1、,第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備,第一節 雜交瘤技術的基本原理 一、雜交瘤技術 二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養與凍存,第二節 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質鑒定 四、單克隆抗體的特性,第三節 基因工程抗體制備 一、人源化抗體 二、小分子抗體 三、抗體融合蛋白 四、雙特異性抗體 五、噬菌體抗體庫技術,第四節 單克隆抗體的應用 一、檢驗醫學診斷試劑 二、蛋白質的提純 三、小分子抗體的應用 四、抗體融合蛋白的應用 五、雙特異抗體的應用 六、抗體庫技術的應用和前景,思考題 小結,第一節 雜交瘤技術的基本原理,雜交瘤技術原理： 聚乙二醇（PEG）

2、：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 HAT培養基的選擇培養：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤細胞系 單克隆抗體生成：接種雜交瘤細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體,抗體種類： 第一代抗體 多克隆抗體（polyclonal antibody) 第二代抗體 單克隆抗體（monoclonal antibody) 第三代抗體 基因工程抗體（genetic engineering antibody),B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體 骨髓瘤細胞：壽命長 雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體,流 程,一、雜交瘤技術,不產生Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴

3、細胞的動物品系相同,（一）小鼠骨髓瘤細胞,動 物： BALB/c小鼠 712周齡 20g25g體重,（二）免疫脾細胞,細胞性抗原： （12）107/只，不加佐劑，23周重復一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加強免疫,免疫小鼠,。,淋巴細胞,。,淋巴細胞發育,。,漿細胞,。,抗原接種,培養液： RPM1640培養液 DMEM培養液,（三）細胞融合,細胞融合劑： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細胞融合劑 作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合 作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PE

4、G，其純度與毒性有所不同,培養骨髓瘤細胞： 選擇對數生長期的細胞進行傳代培養 細胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊 避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞 注意事項：切忌過多傳代培養，可將細胞分裝凍存于-80或液氮及干冰中,免疫脾細胞的制備： 1108的淋巴細胞 無菌手術,飼養細胞： 細胞密度過低不利于細胞生長繁殖 常用小鼠腹腔細胞作飼養細胞 其中MQ還有清除死亡細胞的作用 飼養存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化,。,飼養細胞,骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3) 50% PEG 1min內加完; 2min內加10ml培養液,融合方法,SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：25 1ml 50%的P

5、EG（無菌，預溫37）在1分鐘內滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養液一滴一滴加入,停止PEG作用 根據細胞數量加入HAT培養基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數為（0.51.5）105個。融合后7天，換用HT培養液,細胞融合,1020天出現克隆 HAT篩選 挑克隆,融合細胞的早期培養,HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶 胸腺嘧啶核苷激酶,（四）雜交瘤細胞的選擇性培養,應用液： 8-雜氮鳥嘌呤 聚乙二醇,HAT培養基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷

6、；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA,HAT選擇作用： 淋巴細胞：不能生長，57天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷 骨髓瘤細胞：不能生長，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻,SP2/O: HGPRT- ，TK-;長命 脾細胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 雜交瘤細胞:HGPRT+ ，TK+; 長命,骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞,雜交瘤細胞： 長期生長繁殖 利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA 從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力,有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法

7、(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 軟瓊脂平板法(soft agar method),二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養與凍存,特點： 不需任何特殊設備 克隆出現效率高 實驗室常用方法 方法： 細胞懸液通過系列稀釋 每個培養孔含0.51個細胞,有限稀釋法,效率最高 價格昂貴,FACS,配制方案：雜交瘤細胞（15）x106/ml) + 細胞凍存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培養液，10%DMSO ) “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化

8、、復蘇,雜交瘤細胞的凍存與復蘇,防止污染 避免染色體丟失 防止非分泌細胞的過度生長 防止細胞密度過高而死亡,細胞冷凍的意義,第二節 單克隆抗體的制備,經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。,一、單克隆抗體的產生,動物體內誘生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只 體外培養法： 中空纖維培養系統 單抗含量不高，牛血清Ab難以去除,腹腔注射法,前5天進行,預先腹腔注射pristane （15）106細胞 13w形成腹

9、水,高滴度腹水,可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法 細胞、亞細胞結構上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細胞）,二、單克隆抗體的純化,ELISA,ELISA,多頭加樣槍,。,免疫熒光法,鹽析沉淀 親和層析 離子交換層析,McAb的純化,Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法 特異性測定：抗原類似物的交叉反應 效價測定：用腹水或培養液的稀釋度表示 表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競爭抑制法，相加指數法及微機集群分析 親和性測定：測定親和常數K 雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條 McAb靶抗原分子量：常

10、用western blot,三、單克隆抗體的性質鑒定,四、單克隆抗體的特性,高度特異性 高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現沉淀反應 對環境敏感性,（一）單克隆抗體的特性,優點 ： 在體外“永久”地存活并傳代 用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法 可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療,（二）單克隆抗體的優點與局限性,局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體 制備技術復雜、費時費工、價格較高,McAb PcAb 抗原要求 可以不純 純度高 得量 高 低 特異性 高 低 穩定 低 高 沉淀反應 無

11、有 成本 高 低,McAb與PcAb的比較,McAb and PcAb,第三節 基因工程抗體制備,基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。,將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人Ab，再經雜交瘤技術，產生大量完全人源化抗體,一、人源化抗體,方法： 從雜交瘤細胞分離出功能性可變區基因，與人Ig恒定區基因連接，插入適當表達載體，轉染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體 特點：

12、 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結合抗原的能力,（一）嵌合抗體,嵌合抗體,定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體 意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療,（二）改型抗體,Fab：抗原結合片斷 Fv：可變區片段 ScFv：單鏈可變區片段 SdAb：單區抗體,二、小分子抗體,小分子抗體,其它生物活性蛋白融合,三、抗體融合蛋白,許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上

13、的兩個表位交聯或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。,四、雙特異性抗體,分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。,化學交聯BsAb,將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，B

14、sAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應 (HAMA)，因此不適用于臨床。,細胞工程BsAb,多采用抗體分子片段,如Fab，Fv或ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優越性,五、噬菌體抗體庫技術,用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因 克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面

15、用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。 使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。 抗體庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合 人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人,（一）基本原理和程序,噬菌體抗體庫,從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉錄為cDNA； 應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的Ig基因片段； 構建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構建表面表達的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體； 表達載

16、體轉化細菌，構建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。,構建噬菌體抗體庫,模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆 建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNA 通用引物具有人的種屬普遍性 抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性,（二）噬菌體抗體庫技術的特點,避開了人工免疫和雜交瘤技術 抗體庫的大容量 抗體庫極高的篩選效率 可獲得高親和力的人源化抗體 VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程 所用的抗體基因又來自人體,第四節 單克隆抗體的應用,檢驗醫學診斷試劑 蛋白質的提純 小分子抗體的應用

17、抗體融合蛋白的應用 雙特異抗體的應用 抗體庫技術的應用和前景,病原微生物抗原、抗體的檢測 腫瘤抗原的檢測 免疫細胞及其亞群的的檢測 激素測定 細胞因子的測定,一、檢驗醫學診斷試劑,病原體測定： 肝炎病毒HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH弓形蟲,風疹病毒,巨細胞病毒 ，單純皰疹病毒,細胞表面CD測定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型,激素的測定： 內分泌疾病的診斷,藥物測定(TDM)： 抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛,研究工作中的探針： 越來越多未知功能cDNA的克隆 對復雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加,免疫沉淀,二、蛋白質的提純,單克隆抗體是親和層析中重要的配體

18、。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其余成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。,MACS,定義： 分子量較小但具有抗原結合功能的分子片段 優點： 分子量小,穿透性強,抗原性低 不含Fc段，不會與帶有Fc段受體的細胞結合，不良反應少 可在原核系統表達及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及時中和及清除毒素,三、小分子抗體的應用,應用： 用于腫瘤的導向治療 腫瘤的影像分布 基因治療 細

19、胞內抗體： 在細胞內表達 特異性識別某一基因產物 可干擾該基因產物的生物活性 研究基因結構與功能的關系,腫瘤的體內顯像診斷 單鏈抗體排除速度快，穿透力強，在腫瘤組織中的分布指數較完整抗體分子高 放射顯像時，放射性核素排除較快，對身體危害程度小，顯像的本底較低 理想的顯像定位診斷載體 病毒的診斷和抗病毒感染 血液性疾病的診斷 白血病的免疫診斷及分型,四、抗體融合蛋白的應用,在體外免疫檢測中的應用 自身紅細胞凝集試驗 快速檢測HBV和HIV病原體等 避免化學交聯減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感度 用雙特異抗體作為二抗，檢測限達1ng/ml,五、雙特異抗體的應用,在體內腫瘤放射免疫顯像診斷中的應用 方法： 雙特異抗體的一只臂結合靶抗原，一只臂結合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結合，利用二次導向系統顯示 特點： 更高的的靈敏度和清晰度,在體內免疫治療中的應用 抗體分子可與放射性核素、細胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結合靶分子后可提供重要輔助功能 雙功能抗體可有效針對低水平的腫瘤相關抗原，并將細胞毒物質輸送到腫瘤細胞 抗體還可與攜帶藥物的脂質體、各種PEG偶聯，從而增強體內運輸和藥代動力學,六、