免疫細胞（組織）化學技術 病理教研室 金曉明,主要講述內容： 第一部分 免疫細胞化學的理論基礎 第二部分 免疫熒光細胞化學技術 第三部分 免疫酶細胞化學技術 第四部分 免疫電子顯微鏡技術,第一部分 免疫細胞化學的理論基礎 免疫細胞化學是免疫學與細胞化學相結合的一個分支學科，以免疫學的抗原抗體反應為其理論基礎。,第一節 抗原（antigen） 一、抗原的概念 是一類在合適的條件下，能激發機體免疫系統發生免疫應答，并能與免疫應答產生的效應物質在體內和/或體外發生特異性結合反應的物質。 抗原的性能：免疫原性 產生免疫應答 反應原性 產生特異性反應,二、抗原決定簇 是與相應抗體或淋巴細胞抗原識別受體相結合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學基團。 類型：功能性抗原決定簇 隱蔽性抗原決定簇 免疫優勢決定簇 線性或連續性決定簇 構象決定簇或不連續性決定簇 B 細胞所識別的是半抗原決定簇；T細胞所識別的是免疫原性決定簇或連續性決定簇。,三、抗原的性質與種類 （一）抗原的性質 1、抗原的異物性 機體能對進入體內的異種、異體的大分子物質產生免疫應答。該物質與機體的種系關系愈遠，其免疫原性愈強，機體的免疫反應也更強。 自身抗原；自身抗體 2、大分子膠體 作為抗原，分子愈大，其免疫原性愈強 3、抗原的特異性 各種抗原物質各有其特異的抗原決定簇，即一種抗體只能與相應的抗原起反應而不能與其它抗原反應。,（二）抗原的種類方法 分類依據 種類 單獨存在時是否有免疫原性 半抗原和完全抗原 抗原來源 外源性抗原和內源性抗原 抗原與宿主關系 異種抗原，同種異體抗原，自身抗原 B細胞產生抗體時是否需要T細胞輔助 胸腺依賴抗原，胸腺非依賴抗原 化學物質 蛋白質，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等 物理狀態 顆粒性抗原，可溶性抗原 產生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原 抗原特異性程度 特異性抗原，共同抗原,完全抗原：同時具有免疫原性和反應原性的物質。 不完全抗原或半抗原：無免疫原性。,第二節 抗體（antibody） 一、抗體的概念 機體受到抗原刺激后，通過體液免疫應答，B淋巴細胞活化、增殖、分化為漿細胞，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發生特異性反應的球蛋白。 二、抗體的性質和種類 （一）抗體的一般性質 免疫球蛋白約等于抗體，分五類：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,（二）免疫原性和分類特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白質，具有免疫原性，課作為抗原。由于存在著輕鏈和重鏈，可變區和穩定區，因此，分子結構差異較大，免疫原性比較復雜。 （三）抗體的種類 1、根據抗體的途徑或來源不同分為 免疫抗體；天然抗體；自身抗體 2、根據抗原抗體在試管內是否出現肉眼反應分為 完全抗體；不完全抗體,三、抗原與抗體反應 稱為免疫學反應。 在體內進行稱為免疫反應；在體外稱為血清學反應 四、抗體形成的機制 （一）免疫應答的產生 1、感應階段（識別及加工處理抗原階段） 2、反應階段（淋巴細胞增殖分化階段） 3、效應階段（發生免疫反應階段） （二）影響抗體產生的因素 1、抗原的質和量 2、機體方面 3、佐劑的增強免疫作用,第三節 有關基本技術方法 一、抗體的制備 （一）抗體的制備方法 能制備出具有很高特異性和敏感性的高效價多克隆和單克隆抗體。,1.多克隆抗體（血清抗體：指機體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。 2.單克隆抗體：是1975年由Kohlenh Milstein發明的一種新技術。其原理是將體外培養的骨髓細胞和免疫的脾細胞相融合，產生雜交細胞。這種融合的雜交細胞既有骨髓細胞的無限生長能力，又有漿細胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細胞純化，成為單克隆系，就能產生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb),單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類抗體的混合物 單一種類的抗體 特異性 低 高 針對多個抗原決定族 針對單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應 高 低,（二）抗體的配制方法 1、抗體貯存 2、抗體使用液的配制,二、組織材料的處理 盡量保存好抗原性不丟失、不擴散、不被破壞 三、免疫染色 1、增強特異性染色方法 蛋白酶消化法；合適的抗體稀釋度；溫育時間 2、減少或消除非特異性染色方法 3、顯色反應的控制 4、復染,四、對照 陽性對照；陰性對照 五、結果的判斷 （一）陽性細胞的染色特性 1、分胞漿、細胞核、細胞膜表面陽性 2、灶狀和彌漫性 3、非特異性的認知 4、切片質量不佳出現的陽性要排除 （二）染色失敗的幾種原因,第二部分 免疫熒光細胞化學技術 Coons等（1941）通過熒光標記抗體，并借助于熒光顯微鏡觀察熒光的發光物質，而建立的該項技術。 近年來，與激光技術、電子計算機、掃描電鏡等技術的結合發展為定量免疫熒光技術。加之熒光激活細胞分類器的應用和激光共聚焦顯微鏡的問世，開創了免疫熒光技術的新領域。,第一節 原理 一、基本原理 免疫熒光技術也是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。 二、熒光產生的原理 分子都含有電子，電子載不斷的運動著。 一般情況下，電子總是處于能量最低的能級（即基態） 在一定的條例下，電子可吸收能量躍遷到較高的能量級（即激發態），這個過程叫激發。,二、熒光素 1、熒光色素 能夠產生熒光并能作為染料的化合物稱為。 特性：必須具備吸收激發光的光能并發射熒光；具有吸收 一定頻率光能的生色團和能產生一定光亮子的熒光 團。,2、用于標記抗體的熒光素必須具備以下條件： 1）應具有與蛋白質分子形成共價鍵的化學基因，結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物容易排除。 2）熒光效率高，與蛋白質結合熒光效率下降不多。 3）結合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響。 4）與蛋白質結合的方法簡便而快速。 5）熒光素容易溶解，溶解后不會與其它物質發生化學反應。 6）熒光顏色與背景組織的自發熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。,3、熒光素的類型 1）異硫氰酸熒光素（fluorescien isothocyanate, FITC) 2）四甲基異硫氰酸羅達明（tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC) 3）四乙基羅達明（tetraethyl rhodamine, RB200) 4）其它,三、免疫熒光染色方法 1、直接法：用已知特異性抗體與熒光素結合，制成特異 性熒光抗體，直接用于細胞和組織抗原的檢查。 優點：特異性高 缺點：一種熒光 抗體只能 檢測一種 抗原。,2、間接法：用特異性的抗體（1抗）與細胞或組織標本反應，隨后用緩沖液洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（2抗）與結合再抗原上的抗體結合，形成抗原 抗體 熒光抗體的復合物。 優點：熒光亮度增強， 提高了敏感度,四、非特異性染色的消除方法 1、非特異性染色的主要因素 1）部分熒光素未與蛋白質結合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。 2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結合。 3）組織內類屬抗原的存在。 4）從組織中難以提純抗原性物質。 5）抗體分子上標記的熒光素太多。 6）熒光素不純，標本固定不當。 7）細胞和組織內某些物質自發熒光。 8）染色時間過長，溫度過高，沖洗不夠或標本干燥。,2、消除的方法 1）襯染法（可抑制自發熒光） 2）胰蛋白酶消化（可抑制非特異性熒光） 3）吸收（用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色） 4）用正常（非免疫）血清（清除自發熒光和非特異性熒光） 5）提高抗體和熒光抗體的質量,五、熒光顯微鏡及檢測方法 略 六、染色標本的保存 原則上應立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，此時熒光最強。 用緩沖甘油封片，保存在4中，過夜后特異性熒光強度減弱25，保存1周后減弱60。,Nikon 熒光顯微鏡,腎活檢（直接法）,腎活檢（直接法）,腎活檢（直接法） 低倍視野,腎活檢（直接法），表達弱,腎活檢（直接法）,腎活檢（直接法）,左圖：表達在細胞核（FITC）,右圖：表達在胞膜,左圖：DAPI 染色（染核）,右圖：,胃粘膜上皮細胞，胞漿胞膜陽性,血管內彈力膜陽性,胃腺癌,第三部分 免疫酶細胞化學技術 免疫酶細胞化學技術是免疫組織化學中最常見的方法之一，它是在抗原抗體特異性反應存在的前提條件下，借助于酶學細胞化學手段，檢測某種物質（抗原/抗體）組織細胞內存在部位的一門新技術。,第一節 免疫組織化學的基本技術 一、取材 1.實驗動物 麻醉 （處死），鋒利刀片切成大小適中，厚度3mm4mm。 小型實驗動物：灌注（流）固定后取材 （生理鹽水和4多聚甲醛） 2.人體材料 活檢組織、手術標本、細胞和組織,二、固定 原則是保持組織形態良好和被檢測抗原的前提下，應采用 濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為112h。 1.常用的固定劑 （1）甲醛緩沖液 廣泛應用于病理標本的固定，甲醛在很好地保護組織形態結構完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯作用會影響被固定細胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時間不直超過24h。,（2）4多聚甲醛磷酸緩沖液 廣泛應用于光鏡細胞化學研究。 （3）戊二醛多聚甲醛緩沖液 適用于光鏡、電鏡免疫組織化學研究。 （4）其它 如PLP液（過碘酸賴AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 類、鋨酸等。,2.固定注意事項 （1）固定液的選擇標準：A. 組織形態結構保存良好。 B. 最大限度保存抗原的抗原性。 （2）組織塊的大?。?.5cm1.5cm0.5cm為宜。 （3）固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。 （4）溫度：一般在室溫下進行，電鏡標本和固定時間較長時 可放置在4冰箱。 （5）固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。,三、包埋 1.石蠟包埋 2.冷凍包埋 3.環氧樹脂包理 四、切片 1.載玻片的處理 （1）清洗 （2）涂膠（防止脫片）。常用粘附劑： 明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠。樹脂膠：也稱白膠。 多聚賴氨酸（PLL）。商品化粘附劑。,2.切片類型 （l）石蠟切片 厚約3 5m，放置37溫箱烘烤過夜，以減少脫片。 （2）冷凍切片：2m。 （3）振動切片：特點是組織經固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。神經組織應用較多。,第二節 免疫組化染色過程中基本技術 一、蛋白酶消化技術 進行固定時，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限度地結合增強特異性染色。 1.常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶 2.消化時間 因組織而異，一般為530min，消化時間不宜太長，以免損傷組織形態，破壞抗原決定族。消化結束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。,3.非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應所出現的染色。 （1）原因分析 組織方面：主要有組織的自發熒光、內源性過氧化物酶或堿 性磷酸酶、內源性生物素等. 試劑方面：因抗體不純、標記的酶和熒光不純或標記過量等。 （2）消除方法 加1抗前加正常血清1030min，以封閉組織中帶電荷的基因，避免與1抗的非特異性結合。,減少非特異性染色： a.免疫酶組化染色時，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液將組織切片處理30min（3%的H2O2甲醇溶液處理510min）。 b.免疫熒光染色時，可用0.010.05伊文思藍稀釋熒光抗體。 二、對照 陽性對照片：用已知抗原為陽性的標本作對照 陰性對照片：確認不含己知抗原的標本作對照,三、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存 1.抗體的分裝 不能用完的抗體分裝在小的EP管內，保存在-20-40的低溫冰箱中持用可保持數年有效。 2.抗體稀釋 常用0.01MPBS（磷酸緩沖溶液）或BSA（牛血清白蛋白） 3.滴加 滴加抗體要充分覆蓋組織切片，一般加 3050L,最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈,以防溶液的擴散。 4.保存 未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未用完的抗體最好在一周內用完，不宜長期保存。,四、免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術 1.免疫酶染色原理 用酶作為標記物，可分為直接法、間接法、補體法、免 疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法 （PAP法）和雙PAP法等。 （1）直接法原理：用酶直接標記在特異性1抗上，與標本中的 抗原結合，讓酶催化底物反應產生有色產物，沉淀在抗 原抗體反應部位，即可在鏡下對標本的抗原進行檢測。 優點：簡便、快速、特異性強；缺點：敏感性差。,（2）間接法原理：先用標記的特異性1抗與標本中相應抗原結合，再用酶標記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然后再加 酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復合物存在的部 位，以對抗原進行檢測。 如：1抗是由兔產生的多克隆抗體,則2抗常用羊抗兔IgG； 1抗是由鼠產生的單克隆抗體,則2抗常用羊或馬抗鼠IgG。 以上兩種方法稱為酶標抗體法 （3）非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產生抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結合進行標記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。 常用的有PAP、sABC、LsAB法（附圖表說明）,（酶標識特異抗體,（酶標識二次抗體,生物素,HRP,ALP,2.常用的酶種類 底物 沉淀顏色 HRP A.3,3氨基聯苯胺DABH2O2 深褐色 B.5氨基水楊酸 H2O2 棕色 ALP A.苯酚磷酸鹽重氮鹽紅色 B.P校際酚磷酸鹽黃色 酸性磷酸酶 Gomoui液 葡萄糖氧化酶 D葡萄糖MTT酚嗪磷酸 甲酯化合物 藍色,第三節 免疫組化的實際操作 1.實驗準備（必須器材） （1）實驗臺：光線充足，方便操作。 （2）濕潤盒：放置抗原抗體反應過程中反應，避免干燥。 （3）微量移液器：120l,20200l,1001000l。 （4）其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。 2.試劑藥品 （1）緩沖液：PBS,0.01 M磷酸緩沖液（pH7.2） TBS,0.05 M Tris鹽酸緩沖液（pH7.6） （2）抗體稀釋液: 1BSA或0.01 MPBS （3）102抗免疫動物的正常血清 （4）DBAH2O2顯色液 （5）核復染液：蘇木素或甲基綠,3.sABC法的操作過程 基本原理：sABC（strepto-avidin-biotin peroxidase complex）鏈球菌抗生物素（卵白蛋）生物素過氧化物酶復合物 生物素(biotin):是一種分子量為244da的小分子的維生素。 抗生物素(avidin):是一種糖蛋白，分子量為68KDa。 生物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結合就很難解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結合的能力。所以生物素-抗生物素系統具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優點。 附基本操作步驟,第四節 注意事項及結果判定 要想得到理想的結果，組織細胞形態的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復及顯色等各程序的操作不當均可導致不滿意結果的產生。,1. 取材固定 標本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要新 鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。 2. 切片 切片不宜過厚，一般4m左右。切片不宜過大，載玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放37溫箱保存。,3.脫蠟 脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯 5min3。 4.蛋白酶消化 由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應前常用蛋白酶處理組織切片（根據1抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織通透性增高，使抗體充分結合抗原，增強特異性染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。 5.抗原修復 一般在檸檬酸鈉抗原修復液內，微波爐，8595，10min左右。,6.抗體的選擇 選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，由此來選擇2抗；還有抗體的稀度（在實驗前根據預實驗選擇最佳濃度。 7.特異性的確定 陰性對照（不加1抗，用PBS或TBS代替） 陽性對照（已知確定陽性的組織）或買陽性對照片 顯色：注意H2O2的濃度，必須在顯示前加入H2O2均勻攪拌，最佳顯色時間在35min，過短或過長都不會出現滿意的效果。,9.復染 一般用蘇木素30s1min，過長復染將掩蓋免疫組化的染色效果。 10.結果判定 判斷是否陽性或陰性，要排除假陽性或假陰性結果。也要學會判斷特異性染色和非特異性染色。呈色深淺可反映抗原存在的數量，可作為定性、定位和定量的依據。 有關陽性結果的定量判斷，常規的方法是根據呈色深淺和陽性細胞數量分類計算，以（-）,+,+,+等分級和計數統計。 以下用圖片說明,胃癌淋巴結轉移 cerbB-2癌基因表達 sABC法,胃癌，P53抑癌基因表達， sABC法,胃癌CerbB-2的表達， sABC法,胃癌cerbB-2的淋巴管侵襲， sABC法,胃淋巴組織反應性增生，CD20/CD43檢測 sABC法,胃組織中的反應性增生的淋巴組織，CD43表達， sABC法,IgAN，TGFs2表達，主要在近曲腎小管內， sABC法,IgAN, TGFs2的表達，sABC法,IgAN，bFGF的表達， sABC法,IgAN, PDGF的表達， sABC法,骨骼肌營養不良，myosin蛋白表達， sABC法,第五節 免疫組織化學在病理診斷中的應用范圍 1.腫瘤診斷 未分化惡性腫瘤性質判定；圓形、梭形、多形性腫瘤細 胞鑒別；轉移腫瘤的原發部位的確定。 2.淋巴瘤的診斷 鑒定反應性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。 3.內分泌腫瘤的診斷（檢測腫瘤分泌的激素) 4.軟組織腫瘤；神經系統腫瘤,5.小活檢組織病理檢查（能明確顯示瘤細胞存在與否) 6.微小癌、微小轉移灶（淋巴結和骨髓) 7.細針穿刺（細胞學診斷) 8.部分腫瘤來源分類 9.乳腺癌激素受體檢測（ER，PR) 10.腫瘤基因產物（p53,cerb-B2,ALK,CDs) 11.增殖細胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預后 12.病因診斷（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等),第六節 免疫組織化學在病理診斷中存在的不足 1.與分子生物學等技術相比，范圍有限 2.并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因常無相應的抗體 3.相當多的腫瘤缺乏特異性抗原的表達，同一種抗體，常 ?？杀磉_多種腫瘤 4.免疫組織化學標準化問題,第四部分 免疫電子顯微鏡技術 一、免疫電鏡技術(immunoelection microscopy) 是利用抗原和抗體特異性結合的原理，在超微結構水平定位、定性及半定量顯示抗原的技術方法。從細胞超微結構水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應，必須使抗體帶上具有高電子密度的標記物，這樣才能在電鏡下觀察反應分結果。 到目前為止，已有三種標記技術： (1)鐵蛋白標記技術 (2)酶標記技術 (3)膠體金標記技術,二、免疫金標記技術（immunogold staining technique) 用膠體狀態的金顆粒，作為抗體的標記物，制成免疫膠體金來研究抗原抗體的反應。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結構的觀察。 根據抗體特異性結合的原理，在亞細胞水平定性定位。對抗體加以標記，形成高電子密度區，在電鏡下觀察反應過程。在對細胞內抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標記同一細胞內不同的抗原。進行多重標記。,三、免疫電鏡的基本技術方法 1.標本的處理 (1)取材:各種培養細胞和分離的血細胞應隨用隨取；游離的培 養細胞可先進行離心；貼壁細胞可在載玻片上固定， 也可用胰蛋白酶將細胞消化下來；取組織塊時應做到 越快越好，最好在沒有停止血流前取材。,（2）固定 固定液的選擇： 既要保存細胞的超微結構，又要盡可能的保存抗原的活性。 A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液（PG固定液） B.過碘酸鹽賴氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPG固定液) 固定方法與時間： A.血管灌注固定（最好方法） B.浸泡固定 C.微波固定,2.基本技術方法 （1）包埋前免疫電鏡技術 是指先對標本進行免疫標記，然后進行包埋、切片、觀察。 （2）包埋后免疫電鏡技術 是指組織標本經固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進行免疫化學染色方法。 詳見包埋前和包埋后電鏡技術的比較,包埋前與包埋后的比較,肝細胞內的內質網和核膜，可見G-6-P酶陽性反應產物。 (32000),肝細胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內膜基質側呈現琥珀酸脫氫酶陽性反應顆粒（36000） 。,IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法,IgAN, TGFs2的表達，免疫金銀法,K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機聯合的免疫電鏡法 （實驗結果介紹）,免疫電鏡技術是從超微結構水平能顯示抗原和抗體結合后在細胞微細結構水平的定位，這一技術已成為目前生物醫學領域的一項重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術因多種原因造成的重復性差或技術的不穩定性，加之目前電鏡包埋所采用的是環氧樹脂618或812，都需高溫聚合，這樣可使多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了Lowicryls K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機（SPI#17020），對免疫電鏡觀察的標本進行了處理，目的是更好的保存被檢測組織中抗原的活性，提高檢出率。現將一些不成熟的經驗和存在的問題進行一下總結。,一、紫外線低溫包埋機（SPI#17020）,SPI#17020是美國特殊研制的低溫包埋機，它最主要的特點是采用數字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在-10-37之間。通過溫度控制風扇可以使機內的溫度控制在某一恒定溫度，持續長達36小時，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時間。它占地面范圍小，但機內空間較大，可以同時放入72個包埋膠囊。而且機箱上方有兩個封閉起來的波長為360nm的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機中進行。 總之，紫外線低溫包埋機是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機器。,二、Lowicryls K4M 低溫包埋劑 Lowicryls K4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學物質，其特點是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關，而且Lowicryls K4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色。,三、方法 1.包埋劑的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋劑由三個部分組成：單體，交聯劑和引發劑。調整單體和交聯劑的比例，增加交聯劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （1）Lowicryls K4M：單體 17.30g；交聯劑2.70g；引發劑0.10g?？闪咳『螅⑷胱厣牟Ａ萜鞅芄?，用玻璃棒輕攪35分鐘。勿過分攪拌，以防空氣的氣泡進入包埋劑中。 （2）Lowicryls K4M的貯存：應保存在暗處室溫下，該物質有刺激性，在配制時應戴手套，以免觸及皮膚。在通風櫥內操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應立即以水沖洗局部。,2.組織和細胞的取材、固定、處理 （1）組織的取材與固定：用銳刀將新鮮組織切成13mm3的小塊, 迅速置于3%多聚甲醛- 1%戊二醛固定液中, 23h。 （2）細胞的取材與固定：將含有細胞的培養液轉移到離心管中，離心15min，使細胞聚成團塊，棄去上清夜，換上3%多聚甲醛1%戊二醛固定液固定23h。,（3）組織或細胞處理過程 將固定好的標本用0.01mol/L 磷酸緩沖液沖洗, 10min3次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封閉游離的醛基30min； 0.01mol/L 磷酸緩沖液1h；4 30%,50%乙醇脫水30min； -20乙醇系列逐級脫水至100%，各1h（乙醇溶液應先在冰箱中預冷）。-20低溫包埋劑逐級滲透 , 純包埋劑浸透過夜。標本放入含包埋劑的膠囊加蓋后放入紫外線低溫包埋機中，-20下用紫外線燈照射24h；室溫紫外線燈繼續照射34天，使樣品完全聚合固化。超薄切片厚度5070nm，展片后撈在覆有福爾馬膜的鑷網上。,3.免疫染色 免疫標記的切片用3%的H2O2 室溫下處理610min后，用0.01mmol/L PBS緩沖液沖洗10min3次。然后在1%BSA-PBS封閉也上封閉30min，甩去不洗，滴加稀釋好的一抗（如果用來自植物或微生物的蛋白做探針，標記溫度最好在25左右2060min；用來自動物的蛋白做探針時，標記溫度最好在30左右下2060min）。再次用0.01mmol/L PBS緩沖液漂洗和1%BSA-PBS封閉后用5nm膠體金IgG探針標記60min，最后經緩沖液沖洗，每次10min。陰性對照樣品在標記前省卻一抗孵育步驟。標記后的切片經醋酸鈾和檸檬酸鉛各染色10min ,用JEM-122O透射電鏡下觀察。,利用羊抗兔IgG膠體金探針對大鼠肺組織進行免疫金標記，結果顯示在大鼠的肺泡壁內毛細血管內皮細胞胞漿中可見散在分布的金顆粒。對細胞進行免疫標記，