熒光原位雜交技術,簡 介,原位雜交技術（in situ hybridization，ISH） Gall和Pardue 1969年建立。 用標記的DNA或RNA作為探針，對組織細胞內的核酸或有絲分裂中期的染色體進行原位檢測和觀察。 最初的探針大多以同位素3H、32P等標記，但因同位素標記探針對人體有放射損害、實驗周期長、放射自顯影的分辨率有限、環境污染等缺點，給研究及實際應用帶來了諸多不便。,熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization ，FISH） 利用熒光物質標記探針（直接或間接），再進行雜交，可通過熒光顯微鏡對靶序列進行定性、定位和定量分析 FISH技術的應用已經證實或發現了用經典細胞遺傳學方法無法證實或發現的腫瘤染色體改變，成為銜接細胞遺傳學和分子遺傳學之間的一座橋梁。開創了一個新的學科分子細胞遺傳學。,雜交流程,a.兩要素： 探針和靶序列 b.標記探針 直接標記和間接標記 c.變性 探針和靶序列成為單鏈 d.混合雜交 e.間接標記的探針需連接熒光基團的步驟,F I S H,熒光原位雜交特點,與其它原位雜交技術相比，FISH的優點： 經濟安全，快速方便； 敏感性高，特異性強，背景低； 宜于多靶雜交，對同一標本同時進行多個探針雜交，不同的探針可以顯示不同的熒光顏色； 使用G帶玻片可作出回顧性分析； 缺點： 不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。,基因特異探針靶向每條染色體只有一個拷貝的DNA序列。 主要用于間期或中期染色體中識別染色體易位、倒位、重復和缺失、鄰近基因綜合征、標記染色體和染色體擴增等，可檢測基因的擴增和重排。,常用探針類型 基因特異探針,常用探針類型 重復序列探針,重復序列探針的結合位點是基因組中多拷貝的短重復堿基對序列（例如著絲粒和端粒探針）所在的染色體區域。 著絲粒常常是A-T豐富區，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重復序列相對容易制備和分辨率較高（0.5Mb），這種FISH被普遍用于篩查一般的染色體非整倍體、亞端粒缺失和標記染色體。,21三體FISH,常用探針類型 WCP探針,全基因組繪畫（WCP）探針是一種復合DNA探針。除著絲粒和端粒區外，全基因組繪畫探針對全長染色體有高度親和力。這些探針最適用于識別中期染色體的基因組不平衡，尤其是在許多癌癥中觀察到的復雜染色體重排。 M-FISH用特殊選擇的窄帶濾色片連續捕獲5種熒光色素中的每一種熒光色素圖像；SKY用于熒光色素組合分析的成像設備不同：冷電荷耦合器(CCD)照相機和Fourier變換光譜法相結合，同步曝光成像。 這些技術目前在國內一些重點細胞遺傳學實驗室中開展。,WCP探針（SKY）,技術結合產前BoBS,BACs是人類DNA的長片段克隆序列，典型的150-170kbp，相對于短的DNA探針具有更好的信噪比、不受DNA質量影響、更高的覆蓋率。 將BAC DNA探針耦聯至Luminex xMAP熒光編碼的微球上，將FISH技術與Luminex技術平臺結合，BACs-on-Beads技術可以在同一個微孔內實現多個FISH探針的檢測，相對于同時進行成百上千次FISH實驗。 高通量、標本來源廣、快速、結果明確；除了檢測13，18，21，X，Y染色體拷貝數目的變化外，還可檢測9種常見的微缺失綜合征。,技術結合 FQ-PCR,來自于分子生物學技術-定量熒光聚合酶鏈反應 和FISH的結合； 對染色體13、18、21、X和Y采用熒光引物對染色體特異性高度多態性DNA短重復序列進行PCR擴增，快速診斷非整倍體；特定的基因引物可以檢測基因的缺失與擴增 檢測“有”或“無”和數目異常；位置異常無法判斷，如平衡性染色體重排。,幾種技術平臺比較,細胞遺傳學技術的比較,FISH相關項目,羊水細胞熒光原位雜交分析（包括未培養和培養） 血細胞熒光原位雜交分析 其他各類細胞熒光原位雜交分析 SRY等單基因分析 胚胎染色體病診斷（PGD）,結合技術相關檢測項目,染色體病快速產前診斷（FISH、qPCR、BoBs） 產前單基因病診斷 SNP Array 檢測 某些代謝病的產前診斷,項目意義,1.快速且準確進行檢測 較羊水染色體分析，FISH技術可以確定13、18、21、X、Y的染色體數目信息，緩解唐篩陽性患者或高齡孕婦精神負擔；緩解醫生核型分析工作壓力，能夠有針對性的對樣本進行處理。 2.彌補核型檢測失敗無報告的問題 FISH對于樣本要求比較低，對于羊水量少、羊水活細胞數目少、孕周偏大、細胞培養失敗、核型結果難以判讀等各種原因導致的核型分析失敗均可針對性的給予彌補，解決占染色體數目異常的80-90%問題。 3.FISH與羊水染色體核型分析構成較為完整的染色體異常診斷平臺，提高了產科胎兒產前診斷水平。 4.BoBs可檢測9種常見的微缺失綜合征，拓寬了檢測范圍。,工作基礎,探針 商品化探針 原位雜交儀 Luminex xMAP 液相芯片檢測平臺,工作基礎,工作人員 1）項目負責人 劉紅衛，男，婦產科實驗室技術負