單元七層析（色譜分離）技術知識目標：層析分離技術的概念、層析分離技術的基本工作原理層析技術的分類各種層析方法的原理。層析技術的工業應用技能目標：能區分層析分離技術和其它分離技術能區分不同類型的層析技術能區別不同層析方法的機理能根據要求合理選擇不同的層析手段筆記要點：1、層析技術的概念2、層析技術的基本原理3、層析分離理論基礎4、色譜圖及相關概念

1903年，俄國植物學家向填充碳酸鈣的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，用石油醚淋洗，柱中出現數條相互分離的色帶，層析法(色譜法)的命名由此開始。

1931年，Kuhn和Lederer在氧化鋁和碳酸鈣柱體上，以制備規模分離了胡蘿卜素和葉黃素。層析法正式開始應用。流動相：乙醚固定相：碳酸鈣現象：色譜帶

1938年，色層分離法的適用范圍擴展至無色物質。

1940年到1943年，Tiselius提出了前流分析和轉換分析法，隨后又出現了“分配色譜”、“離子交換色譜”、“凝膠色譜”、“親和色譜”等，使色層分離成為有機化學、生物化學、蛋白質等方面的一項重要分離技術。

層析技術

層析技術是一組相關分離方法的總稱，實質是物理化學分離方法，利用混合物中各組分在兩相(固定相和流動相)中溶解、析出、吸附、脫附、或其他親和力和滲透性的差異，當兩相作相對運動時，使各組分在兩相中反復多次受到作用力而得到互相分離。

常用生物大分子分離的色譜方法，按機理分主要有：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜。§1、層析技術的基本原理及分類一、層析的基本原理1、概念

是利用混合物中各組分在兩相中分配系數不同，當流動相推動樣品中的組分通過固定相時，在兩相中進行連續反復多次分配，從而形成差速移動，達到分離的方法。

圖示柱層析分離設備2、分離理論基礎（1）、基本原理

混合物中各組分在性質和結構上的差異，當流動相攜帶的混合物流經固定相時，與固定相之間產生作用力的大小、強弱不同，導致各組分在固定相中的分配系數不同，使各組分隨流動相移動的速率不同。

分配系數大的溶質在固定相上存在的概率大，隨流動相移動的速率小，隨著流動相的移動，經過反復多次的分配平衡，各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。

與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到將各組份分離的目的。（2）、平衡常數K

定溫定壓下色譜分離達到平衡狀態時，某種組分在固定相s和流動相m中濃度C的比值。

K=Cs／Cm

相關因素：①被分離物質本身的性質；

②固定相和流動相的性質；

③色譜柱的操作溫度。反比

平衡系數K的差異程度決定了色譜分離的效果，K值差異越大，色譜分離效果越理想。３、色譜圖及基本概念

色譜圖：混合液中各組分經色譜柱分離后，隨流動相依次流出色譜柱進入檢測器，檢測器的響應信號—時間曲線或檢測器的響應信號—流動相體積曲線，又稱色譜流出曲線。 色譜圖的縱坐標為檢測器的響應信號，橫坐標為時間，也可用流動相體積Ｖ或距離L表示。

（１）、基線沒有組分流出，僅有純流動相流過檢測器，如圖OC線。噪聲—空氣峰。基線反映操作條件是否正常，穩定的基線應是一條平行于橫坐標的直線。（２）、色譜峰組分隨流動相流人檢測器時，檢測器的響應信號大小隨時間變化而成的峰形曲線，起點和終點的連接為峰底。（３）、峰形標準為對稱峰。實際流出曲線并非完全對稱，拖尾峰和前伸峰。標準峰拖尾峰前伸峰（４）、保留值混合物各組分在色譜柱中停留的時間或組分帶出色譜柱所需流動相體積的數值。

①保留時間tR從開始進樣至柱出口處被測組分出現濃度最大值時所需的時間，如圖中O`B

②保留體積VR從開始進樣到柱出口處被測組分出現濃度最大值時所通過的流動相體積。

③死時間to不被固定相滯留的組分，從開始進樣到柱出口處出現濃度最大值時所需的時間，其值等于流動相流經色譜柱的時間。④死體積Vo不被固定相滯留的組分，從進樣到出現最大峰值所需流動相的體積。即Vo=toFc。

⑤校正保留時間tR`

扣除死時間后的保留時間即為組分在固定相中實際滯留的時間。即

tR`=tR-to

⑥校正保留體積VR`

扣除死體積后的保留體積。即VR`＝VR—Vo

將更合理地反映被測組分的保留特點。

⑦相對保留值r2，l

在相同的操作條件下，待測組分與參比組分的校正保留值之比，又稱為選擇因子。即

r2，l=t′R2／t′R1=V′R2/V′R1（５）、峰高與峰面積

峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離；

峰面積：峰與峰底之間的面積。（６）、區域寬度色譜峰的區域寬度可衡量柱效。

①標準偏差σ，o．607h峰高處的峰寬的1／2。

②半高峰寬W1／2

l／2h處的峰寬W１／2＝２．355σ

③峰寬W

色譜峰兩側的轉折點(拐點)處所作的切線與峰底相交于兩點

W＝４σ。

理想的色譜:組分譜帶窄，若譜帶較寬，將直接導致分離效果下降。（７）、分離度Ｒ是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比。

Ｒ＝（tR2－

tR1）／（W2

W1）／２

分離度R綜合考慮了保留值的差值與峰寬兩方面的因素對柱效率的影響，可衡量色譜柱的總分離效能。R值越大，兩色譜峰的距離越遠，分離效果就越好。

當Ｒ<l時，兩峰有部分重疊；

當R＝1時，兩峰有98％的分離；

當R>1．5時，分離程度可達99．7％；

用R＝1．5作為相鄰兩峰完全分離的標志。（８）、柱效柱效是表達色譜柱性能的一個重要參數，可用塔板數N和塔板高度H表示，其計算式為：

N=L/H

理論塔板數與色譜參數之間的關系為：

假設色譜柱的內徑和柱內的填料是均勻一致的，混合液流經一小段色譜柱后，各組分在兩相間達到