循環腫瘤標志物（CTC）檢測技術在肺部小結節診斷中的最新進展,格諾生物 劉雙,Lung Cancer in Solid Tumor in China,LDCT篩查降低肺癌死亡率,NLST research team. NEJM, 2011,胸部CT篩查與過度診療的悖論,大部分非實性成分的結節為良性疾病,26.2% 自行消失,僅3% 確診為肺癌,將所有肺部結節計算在內，假陽性率為21.8%-26.6%左右,Pinsky FR, et al. Ann Intern Med, 2015,比較了兩個大型臨床研究的假陽性率 NEJM發表的NLST研究中假陽性率第一次篩查為26.6%，第二次篩查為21.8%,如何解決？,第1-3次胸部CT篩查相比，第4次行胸部CT時 I期肺癌的比例下降20%,如何解決？,PET-CT對于肺部良性結節，假陽性率約45%,Veronesi G, et al. Ann Int Med 2012,如何解決？,創傷性檢查 不良反應大 部分患者無法耐受,肺癌病理活檢局限性,成本高,術后并發癥 對于部分年老或合并基礎疾病的患者,如何解決: 能否有更敏感的腫瘤標志物來幫助診斷,液態活檢在肺癌中的應用,治療策略,事件,疑似肺癌,輔助診斷,早癌肺癌,晚期肺癌,癌癥耐藥,復發監測,治療方案選擇,耐藥機理 新藥研發,CTC的臨床應用價值,療效評估,CTC(數量） (負向富集+靶向PCR）,ctDNA (基因變異）,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,腫瘤釋放如外周血中CTCs數量的多少，可間接反應腫瘤發生發展的功能狀態,CTC：在腫瘤發生過程中，具有干細胞特征的腫瘤細胞和不具有干細胞特征的腫瘤細胞，均由原發腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統稱循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有轉移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細胞特征的DTC所形成的微轉移灶，逃避免疫識別才可能發展成為腫瘤遠處轉移2,CK+ cells,HER-2+ cells,第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生,第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細胞形成牙槽并侵襲周圍基質,什么時候可以檢測到CTC？,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,表達中等量FR的M109鼠肺癌細胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細胞 移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數量呈指數上升 在腫瘤移植的前4周內，沒有在任何組織切片中發現到存在轉移性癌癥的跡象,CTC富集技術 密度與大小 免疫磁珠（負向富集 or 陽性富集) 微流體,CTC 檢測方法,CTC檢測技術 靶向PCR 免疫熒光 普通PCR,=,+,“方法”,“收獲”,“垃圾”,蟹餌,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負向富集,優勢：回收率100% 劣勢：純度略低,幸好沒貪嘴， 我們逃了,“方法”,“收獲”,“垃圾”,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負向富集,優勢：回收率100% 劣勢：純度略低,幸好沒吃胖， 我們逃了,網 篩,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術,負向富集,靶向PCR,FR陽性靶標,肺癌細胞FR(葉酸受體）高度表達 CTC：FR=1:50萬 EMT轉化不影響FR豐度 其他血細胞不表達FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自動化,靈敏度超高，負向富集即可檢測 信號二次放大，1: 1012倍放大 無需人工經驗判讀，結果客觀準確 可實現CTC的定量,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測,格諾CytoploRare 靈敏度最高的檢測技術,特異性DNA PCR擴增-提高敏感性 FR靶向：高特異性探針 1 CTC in 6,000,000（可在600萬個背景細胞中檢測出一個CTC）,CytoploRare,敏感性 特異性 可重復性 臨床應用便捷性,CytoploRare,敏感性 特異性 可重復性 臨床應用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性,1個CTC信號放大1012倍,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 敏感性試驗：1ctc in 1,200,000白細胞,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,將不同數量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107） FR靶向PCR CTC檢測技術的回收率接近100%，且呈線性分布 檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬,將不同數量的FR陽性腫瘤細胞分別摻入3ml全血(1.2-3.0X107） 檢測靈敏度約為5.09/（1.23*107）=1/240萬600萬,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測 敏感性試驗：1ctc in 6,000,000白細胞,CytoploRare,敏感性 特異性 可重復性 臨床應用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術 FR（葉酸受體，高度特異性的靶向探針）,特異性高：加入FR靶向探針前，加入高濃度葉酸封閉細胞表面的葉酸受體，檢測結果為陰性,背景表達：去除FR靶向探針，僅保留特異性DNA片段，與保留FR靶向探針相比，檢測結果一致，提示背景可能為特異性DNA片段所致的固定值,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,2004,Cell Search: 乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗體(EpCAM)對EMT細胞特異性差，而肺癌細胞轉移入血需要EMT的過程,EpCAM陰性細胞中，存在大量CTC,Cell Research系統主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針 研究證實，EpCAM陰性的細胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,有報道，部分激活的巨噬細胞存在FR的高表達1 臨床前研究證實，這部分巨噬細胞很少在正常人的外周血中出現2 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬細胞后，CTC的檢測結果無明顯改變3,1、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術 巨噬細胞（可能存在FR表達）不影響檢測結果,CytoploRare,敏感性 特異性 可重復性 臨床應用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC檢測技術 同一患者重復檢測，可重復性高,CytoploRare,敏感性 特異性 可重復性 臨床應用便捷性,3mL血6個小時得到報告,檢測流程,肺癌領域，CTC檢測技術對比,1210例受試者,肺癌 560例,肺部良性疾病 350例,其他腫瘤 (150例) 肝癌 30例 結直腸癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例,331例A 100例B 50例C（21例D) 79例D,A: 基線CTC檢測 B：術前術后CTC監測 C：一線含鉑雙藥化療中CTC監測 D：基線CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE檢測,300例A 50例D,健康人 150例,100例A 50例D,150例A,非動態研究 肺癌 560例A 肺部良性疾病 350例A 健康人 150例A,動態監測研究 非小細胞肺癌 100例B 50例C,對比研究 肺癌 100例D 肺部良性疾病 50例D 健康人 50例D,腫瘤特異性研究 其他腫瘤 150例A,FR靶向PCR CTC檢測技術 臨床試驗設計（1210例, 全國肺癌CTC研究最大樣本量）,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,參加單位： 上海市肺科醫院 上海市胸科醫院 醫科院腫瘤醫院,42,患者特征,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,FR靶向PCR CTC檢測技術 葉酸受體陽性CTC作為肺癌診斷的標志物,43,最大樣本量CTC檢測數據 Cutoff： 8.70 CTC Units/3mL 敏感性：79.6% 特異性：88.2%,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,AUC: 0.8797,FR靶向PCR CTC檢測技術 敏感性高 I期肺癌敏感性67.2%,NSCLC患者與對照組的CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-AgROC曲線分析,不同標志物在NSCLC和I期NSCLC患者中的靈敏度,不同標志物在對照組的特異度,FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag對NSCLC和早期NSCLC患者的診斷效率,Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013,1cm肺癌總體敏感性: 62.5%,CTC聯合CT可以大大提高小結節診斷的特異性 CTC輔助CT可以將小結節的判別假陽性率降低到10%,Lou JT, Wang L, et al In submission,上海市胸科醫院：病例一,VATS右肺上葉切除術：右肺上葉細支氣管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0， 直徑0.8cm,VATS右肺上、中葉切除+系統性淋巴結清掃： 術后病理確診：右上葉腺癌（非粘液性）、細支氣管肺泡癌及肺泡樣混合亞型，高分化， T1aN0M0 腫瘤大小：0.5*0.7*0.4cm,上海市胸科醫院：病例二,FR靶向PCR-CTC檢測顯著優于一般腫瘤標志物：可幫助肺部小結節鑒別診斷,總結,LDCT篩查可降低肺癌死亡率，但也導致部分過度診療問題，手術 or 隨訪