單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目二青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)二青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐過(guò)濾萃取脫色結(jié)晶干燥冷凍干燥孢子工業(yè)鹽成品青霉素生產(chǎn)工藝流程

青霉素發(fā)酵生產(chǎn)流程圖1.生產(chǎn)流程2.種子制備

種子制備階段包括孢子培養(yǎng)和種子培養(yǎng)兩個(gè)過(guò)程，孢子培養(yǎng)以產(chǎn)生豐富的孢子為目的，而種子培養(yǎng)以繁殖大量健壯的菌絲體（種子罐培養(yǎng)）為主要目的。（1）生產(chǎn)孢子的制備將砂土孢子用甘油、葡萄糖和蛋白胨組成的培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)后，移到大米或小米固體培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7天，孢子成熟后進(jìn)行真空干燥，并以這種形式低溫保存?zhèn)溆谩＃?）生產(chǎn)種子的制備一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖、乳糖、玉米漿等。接種量：每噸培養(yǎng)基不少于200億孢子溫度：（27±1）℃；通氣量：1：3（體積比）；攪拌轉(zhuǎn)速：300-350r/min；培養(yǎng)時(shí)間：40h左右（2）生產(chǎn)種子的制備二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿等。接種量：10%；溫度：（25±1）℃；空氣流量：1:（1-5）；攪拌轉(zhuǎn)速：250-280r/min；培養(yǎng)時(shí)間：10-14h，種子質(zhì)量要求：菌絲稠密，菌絲團(tuán)很少，菌絲粗壯，有中小空胞，處在第Ⅲ～Ⅳ期。3.培養(yǎng)基（1）碳源青霉菌能利用多種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。乳糖能被產(chǎn)生菌緩慢利用而維持青霉素分泌的有利條件，故為最佳碳源，但因貨源少、價(jià)格高，普遍使用有困難。天然油脂如玉米油、豆油也能被緩慢利用作為有效的碳源，但不可能大規(guī)模使用。目前，普遍采用淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖糖化液（DE值50％以上）進(jìn)行流加。(2)氮源青霉素工業(yè)發(fā)酵中，可選用玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩子粉，并補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源。玉米漿是淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品，含精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等多種氨基酸和β-苯乙胺，所以是青霉素發(fā)酵的最佳氮源。國(guó)產(chǎn)量少，而產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定，國(guó)內(nèi)青霉素工業(yè)發(fā)酵中少用，國(guó)外用量較大。花生餅粉作為青霉素發(fā)酵的氮源，要調(diào)整配方，且裝料系數(shù)會(huì)受影響，但生產(chǎn)水平可以達(dá)到用玉米漿的技術(shù)指標(biāo)。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)上采用的氮源是花生餅粉。此外，麩皮粉、玉米胚芽粉和尿素也在生產(chǎn)中使用。(3)無(wú)機(jī)鹽主要包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。這些無(wú)機(jī)離子的濃度對(duì)青霉菌的生長(zhǎng)和青霉素的生物合成均有影響：①硫的濃度降低時(shí)，青霉素產(chǎn)量減少至30%；②磷的濃度降低時(shí)，青霉素的產(chǎn)量減少50%；③培養(yǎng)基中碳酸鈣主要起緩沖pH的作用；④鈣、鎂、鉀等陽(yáng)離子總濃度控制在300mmol/L為好，其中的比例為鉀30%，鈣20%，鎂41%，這種條件下，青霉素的產(chǎn)量最高；⑤三價(jià)鐵離子對(duì)青霉素生物合成有顯著影響，一般發(fā)酵液中鐵離子超過(guò)30～40μg/ml，則發(fā)酵單位增長(zhǎng)緩慢。(4)前體種類：苯乙酸及其衍生物，

苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等青霉菌可將前體直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中，也可作為養(yǎng)料和能源利用，毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。發(fā)酵液中前體濃度始終維持在0.l%為宜。苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。(4)前體前體的氧化pH：苯乙酸被菌體氧化的速率，隨培養(yǎng)基的pH值上升而增加。菌齡：年輕的菌絲不氧化前體，而僅利用它來(lái)構(gòu)成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力漸漸增加。培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基成分對(duì)前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)前體的氧化量少。策略：低濃度流加時(shí)期：合成階段操作變量要求水平操作變量要求水平發(fā)酵罐容積150～200m3發(fā)酵液pH值6.5～6.9裝料率80%初始菌絲濃度1～2kg（干重）/m3輸入機(jī)械功率2～4kW/m3補(bǔ)料液中葡萄糖濃度約500kg/m3空氣流量30～60m3/（m3?h）葡萄糖流加率1.0～2.5kg/（m3?h）空氣壓力（表壓）0.2MPa發(fā)酵液中銨氮濃度0.25～0.3kg/m3罐壓（表壓）0.035～0.07MPa發(fā)酵液中前體濃度1kg/m3液相體積傳氧系數(shù)200h-1發(fā)酵液中溶氧濃度>30%飽和度發(fā)酵液溫度25℃發(fā)酵周期180～220h青霉素發(fā)酵的一般工藝要求4.發(fā)酵工藝控制（1）補(bǔ)料的影響及控制在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)濃度過(guò)高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和銨的阻遏或抑制，苯乙酸的生長(zhǎng)抑制），而后期基質(zhì)濃度低，限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。為了避免這一現(xiàn)象，在青霉素發(fā)酵中通常采用分批補(bǔ)料操作法，即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)（葡萄糖、胺、苯乙酸等）進(jìn)行緩慢流加，以維持一定的最適濃度。青霉素發(fā)酵過(guò)程中的補(bǔ)料主要包括碳源物質(zhì)、氮源物質(zhì)、前體等。①葡萄糖的流加：加糖的依據(jù)是發(fā)酵液中的殘?zhí)橇考皃H值，最好是根據(jù)排氣中CO2及O2量來(lái)控制。一般在殘?zhí)墙抵?.6％左右，pH值上升時(shí)開(kāi)始加糖。一般要求是，如果加糖后pH值高于要求時(shí)，可增加加糖量；pH值低于要求時(shí)，要減少加糖量。

②氮源的補(bǔ)充：在發(fā)酵60～70h后，補(bǔ)加氮源也可以提高發(fā)酵單位。如分次補(bǔ)給硫酸銨，可以延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高青霉素的產(chǎn)量。③前體：在基礎(chǔ)料中添加前體0.07%，當(dāng)發(fā)酵單位上升到2500U/ml時(shí)開(kāi)始補(bǔ)充前體，一般4h補(bǔ)充一次。發(fā)酵液中苯乙酸的濃度不超過(guò)0.1%為宜；殘余的苯乙酰胺濃度在0.05%～0.08%為準(zhǔn)。④在發(fā)酵過(guò)程中與料液一起補(bǔ)入表面活性劑如新潔爾滅，或聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯和三油酸酯等非離子表面活性劑也能增加青霉素的產(chǎn)量。⑤在青霉素發(fā)酵過(guò)程中加入少量可溶性高分子化合物如聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能使青霉素產(chǎn)率增加38%。最適pH6.5－6.9左右，避免超過(guò)7.0，青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解pH值過(guò)高，可加糖、硫酸或無(wú)機(jī)氮源；pH值較低可加入CaCO3、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。補(bǔ)糖來(lái)控制pH值比用酸、堿來(lái)調(diào)節(jié)好（2）pH值的影響及控制青霉菌生長(zhǎng)適宜溫度27℃，合成適宜溫度20℃變溫控制，不同階段不同溫度生長(zhǎng)階段：較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間生產(chǎn)階段：適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成（3）溫度的影響及控制＜30％飽和氧濃度，產(chǎn)率急劇下降＜10％飽和氧濃度，造成不可逆的損害臨界溶氧濃度：30％發(fā)酵前期主要是菌絲生長(zhǎng)，攪拌速度應(yīng)高些，發(fā)酵中、后期降低轉(zhuǎn)速不但能節(jié)約電能消耗，而且有利于青霉素的合成、分泌。發(fā)酵罐的攪拌速度一般以1