔板 200ul 103 104 孔 貼壁后加處理因素 加入MTT20ul 5mg ml 培養4h 酶標儀檢測0D值 波長490nm 吸出培養液 加入DMSO150ul 搖床震蕩10min 29 注意事項 選擇適當的細胞接種濃度 保證細胞培養結束時濃度不至于過滿種板技術 均勻實驗時應設置調零孔 溶媒孔 加藥孔 調零孔 培養基 MTT DMSO 無細胞 溶媒孔 培養液 MTT DMSO 細胞 溶酶加藥孔 培養液 MTT DMSO 細胞 不同濃度的藥物 一般5 7個梯度 設3 5個復孔 避免血清干擾 一般選小于10 胎牛血清的培養液進行 邊緣效應 周邊孔加入PBS 30 6 細胞周期檢測 流式細胞術PI染色 細胞周期 細胞每一次分裂增殖的周期 31 流式細胞術PI染色檢測細胞周期 原理 碘化丙錠 PI 可與細胞內DNA和RNA結合 采用RNA酶將RNA消化后 通過流式細胞術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少 通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時 可以區分細胞周期各時相 G1 G0期具有二倍體細胞的DNA含量G2 M期具有四倍體細胞的DNA含量 4N S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間應用 通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數 可檢測細胞的增殖周期 32 增加膜通透性 消化RNA 33 7 細胞凋亡的檢測 凋亡形態學特征 細胞體積變小 胞質濃縮 胞膜結構完整 有泡狀突起 核染色質濃縮 聚集核膜周圍 細胞膜內陷形成凋亡小體 Apoptoticbodies 無內容物外溢 因而不引起周圍的炎癥反應 34 形態學鑒定 35 細胞膜結構改變分析 胞膜通透性增加 改變細胞對一些核染料物質 DAPI Hoechst PI 的通透性 利用著色結果的差異區別檢測壞死和凋亡細胞膜內側磷脂酰絲氨酸 PS 外翻到膜表面 AnnexinV法常用方法有 DAPI Hoechst PI單染 Heochst PI雙染 Annexin V PI雙染等 36 DAPI DAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料 與DNA的結合是非嵌入式的 主要結合在DNA的A T堿基區 37 Hoechst染色 Hoechst為膜通透性核酸染料 DNA結合型熒光染料 可以嵌合到堿基分子能進入正常細胞 凋亡細胞的胞核會呈致密濃染 或呈碎塊狀致密濃染 凋亡細胞 38 PI PropidiumIodide 碘化丙啶 是一種常用的細胞核熒光染色劑 它不能透過完整的細胞膜 但在凋亡中晚期的細胞和死細胞 PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅將Annexin V Heochst與PI匹配使用 就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來 39 Heochst PI雙染 凋亡細胞膜通透性增高 Hoechst熒光 藍色 強度增高PI不能進入細胞膜完整的活細胞中 正常細胞和凋亡細胞拒染 壞死細胞由于失去膜完整性可染 紅色 40 磷脂酰絲氨酸外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 在細胞凋亡的早期可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面Annexin V是一種Ca2依賴性磷脂結合蛋白 能與PS高親和力特異性結合 將Annexin V進行熒光素 FITC 或biotin標記 利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生 41 AnnexinV PI雙染色法 42 8 細胞凋亡的流式分析 43 利用流式細胞儀對處在快速 直線 流動狀態中的單細胞進行多參數 快速定量分析 同時對特定群體加以分選的現代細胞分析技術 流式細胞術 FlowCytometry FCM 44 45 流式細胞儀工作原理 經熒光染色的細胞從噴嘴中高速噴出 通過一個聚焦的光源進而通過各種光敏元件測量這些細胞發射的散射光和熒光 經計算機處理得到多種信息參數 46 47 信號檢測 散射光 前散射光 FSC 與細胞的大小有關側散射光 SSC 反映細胞內的顆粒多少 48 信號檢測 熒光信號 X軸 代表熒光信號或散射光信號的強度 用 通道數 表示 與光強度之間線性關系或對數關系Y軸 代表該通道內所出現具有相同光信號特征性細胞的頻率 49 流式細胞儀檢測細胞凋亡常用的三種方法 一 PI單染色法 二 Heochst33342 PI雙染色法 三 AnnexinV PI雙染色法 50 PI單染色法 51 Heochst33342 PI雙染色法 凋亡細胞膜通透性增高 Hoechst33342熒光 藍色 強度增高PI不能進入細胞膜完整的活細胞中 正常細胞和凋亡細胞拒染 壞死細胞由于膜完整性可染 紅色 52 區別正常細胞 凋亡細胞和壞死細胞 正常細胞 低藍光 低紅光凋亡細胞 高藍光 低紅光壞死細胞 高藍光 高紅光 53 AnnexinV PI雙染色法 54 AnnexinV PI雙染色法 左下象限 活細胞 為 FITC PI 右上象限 壞死細胞 FITC PI 右下象限 凋亡細胞 FITC PI 55 細胞培養常見問題解答 56 3 為何培養基保存于4 C冰箱中 顏色會偏暗紅色 且pH值會越來越偏堿性 培養基保存于4 C冰箱中 培養基內之CO2會逐漸溢出 造成培養基越來越偏堿性 而培養基中之酸堿指示劑 通常為phenolred 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅 培養基偏堿之結果 將造成細胞生長停滯或死亡 若培養基偏堿時 可以通入無菌過濾之CO2 以調整pH值 57 4 培養細胞生長減慢可能原因 由于更換不同培養液或血清比較新培養液與原培養液成分 比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗增加起始培養細胞濃度培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞讓細胞逐漸適應新培養液 換入新鮮配制培養液 補加谷氨酰胺或生長因子 58 培養物中有少量細菌或真菌污染用無抗生素培養液培養 如發現污染 丟棄培養物 或用抗生素除菌 試劑保存不當血清需保存在 5 到 20 培養液需在2 8 避光保存 含血清完全培養液在2 8 保存 并在2周內用完 59 5 培養細胞不貼壁 胰蛋白酶消化過度縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度支原體污染分離培養物 檢測支原體 清潔支架和培養箱 如發現支原體污染 丟棄培養物培養液中無貼壁因子 60 6 欲將一般動物細胞離心下來 其離心速率應為多少轉速 欲回收動物細胞 其離心速率一般為300 xg 約1 000rpm 5 10分鐘 過高之轉速 將造成細胞死亡 61 7 培養液pH值變化太快 CO2張力不對按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度 2 0g L到3 7g L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5 到10 改用不依賴CO2培養液培養瓶蓋擰得太緊松開瓶蓋1 4圈NaHCO3緩沖系統緩沖力不足加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度 62 培養液中鹽濃度不正確在CO2培養環境中改用基于Earle s鹽制的培養液 在大氣培養環境中培養改用Hanks鹽配制的培養液細菌 酵母或真菌污染丟棄培養物或用抗生素除菌 63 8 培養液出現沉淀 但p