《免疫學基礎及實驗技術》

實驗報告

姓名：姚麗君

專業：針灸推拿學

年級：2023年研究生

實驗室：免疫實驗室

時間：2023年1月12日

教師：李永念老師

免疫學教研室

人血清I的提取及鑒定

(一)重要原理：

二.離子互換層析提取人血清【gG：離子互換劑采用DEAE-纖維素，是表面交聯有二乙基

乙胺基團的纖維素，自身帶有真電荷，能吸附陰離子。DEAE-纖維素懸浮在PH高于6.5,

克分子濃度低的緩沖液內，置備成層析柱。人血清通過PH7.4磷酸緩沖液透析平衡后,

其中的IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其他的蛋白質則重要帶負電荷，這樣的血清樣品

通過相同緩沖液平衡好的DEAE-纖維素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，僅

IgG最易形成吸附-解離-再吸附-再解離的狀態，因比能隨洗脫液一起最早從柱中流出,

收集洗脫液獲得IgGc

三.血清I鑒定：以收集的洗脫液為抗原，與兔抗人IgG做瓊脂雙擴散實驗，可根據沉淀線

的形成擬定IgG抗原性。用免疫電泳法使血清中各種蛋白的分子大小以及電荷狀態、

電荷量均有差異，因而它們的泳動速率也不相同，根據在凹槽中加入免抗人血清，上下

兩孔加入用蔗糖包埋法進行濃縮后的濃縮液和正常人血清，經一段時間后出現沉淀弧,

根據沉淀弧的情況來檢測所獲的IgG的純度。用754型分光光度計于280nm紫外光源

測定洗脫液光密度值.根據IgG的Elcml%=14.3(OD)公式，可計算出收獲的IgG含量,

并推算出所獲得IgG的百分率。

1.重要材料：

2.0.5NNaOH、0.5NHCL、0.85%NaCL按常規配制

3.DEAE-纖維素健康人全血

4.PH7.40.01M磷酸緩沖液

5.20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制

6.蔗糖（研成細粉狀）

7.PH8.60025MBA巴比妥納-巴比妥緩沖液,2MNaCL水溶液

8.1.5%瓊脂凝膠

布氏漏斗、抽濾瓶、水泵、試管，燒杯，玻璃棒，濾紙試紙、蝴蝶鐵架、透析袋、離心機,746?

電泳儀、754型分光光度計

三、操作環節：

1、（-）DEAE-纖維素預解決：

2、稱取DEAE-纖維素12克，均勻撒在事先盛有150ml0.5NNaOH的燒杯中，人其

自由沉降，放置4U—50分鐘，不時地用玻璃棒輕輕攪動。

3、將湖狀物移入墊有濾紙的布氏漏斗中，連接漏斗抽濾瓶，并用水泵抽干糊狀物。

立即將DEA6纖維素移入燒杯中，加蒸儲水，浸泡20-30min并不時攪拌，再移

入漏斗抽干，如此反復，至洗出的PH值等于8即可。

（二）將互換劑移入150ml0.5NHCL中放置40-50min,不時輕輕攪動.移入布氏漏斗抽

濾，再依同法用0.5NNaOH解決一次，時間不超過50min。

（三）重第2項操作，至抽灌液PH值等于8即可，最后PH7.40.01MPB液浸泡互換劑,

抽干，再反復一次，然后將互換劑用相同PB調成糊狀，保存至裝柱。

（四）裝柱、平衡

（五）固定層析柱在蝴蝶鐵架上，垂直。柱上方放置PH7.40.01MPB液的洗脫瓶，以乳

膠管相連，柱底部有細膠管，裝止水夾，調節流速。

（六）將上糊狀物傾入柱中，打開柱底流出口，用燒壞接流出液，注意不能斷層，纖維素

中不允許進空氣，柱上表面要平，上部要留有約3cm高空間。

（七）上樣和洗脫

1、將人血置離心機以2023rpm,lOmin離心，取出并用毛細吸管吸取10ml人血清裝

入透析袋，于燒杯內浸入40倍于血清體積的起始緩沖液中，置4℃冰箱內透析過

夜，半途更換兩次緩沖液；

2、打開柱上端塞子，用帶有橡皮乳頭的毛細吸管吸出互換劑表面的緩沖液，至仍

2mm厚的液面，以免空氣進入；

3、用清潔細吸管將已平衡好的血清樣本原柱管內壁緩緩加在纖維素柱表面，調節

流速，使樣品進入互換柱內，約3ml/lOmin;

4、待液面還約2mm厚的樣品時，用少量起始PB沖洗柱內壁，到PB進入互換劑仍

留有2mm后液面時，再沖洗二次，保持柱面平整；

（八）最后加適量起始緩沖液，連接洗脫瓶，流速調至30.40ml/cm2/h;

（九）收集洗脫液與試管中，每管5ml,共收集12管。并從各管中取1-2滴，加20%三氯

醋酸1-2滴檢測。

（十）洗脫液抗原性鑒定

用1.5%瓊脂凝膠制版，根據下圖用打孔器打孔：

(-1—)加樣：中心孔加入兔抗人IgG從收集的12管洗脫液中用毛細吸管吸取洗脫液

分別加入周邊六孔，每孔所加樣品的量以液面與孔測平齊為準;

（十二）將瓊脂板置海盒內37c溫箱孵育24小時，觀測結果。

（十三）IgG純度鑒定

瓊脂板制作：用1.5%瓊脂凝膠加熱融化后傾注在載玻

片上，玻片上放一條細玻棒，等凝膠凝固后在玻棒上下

兩側打孔，制成如圖所示：

1、洗脫液的解決：將通過離子互換層析法收集的12管洗脫液，用754型分光光度

計測各管洗脫液在波長280nm的光密度值，第一個蛋白峰為IgG,收集有IgG活

性的三管洗脫液，混合后裝于透析袋內，用蔗糖粉末將其包埋使其濃縮；

2、加樣：如圖示上孔加入濃縮的IgG提取液，入孔加入正常人血清，將加樣后的瓊

脂板置于746-電泳儀上，用四層紗布條做橋，連接凝膠板與電極緩沖液。該橋搭

在凝膠上部分約5mm,盡量拉直，與膠面間不能有氣泡；

3、連接電源，調節指示電壓至100V(端壓約為5V/cm),電泳槽加蓋后，電泳至血

清蛋白遷移至距正極段邊沿1cm處，關閉電源；

凝膠板與桌面，取出玻條，凝膠中部既成一長槽，加兔抗人全血清加入槽內與膠面水

平；

置凝膠板與濕盒內，于37c或室溫中孵育，12小時觀測沉淀弧出現的情況。

7、計算回收率:取透析袋內濃縮的提取液，用754型分光光度計測波長280的光密度值，假

如超過測定范圍，稀釋后再測，按濃縮后IgG(mg/ml)=OD280X1.43X|可收體積，正常人血清

IgG:12(mg/ml)X收集的血清體積，回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG,計算回收率。

四、實驗結果：

LDEAE-纖維素洗說，收集洗脫液12管，均為略帶黃色的液體，取樣添加20%三氯醋

酸，各管中僅第4、5管出現渾濁，表白試管洗脫液中含蛋白質。其余管未見明顯反

映。

745型分光光度計測出12管洗脫液的光密度(OD)值如下：

管數123456789101112

A28O0.0240.0322.853.()42.650.660.192().155().133().113().11()0.110

做

A280

光密

度值

峰值

曲線

圖如

下：

A280

(試管數)

a)通過蔗糖粉末包埋后，收集到濃縮的IgG為3.5ml,測其OD值為3.52,此值

已經超過光密度計測定范圍，取0。5ml濃縮液加2.5ml生埋鹽水稀釋5倍

后測OD值為2.52。

按下列方法計算IgG回收率：

濃縮后IgG：C(mg/ml)=OD280X1.43X體積(3.5X5)

正常人血清IgG:12(mg/ml)X體積(8ml)

回收率=濃縮IgG/正常人血清IgG

=2.52x1.43x3.5x5/12x8

=65.69%

向瓊脂擴散實驗結果如下圖，有白色成沉淀線出現，彼此互相融合相連。

疫電泳(純度鑒定)如下圖，有沉淀弧出現，提取液與抗人全血清之間只出現一條沉淀弧，并

靠近凝膠板負極端，說明所提取IgG為純品。人血清與抗人血清之間由于存在多抗原抗體成

分，所以出現多條沉淀弧。

五、分析與討論:

IgG是一種具有抗體活性的免疫球蛋白，其具有一般蛋白質的通性，是再次體液免疫應

答產生的重要Ig。IgG重要由脾臟和淋巴結中漿細胞合成，含量高（在血清中含量最高），分

布廣，它能與抗原特異性結合，從而在體內介導多種生理和病理效應。

本次實驗是運用離子互換劑的特性，血清中IgG不帶電荷或僅帶少量電荷，其它的蛋白

質則重要帶負電荷，使人血清通過帶陽禽子DEAE-纖維素制成的互換劑，帶負電荷的蛋白

質與陽離子互換劑結合，而不帶電荷的IgG處在游離狀態，用PH7.4的磷酸緩沖液通過層析

柱，未結合的IgG隨洗脫液一起流出，試管收集，這樣使血清樣品通過DEAE-纖維柱而得

以分離出IgG。收集的洗脫液顏色略帶黃色，也許是收集血清時吸入了破碎的紅細胞。在加

入三氯醋酸后4.5管出現沉淀，說明從第4管開始有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3.4.5

三管，并峰值上升和下降不久，未見饅頭峰，證明洗脫較好。

本次實驗己成功地收集了IgG,從雙向瓊脂擴散實驗的結果看，中間孔抗人IgG與周邊

孔的提取液IgG之間的凝膠出現一條白色沉淀線,3、4、5孔之間形成的沉淀線互相吻合，這

說明IgG與抗體抗人IgG濃度相稱，提取液為單一抗原，即IgG。通過免疫電泳結果看：在

滴加濃縮提取液的一測出現一條沉淀弧，說明濃縮提取液中只有一種抗原物質，而在滴加正

常人血清的一測出現多條沉淀弧，說明正常人血清中存在多種抗原物質。所以，通過以上兩

個實驗證明：經分離提取的為純IgG。

根據回收率看本實驗的提取及回收比較有效，亦可根據公式計算IgG的濃度為

18.018mg/mU

實驗七抗體形成細胞的檢測

一、脾細胞介導的羊紅細胞分光光度計定量測定法（QHS）

二、重要原理

將經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾臟制成細胞懸液，與一定量的綿羊紅細胞在試管內混合，加入

適量補體，在水浴中孵育一定期間，在補體的參與下，引起抗體形成細胞周邊的綿羊紅細胞

溶解，并且溶血的限度與脾細胞中的抗體形成細胞總數有一定的關系，與抗體形成細胞所分

泌的抗體量有關，但不能反映單個抗體分泌細胞的數量。因抗體形成細胞上有抗綿羊紅細胞

抗體，與綿羊紅細胞結合，在補體的激活下，綿羊紅細胞溶解，故抗SRBC抗體又稱溶血素。

通過一?定量SRBC完全溶解的最高血清稀釋度得到溶血素的效價。QHS法可用于檢測藥物

對SRBC誘導抗體產生過程是否有刺激作用和克制作用。

三、重要材料

1、SRBC保存液，預先洗三次，配置為0.5%、1%濃度的SRBC

2、Balb/c小鼠（體重25左右，雌雄隨機），免疫與未免疫小鼠各6只

3、0.01MPH7.2PBS（含Ca2+,Mg2+）,生理鹽水

4、補體（預先制備好的，需稀釋成1：30）,熒光標記的免疫小鼠IgG

其他：水浴箱、離心機、試管、玻片、毛細吸管、組織研磨器等

四、操作環節

1.先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于清潔干燥試管內、待血液凝固后，置恒溫箱37c內

30min,血清析出,并收集與小管保存,以備測溶血素;

2.頸椎脫臼處死小鼠，暴露腹腔，用PBS清洗，用組織研磨器研磨置備單細胞懸浮液（每個

脾臟加5mlNS）,然后離心（2023轉/分）lOmin,棄上清夜，再加生理鹽水離心,如此反復3

次，各管最后留下的沉淀分別加生理鹽水至8ml備用；

3、取6個試管，設1、2、5號為免疫后的小鼠,3號為未免疫小鼠,4、6號不裝入脾細胞，然

后按如下操作，混勻，置水浴箱30min,目測結果如下：

單位（ml）

編號脾細胞SRBC補體(1:30)PBCFI測結果

(5X106)/ml(0.5%)

1-21（免疫鼠）11—清

31（未免疫鼠）11—混濁

4—111混濁

51（免疫鼠）1—1混濁

6—1—2混濁

4.溶血素效價的測定：

2）1）取前血清制備測血清，離心；

取前制備免疫小鼠，取0.1ml于第一試管中，再加入0.9NS1ml,混勻從中取0.5ml加入第二

個試管中，再力口0.5mlNS,混勻，取0.5ml加入第三管中，繼續如此加至第9管，稀釋后取出

0.5ml丟棄,最后一管只加NS,然后再于各管中加入0.5ml補體（1:30）和0.5ml1%SRBC,搖

勻,于37℃水浴30min,取出后看結果。方法與結果如下:

管數123乙56789101112131415

對

/昭、、、

組

小鼠0.10.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5-

血清

NS0.90.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5

補體0.50.5