大腸菌群檢測

主講教師：呂

偉農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗員——平板計數(shù)法目錄大腸菌群測定的意義與原理1大腸菌群平板計數(shù)法測定準(zhǔn)備工作2大腸菌群平板計數(shù)法鑒別培養(yǎng)3大腸菌群平板計數(shù)法發(fā)酵鑒定操作45大腸菌群平板計數(shù)法測定注意事項3案例：

2021年11月，廣西-東盟食品檢驗檢測中心檢驗報告NO：SQ211632，廣西三品王米粉生產(chǎn)有限公司抽樣檢驗的調(diào)制鮮濕米粉大腸菌群項目不合格，依據(jù)《中華人民共和國行政處罰法》與《中華人民共和國食品安全法》決定給予以下行政處罰：1.沒收違法所得人民幣伍佰伍拾玖元叁角肆分；2.罰款人民幣伍萬元整（￥50000.00元）。

大腸菌群平板計數(shù)法

4

大腸菌群平板計數(shù)法-大腸菌群特征

大腸菌群是以大腸埃希氏菌為主的需氧與兼性厭氧、

革蘭氏陰性菌、無芽孢桿菌，主要來自于人和溫血動物

腸道，在37℃條件下，48小時內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)

氣。條件致病菌，超標(biāo)引起中毒風(fēng)險增高。5

大腸菌群平板計數(shù)法-意義

1、作為水體糞便污染的指標(biāo)菌，監(jiān)測水質(zhì)。2、反映樣品被糞便污染情況，一定程度上反映了食

品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。6

大腸菌群平板計數(shù)法-學(xué)習(xí)目標(biāo)

1、會依據(jù)無菌操作規(guī)范完成取樣。2、學(xué)會配制與使用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基。3、會依據(jù)接種規(guī)范完成鑒別培養(yǎng)基接種操作。4、會判斷鑒別培養(yǎng)基生長的典型和可疑大腸菌群菌落。5、學(xué)會典型和可疑菌落證實實驗的操作。6、會依據(jù)陽性管數(shù)、平板菌落數(shù)、稀釋度完成報告。

7

大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在指示劑作用下形成可計數(shù)的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落，利用大腸菌群在VRBA鑒別培養(yǎng)基生長為特征菌落進(jìn)行識別，完成菌落計數(shù)，結(jié)合發(fā)酵證實實驗對典型和可疑菌落的發(fā)酵結(jié)果，利用公式完成大腸菌群計數(shù)。

大腸菌群平板計數(shù)法-原理

81、確定檢測樣本合適的稀釋倍數(shù)

依據(jù)：國標(biāo)2-3個連續(xù)的合適的稀釋度。

VRBA平板菌落數(shù)范圍15-150CFU。2、例：樣品含菌量大致為2.6*103CFU/ml，請確定

適宜的2-3個稀釋倍數(shù)。

稀釋10倍→含菌量2.6*102CFU/ml→稀釋100倍

→含菌量2.6*10CFU/ml

適宜的3個稀釋倍數(shù)為10倍、100倍、1000倍

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（稀釋倍數(shù)選擇）

91.高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱36℃

士1℃、恒溫水浴鍋46℃士1℃、天平感量0.1g、均質(zhì)器、

振蕩器。2.無菌吸管1mL(具0.01mL刻度)10mL(具0.1mL刻度)或

微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶容量500mL、無菌培養(yǎng)

皿、無菌試管。3.pH計或pH比色管或精密pH試紙。（樣品勻液PH6.5-7.5）

需要1mol/lNaOH或HCL調(diào)節(jié)。

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（儀器與設(shè)備）

10配制1mol/LNaOH或1mol/LHCL。1、1mol/lLNaOH100ml利用公式C=n/V與

m=nM計算。

n=1mol/L*0.1Lm=1mol/L*0.1L*40g/mol2、1mol/LHCL100ml，利用公式C=n/V與

m=nM、m=ρv完成計算。

1mol/L=n/0.1Ln=1mol/L*0.1L

m=nM=ρv

1mol/L*0.1L*36.5g/mol=1.19g/ml*V*38%

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（儀器與設(shè)備）

11結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)1.成分蛋白胨7.0g、酵母膏3.0g、乳糖10.0g、氯化鈉5.0g、膽鹽或3號膽鹽1.5g、中性紅0.03g、結(jié)晶紫0.002g、瓊脂15g~18g、蒸餾水1000mL。2.制法蒸餾水溶解，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)pH至7.4±0.1。煮沸至培養(yǎng)基溶解，恒溫至45℃~50℃傾注平板。使用前臨時制備，不得超過3h。

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（培養(yǎng)基）

12煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯1.成分蛋白胨10.0g、乳糖10.0g、牛膽粉溶液200mL、

0.1%煌綠水溶液13.3mL、蒸餾水800mL2.制法將蛋白胨、乳糖溶于500mL蒸餾水，加入牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL餾水調(diào)PH至7.0~7.5)，蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)pH至7.2+0.1，加0.1%煌綠水溶液13.3mL，蒸餾水補至1000mL，分裝121℃高壓滅菌15min。

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（培養(yǎng)基）

13磷酸鹽緩沖液1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)34.0g蒸餾水500mL。2制法貯存液:稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，蒸餾水稀釋至1000mL貯存于冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL，蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（試劑）

14無菌生理鹽水1

成分

氯化鈉8.5g，蒸餾水1000mL.2制法稱量8.5g氯化鈉溶于1L蒸餾水中。121℃,15min高壓蒸汽滅菌。

大腸菌群平板計數(shù)法-準(zhǔn)備工作（試劑）

15器皿數(shù)量依據(jù)例（1）2-3個連續(xù)稀釋度。

10-1一支吸管，2只錐形瓶

10-2一支吸管，1支試管10-3一支吸管，1支試管

空白一支吸管，一支試管

（2）每個稀釋度對應(yīng)2只平皿。

（3）BGLB肉湯發(fā)酵試管10+空白

大腸菌群平板計數(shù)法-器皿準(zhǔn)備工作

16

大腸菌群平板計數(shù)法-主要流程

17

大腸菌群平板計數(shù)法-無菌操作181、樣品具有代表性。2、液體樣品排除取樣口殘留，盛放樣品器皿無菌密封，

取樣使用無菌吸管或無菌微量取樣器。3、固體樣本選代表區(qū)域取樣，可以使用無菌剪刀、

鑷子等。4、標(biāo)記樣品名稱、取樣時間、取樣點、取樣人、檢測

項目、檢測依據(jù)、儲存時間。

大腸菌群平板計數(shù)法-取樣與標(biāo)記要求

19固體、半固體樣本均質(zhì)取25g樣品放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯8000r/min~10000r/min均質(zhì)，1min~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1:10的樣品勻液。

大腸菌群平板計數(shù)法-均質(zhì)

20

大腸菌群平板計數(shù)法-均質(zhì)

液體樣品均質(zhì)無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。21

大腸菌群平板計數(shù)法-稀釋與接種

樣品25ml或25g225ml無菌水錐形瓶10-110-21ml10-11ml10-210-31ml檢測液1ml檢測液1ml檢測液1ml檢測液空白22

大腸菌群平板計數(shù)法-鑒別培養(yǎng)基

將15m~20m恒溫至46℃的結(jié)晶紫中性紅瓊脂培養(yǎng)基(VRBA)傾注與無菌平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待平板瓊脂凝固后，再加入3ml~4mL的VRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板置于36℃+1℃培養(yǎng)18h~24h。23

大腸菌群平板計數(shù)法-鑒別培養(yǎng)基

典型菌落為紫紅色或紅色菌落，周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm或更大。24

大腸菌群平板計數(shù)法-平板計數(shù)

平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落，菌落直徑較典型菌落小。25

大腸菌群平板計數(shù)法-平板計數(shù)

選取菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間的平板分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。最低稀釋度平板低于15CFU的記錄具體菌落數(shù)。26

大腸菌群平板計數(shù)法-選取典型可疑菌落

選取菌落數(shù)10個平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落接種于BGLB肉湯培養(yǎng)基。1、空白實驗2、典型和可疑菌落數(shù)不足10CFU27

大腸菌群平板計數(shù)法-發(fā)酵證實實驗

設(shè)定培養(yǎng)的溫度36+1℃、時間24-48h。觀察小導(dǎo)管是否有氣泡28

大腸菌群平板計數(shù)法-數(shù)據(jù)記錄

記錄1、稀釋度與對應(yīng)典型和可疑菌落數(shù)2、標(biāo)記合適的稀釋度與典型和可疑菌落數(shù)3、記錄發(fā)酵接種試管數(shù)目

4、發(fā)酵陽性管數(shù)目29

大腸菌群平板計數(shù)法-數(shù)據(jù)處理與報告

VRBA平板上典型和可疑菌落數(shù)*發(fā)酵證實實驗

大腸菌群陽性的試管比例*稀釋倍數(shù)，即為每克

(毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。

例:104樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100

個典型和可疑菌落，挑取10個接種BGLB肉湯

管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)

如下

:

100x6/10x104/g(mL）=6.0x105CFU/g(mL)。30

大腸菌群平板計數(shù)法-數(shù)據(jù)處理與報告

練習(xí)1:102樣品稀釋液1mL，VRBA平板上有30

個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉

湯管，證實有10個陽性管，請報告該樣品的大

腸菌群數(shù)。

30x10/10x102=3.0x102CFU/g(mL)。

練習(xí)2：經(jīng)過檢測所有平板包括檢樣原液均無典

型和可疑菌落，請完成報告。

若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落

生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。31

大腸菌群平板計數(shù)法-數(shù)據(jù)處理與報告

VRBA平板上典型和可疑菌落數(shù)*發(fā)酵證實實驗

大腸菌群陽性的試管比例*稀釋倍數(shù)，即為每克

(毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。

例:103樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有8

個典型和可疑菌落，挑取8個接種BGLB肉湯

管，證實有5個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)

如下

:

10x5/8x103=6.3x104CFU/g(mL)。32

大腸菌群平板計數(shù)法-數(shù)據(jù)處理與報告

VRBA平板上典型和可疑菌落數(shù)*發(fā)酵證實實驗

大腸菌群陽性的試管比例*稀釋倍數(shù)，即為每克

(毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。

練習(xí):103樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有

10個典型和可疑菌落，挑取8個接種BGLB肉湯

管，證實有5個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)