化學工程與裝備 2012 年 第 5 期152 Chemical Engineering amp Equipment 張妙芬：茶葉中茶多酚含量測定方法的研究2012 年 5 月 分 析 測茶葉中茶多酚含量測定方法的研究試 張妙芬 （泉州市環境監測站，福建 泉州 362000） 張妙芬：茶葉中茶多酚含量測定方法的研究摘 要：茶多酚是茶葉中重要的成分，隨著茶多酚應用的開發，其分析方法也在不斷地提高和完善。該文 在查閱近年來國內外相關文獻的基礎上，對茶多酚含量的分析測定方法進行了綜述，概括介紹了用于測定 茶多酚含量的光度法、色譜法、電化學法等化學分析測定方法，以期為今后茶多酚的分析測定研究提供參 考。 關鍵詞：茶葉；茶多酚；測定方法 茶葉源于中國，傳播于世界。目前，中國茶園面積列居 可分為四類：兒茶素類、黃酮及黃酮醇類、花白素和花青素世界首位，產量居世界第二位。隨著科學技術發展，迄今已 類、酚酸類。其中含量最高的是兒茶素，占多酚類總量的在茶葉中鑒定出 450 種以上的有機成分和 15 種以上的無機 60-80，是其眾多藥效的物質基礎。茶葉中的兒茶素類又元素。 可分為三種游離型態（Catechin，C Epicatechin，EC 以1 茶多酚 ，與兩種酯化的沒食子酸 及 Epigallocatechin，EGC） 茶多酚（Tea Polyphenols）又稱茶鞣或茶單寧，占茶 （Epicatechin gallate，ECG 及 （gallic acid）葉重量的 1530，許多生理和藥理實驗表明它對人體無 ，后者（ECG 及 EGCG） Epigallocatechin gallate，EGCG）毒，無副作用，是一種天然、高效、安全的抗氧化劑，它還 含量較多。具抗衰老、抗輻射、消除口臭、降血脂、抗菌抑菌、抑酶等 茶多酚為白色晶體，易溶于水及有機溶液，味苦澀。在一系列重要作用。 pH 48 穩定，遇強堿、強酸、光照、高熱及過渡金屬均易 茶多酚是由 30 多種含酚基的物質組成，按其化學結構 變質。圖 1 為茶多酚結構通式。 OH OH OH O R1，R2 -H，-OH， C OH HO O R2 OH R1 O OH 圖1 茶多酚的結構通式2 茶多酚的測定方法 2.1.1 酒石酸亞鐵比色法 茶多酚的分析測定方法，近年來有很多報道，其中多以 茶多酚總量的測定，國內文獻報導中以酒石酸亞鐵比色分光光度法，高效液相色譜法為主。分光光度法包括紫外- 法最為常見GB/T 83132002。該法也是測定茶多酚含量的可見分光光度法、原子吸收分光光度法等，它們廣泛應用于 國標方法。茶湯中茶多酚的分析。另外，氣相色譜法、毛細管電泳法、 其測定原理是茶多酚類物質能與亞鐵離子形成紫藍色高錳酸鉀滴定法、紅外吸收光譜法等亦可用來茶多酚的分析 絡合物，該溶液對 540nm 可見光有最大吸收，故可用分光光測定。 度計測定其吸光度，通過計算確定茶水中茶多酚的含量。計2.1 分光光度法 算公式為： 張妙芬：茶葉中茶多酚含量測定方法的研究153 呈良好線性關系。 常用的分光光度法對濃度很高和很稀的溶液測定誤差 1 較大，且在測定茶多酚含量時存在吸收峰不對稱給定量帶來 式中 L1-樣液的總量（mL） 2-測定取液量（mL） 、L 、M-茶 的影響。葉質量（g） A-茶多酚的吸光度、 0-空白液的吸光度， 、 A 3.914- 目前分光光度法測定茶多酚含量的研究多集中在對顯用 10mm 比色杯，當吸光度等于 1.00 時，每毫升茶湯中含茶 色試劑的開發和測定方法改進兩個方面，如利用茶多酚分子多酚相當于 3.914mg。 結構中的鄰位酚羥基在堿性條件下可與 AlNO23 發生亞硝 此法雖可避免滴定法中因終點難以掌握而產生的誤差， 酰化絡合反應生成橙紅色五元螯合結構，在一定波長和濃度但酒石酸亞鐵與酯型兒茶素呈色較強，而非酯型兒茶素呈色 范圍內專屬性強，可定量測定7。廖曉玲8等人基于茶多酚較弱，且茶中的組成也因樣品來源不同而有所差異，試劑準 在酸性條件下能與鉬酸銨反應生成黃色鉬酸酯，此物質在備費時且消耗量大，實際應用時測定結果重現性、精密度不 341nm 處有最大吸收，用分光光度法測其吸光度，從而間接甚理想，但因其方便而為人們廣泛采用。 測定茶多酚含量。回瑞華等9采用三波長分光光度法，通過2.1.2 直接紫外分光光度法 選擇適當的測量波長有效地消除了測定茶多酚時隨混合物 直接紫外分光光度分析法的原理是基于茶多酚的不飽 濃度不同發生的本底漂移及吸收峰不對稱給定量分析造成 1和結構 ，在 320380 nm吸收帶 I和 200270 nm吸收帶 的影響。的兩個區域有深度吸收峰。 2.1.4 間接原子吸收分光光度法 6 大類茶多酚中，絕大多數如黃烷醇、花白素和茶沒食 目前文獻中用于測定茶多酚的原子吸收分光光度法，本子素，其紫外光譜中最大吸收峰分別為 205 nm 和 375 nm， 身并不能直接用于茶多酚的分析測定，主要是利用茶多酚分個別酚酸類，如綠原酸和黃烷醇的吸收光譜雖不一致，但這 子結構中的鄰酚羥基與金屬銅離子絡合而生成沉淀，通過原些物質占量極少，故在 205 nm 和 375 nm 波長處的直接紫外 子吸收分光光度法測定沉淀或上清液中剩余的金屬離子，從 2分光光度測定可以認為是多酚總量測定的有用方法 之一。 而間接地求得茶多酚的含量。2.1.3 可見分光光度法 Coomans10等人用 CuAC2 與茶多酚反應生成難溶性的 可見分光光度法的原理之一是基于茶多酚所具有的多 Cu-茶多酚化合物，經分離后，用原子吸收分光光度法測定酚羥基結構有很強的還原性，可以通過它還原一些金屬離 濾液中過量的 Cu 或將沉淀消化溶解后測定其中的 Cu，由此子，利用金屬離子與有機試劑的絡合顯色反應而間接地測定 間接地測定茶多酚，由于生成的 Cu-茶多酚化合物在水中的茶多酚的含量。 溶解度較大濃度可達 200gmL-1 以上，因此測定誤差較 Oiowah L3等發現在酸性介質中，茶多酚能將 Fe3還原 大。 2 2成 Fe ，Fe 與鐵氰化鉀溶液發生反應可產生兩種化合物： 王吉德11等人對上述方法加以改進，用甲基異丁酮和丁當高鐵溶液用量少時，生成滕氏藍 Fe3FeCN62 沉淀；當 醇的混合物溶劑萃取茶湯中的茶多酚，加入堿性 Cu3PO42高鐵溶液用量大時，生成可溶性藍色絡合物 KFeFe 懸浮液反萃取，并與茶多酚作用生成水溶性的 Cu-茶多酚化CN6，此物質在 703 nm 處有最大吸收。可用差示分光光 合物，重新轉入水相，離心沉降未作用的 Cu3PO42 后，用 -1度法測定吸收度，方法的線性范圍為 212gml ，檢測 原子吸收分光光度法測定水溶液中的 Cu，可求得茶多酚的限為 1. 35gml-1 4； 含量。但需要用有機溶劑進行萃取，操作繁瑣。 5 Amin A S 發現，茶多酚在堿性介質中及 90溫度下， 廖曉玲12等人將茶多酚與堿式乙酸鉛發生絡合反應，生反應 15 min，能還原四唑藍成為深色的甲簪formazane衍 成難溶于水的黃色沉淀，經離心后，用原子吸收分光光度法生物，據此原理提出了一種簡便、快速、準確的茶多酚測定 測定上清液中過量的鉛離子，由此間接測定茶多酚含量。此方法；TorondzhadzeG I 等人利用高錳酸鉀與茶多酚的氧化 方法準確、快速，可方便地應用于茶多酚的測定。還原反應，在 500520 nm 處測定吸光度，比較氧化作用前 2.2 色譜法后高錳酸鉀溶液的吸收值，從而間接測定茶多酚的含量。 非色譜法只能測定茶多酚的總量，色譜法常用來分離測 該方法的原理之二是茶多酚結構中的鄰酚羥基能與一 定茶湯中的茶多酚，分離后的茶成分能夠與一定的顯色劑作些金屬離子絡合而顯色。 用，然后比色定量，由于它專屬性強、靈敏度高，因此可同 6 胡冠時 等人將茶葉水浸提液用乙醇-正丁醇1:1試 時用于茶多酚的檢測和含量測定。其中有液相色譜法、氣相液稀釋約 10 倍，依次加入 NaNO3、AlNO33、KOH 多酚類物 色譜法、質譜法13等。質與三價鋁即顯示穩定的紅色，在 505 nm 處有最大吸收， 2.2.1 高效液相色譜法茶多酚含量在 32160gmL-1 濃度范圍內，吸光度和濃度 高效液相色譜法HPLC具有分離度好和準確度高的特154 張妙芬：茶葉中茶多酚含量測定方法的研究點，是目前檢測兒茶素應用最廣泛、技術最成熟的方法。 數1即為酚類物質的總量。酸性靛蘭或靛紅，由于其分子中 為使兒茶素和咖啡因的分離在合理的時間內完成，HPLC 具有不飽和結構，故可被氧化，氧化后雙鍵飽和，顏色變為法通常采用梯度洗脫，由不同比例的甲醇、水、乙腈、冰醋 黃色，所以滴定中顏色由藍變黃時即為滴定終點。但茶葉中酸、二甲基甲酰胺DMF、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮或磷 的桂皮酸的衍生物如咖啡酸中的烯鏈也可被氧化，因而滴定酸鹽緩沖液等組成流動相的 A 相和 B 相，兩相的體積分數要 值是還原性多酚類的近似值。此法雖缺乏準確性，但因其簡在考慮分離度、保留時間及基線穩定性等因素的基礎上確 便而為一些人所采用。定。由于兒茶素中存在的大量酚羥基易電離出氫離子，在流 使用高錳酸鉀滴定法測定茶多酚含量，在終點時由于茶動相中加入少量甲酸、乙酸、磷酸或三氟醋酸后，酚羥基的 湯自身的顏色易產生終點誤差21，但因方法簡便易行，所以解離受到抑制，峰形變得尖銳對稱，分離度增加，兒茶素的 被廣泛使用。響應值增大。兒茶素類化合物均有 E2 帶和 B 帶兩個吸收帶， 2.4 近紅外光譜法分別在 210nm 和 270280nm 處，各兒茶素的最大吸收波長略 近紅外光譜near infrared spectroscopy，NIRS的波有不同其中 210nm 處的檢測靈敏度較高，但梯度洗脫時，低 長范圍為 7802 526 nm，其信息主要是分子結構中的 C-H、波長處常發生基線漂移，在實際工作中可根據樣品情況確定 O-H、C-O 等基團的倍頻吸收及其伸縮振動、彎曲振動的合 14檢測波長。為縮短分析時間，有時需適當升高柱溫 。梯度 頻和差頻產生的吸收峰。在特定波長處不同樣品的吸收值差法洗脫能力強，應用廣泛，但洗脫后需用流動相沖洗色譜柱 異反映樣品中兒茶素組分含量的不同22。至平衡狀態，增加了樣品的實際分析時間。 陳華才等人23以高效液相色譜分析結果為參考值，以 唐根源15等在水-磷酸水溶液-乙腈流動相體系中加入 48 份茶多酚樣品組成定標樣品集，1 0002500 nm 的近紅外一定量 DMF 作為改良劑，用等度洗脫法在 0.5 h 內可分離、 漫反射光譜為定標波長，比較了多種方法的測定結果，表明 16測定茶多酚中 5 種兒茶素和咖啡因；XU Jun 等通過氫鍵吸 近紅外光譜結合偏最小二乘回歸可以實現茶多酚中總兒茶附色譜可從粗茶提取物中一步提純 EGCG，流動相組成為 素含量的快速定量測定。龔加順等24利用近紅外線光譜技術水乙醇乙腈57:30:13，EGCG 的純度和回收率分別為 NIRS建立了茶飲料品質成分快速定量分析的近紅外線校 -198和 73。取代的 Sepharose HP 柱經 0. 35molL NaOH 正模型。利用該模型可在 12 min 內一次性測出茶飲料的茶 17洗滌后可反復利用；胡秋芬等 用 80乙醇超聲萃取茶葉中 多酚TPP等成分的含量；此外，應用人工神經網絡方法25，的茶多酚后用 C18 固相微萃取小柱預分離除去提取液中的 選擇 7 432.36 155.7 cm-1 和 5 484.64 192.5cm-1 特征光弱極性雜質，在 WatersXterraTMRP18 1.050 mm 2. 5m 譜范圍，建立近紅外光譜人工神經網絡模型，可用于快速預微柱上，以 1 乙酸-甲醇為流動相梯度洗脫，在 3.0min 內 測茶葉中茶多酚和茶多糖的含量。完全分離茶葉中的 5 種兒茶素化合物，流動相消耗小，分析 近紅外光譜分析技術是近年來國內外發展較快的一種時間短。 新型定性、定量分析技術，具有分析速度快、樣品處理簡單、 18-20 所建立的 HPLC 方法中 ，在一定的濃度范圍內，各 無需試劑、無污染、多組分檢測等特點，已被廣泛應用于多兒茶素組分和咖啡因的色譜峰面積與其相應濃度呈良好的 種行業。線性相關，r 為 0. 9980. 999 9，最小檢測限可達 ng 級。 2.5 其它分析方法這些方法分析精度高，但是其檢測儀器價格昂貴，分析過程 還有其它的一些分析方法也可用于茶多酚的分析，例如復雜，速度較慢，無法滿足茶多酚生產和貿易過程中對產品 電化學分析方法、核磁共振法、色度分析法及流動注射分析質量快速檢測和在線成分含量監控的需要。 法等。2.2.2 氣相色譜法 電化學分析方法，主要有毛細管電泳測定法和示波電位 借助氣相色譜法使茶多酚中的物質在固定相和流動相 法。毛細管電泳測定法是指溶質以電場為推動力，在毛細管間分配，從而測定茶多酚中的物質。早先的用三甲基硅烷衍 中按淌度差異而實現的高效快速分離的新技術。這種方法操生化兒茶素后，進行氣相色譜分析可以實現多種兒茶素的同 作簡單，分離效率高，速度快。近幾年，這種方法用于茶葉時檢測，但此分析過程中存在樣品萃取、濃縮、轉溶、衍生、 中茶多酚的分離檢測日益增多，有關的文獻也不少。內標等繁瑣步驟，目前已較少應用。 流動注射分析法以其高精度、高效率及裝置簡單等優點2.3 滴定法 被人們廣泛采用。其中，有關流動注射抑制化學發光法測定 該方法的測定原理是茶多酚具有強還原性，可利用高錳 茶多酚的報道很少，最近報道廖曉玲26等人利用茶多酚還原酸鉀氧化滴定法測定茶多酚含量。 H2O2，抑制魯米諾-H2O2-KIO4 體系的化學發光，在堿性條件下， 其經典方法是樂文太爾滴定法。此法以酸性靛蘭或靛紅 其抑制程度的大小與茶多酚的含量呈線性關系的原理，建立作指示劑，用高錳酸鉀進行氧化滴定，其滴定值乘以換算指 了一種快速測定茶葉中茶多酚含量的方法。 張妙芬：茶葉中茶多酚含量測定方法的研究1553 小結 14 鄧思珊 楊 冰 彭 玲. 高效液相色譜法測定茶多酚 目前標準法中規定的茶多酚的檢測方法為酒石酸亞鐵 中兒茶素組成及咖啡因含量J. 中國預防醫學雜志比色法，不斷發展的技術與儀器也為茶葉成分的測定提供了 2000 343: 177.更多的檢測手段，比如近紅外光譜法，毛細管電泳等多種有 15 唐根源 吳紅京 吳 棱 等. 反相高效液相色譜法效方法。不斷完善的檢測技術不僅可以定性定量快速準確的 測定茶多酚中的兒茶素和咖啡因J. 色譜 2001測定茶葉中的某種成分，還可以實現對多種成分的同時測 193: 233定，可以更有效地確定茶葉的品質，推動茶葉成分檢測技術 16 Xu J Zhang G F Tan T W etal. One-step的發展。 purification ofepigallo-catechin gallate from crude green tea extracts by isocratic hydrogen 參考文獻 bond adsorption chromatography on -cyclodextrin substituted agarose gelmedia.chromatogra B 20051 安徽農學院. 茶葉生物化學M. 2 版. 北京: 北京農 8241-2: 323. 業出版社 1982. 17 胡秋芬 李德良 李海濤 等. 微柱高效液相色譜法2 Savolainen H. Tannin content of tea and coffeeJ. 測定茶多酚的研究J. 食品科學 2004 256: 147. J