人類8型皰疹病毒RTA蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達與純化研究一、引言1.1人類8型皰疹病毒概述人類8型皰疹病毒（HumanHerpesvirus8，HHV-8），又被稱作卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi'sSarcoma-AssociatedHerpesvirus，KSHV），是γ皰疹病毒亞科的成員之一。1994年，Chang等研究人員運用代表性差異分析（RepresentationalDifferenceAnalysis）技術(shù)，從一位艾滋病相關(guān)卡波西肉瘤（AIDS-KS）患者的KS病變組織中首次發(fā)現(xiàn)了HHV-8。這一發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)深入研究HHV-8相關(guān)疾病的發(fā)病機制和防治策略奠定了基礎(chǔ)。HHV-8呈多面體殼狀包裹顆粒，直徑處于150-200nm之間，擁有電子致密的核心，外周是100nm的帽，最外層為電子致密的殼覆以雙層膜包裹。作為一種雙鏈DNA病毒，其基因組大約為210kb，由140.5kb的長特異編碼區(qū)與801bp的G+C末端重復(fù)序列共同構(gòu)成。在長特異編碼區(qū)，至少存在81個開放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF），其中有15種是HHV-8特有的ORF。這些獨特的基因結(jié)構(gòu)，決定了HHV-8特殊的生物學(xué)特性和致病機制。HHV-8與多種人類疾病存在緊密聯(lián)系，其中最為典型的是卡波西肉瘤（Kaposi'sSarcoma，KS）。KS是一種較為罕見的血管性腫瘤，主要發(fā)生于皮膚，但也可能出現(xiàn)在肺部、腸道、淋巴結(jié)等身體其他部位。根據(jù)臨床特征和流行病學(xué)特點，KS可分為經(jīng)典型、地方型、醫(yī)源性或移植后型以及流行型或艾滋病相關(guān)性KS。所有類型的KS均顯著高發(fā)于男性，其中，艾滋病相關(guān)性KS在艾滋病患者中具有較高的發(fā)病率，是導(dǎo)致這類人群死亡的主要原因之一。除了KS，HHV-8還與體腔淋巴瘤（PrimaryEffusionLymphoma，PEL）、多中心性卡斯特萊曼病（MulticentricCastleman'sDisease，MCD）等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在PEL患者的腫瘤細胞中，能夠檢測到HHV-8的DNA和相關(guān)蛋白的表達；而在MCD患者的病變組織中，也發(fā)現(xiàn)了HHV-8感染的證據(jù)。這些疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)。在傳播途徑方面，雖然HHV-8的傳播途徑尚未完全明確，但目前研究認(rèn)為可能通過性接觸傳播，也可能經(jīng)唾液、器官移植或輸血傳播。在一些艾滋病患者群體中，性傳播被認(rèn)為是HHV-8傳播的重要途徑之一；而在器官移植受者中，通過移植帶有HHV-8的器官而感染的案例也時有報道。此外，HHV-8在人群中的感染率存在顯著的地域差異，在非洲、地中海地區(qū)以及艾滋病高發(fā)地區(qū)，其感染率相對較高，這可能與當(dāng)?shù)氐纳盍?xí)慣、衛(wèi)生條件以及人群的免疫狀態(tài)等多種因素有關(guān)。深入了解HHV-8的傳播途徑和感染特點，對于制定有效的防控措施具有重要意義。1.2復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活蛋白（RTA）1.2.1RTA的結(jié)構(gòu)剖析RTA作為HHV-8感染和病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其結(jié)構(gòu)對于理解病毒的致病機制具有重要意義。RTA包含兩個關(guān)鍵區(qū)域，分別是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain，DBD）和激活功能域（activationdomain）。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是RTA與宿主DNA相互作用的關(guān)鍵部位。它能夠特異性地識別并結(jié)合宿主DNA上的特定序列，從而啟動后續(xù)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。這一結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和空間構(gòu)象決定了其與DNA結(jié)合的特異性和親和力。研究表明，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中通常含有一些保守的基序，如螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（Helix-Turn-Helix，HTH）結(jié)構(gòu)、鋅指結(jié)構(gòu)等，這些基序通過與DNA雙螺旋的大溝或小溝相互作用，實現(xiàn)對特定DNA序列的識別和結(jié)合。以HTH結(jié)構(gòu)為例，它由兩個α-螺旋通過一個短的轉(zhuǎn)角連接而成，其中一個α-螺旋負責(zé)識別DNA序列，另一個α-螺旋則與DNA骨架相互作用，增強結(jié)合的穩(wěn)定性。激活功能域則主要負責(zé)激活HHV-8的基因轉(zhuǎn)錄。它通過與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中的其他成分相互作用，如RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等，促進轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程。激活功能域通常富含酸性氨基酸，具有較強的親水性，這種特性使其能夠與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的相互作用，進而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能。在真核生物中，許多轉(zhuǎn)錄激活因子的激活功能域都具有類似的結(jié)構(gòu)特征，它們通過招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如CBP（CREB-bindingprotein）、p300等，來增強轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的活性，促進基因的轉(zhuǎn)錄。在病毒感染過程中，RTA的這兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域協(xié)同發(fā)揮作用。當(dāng)HHV-8感染宿主細胞后，RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域首先識別并結(jié)合宿主DNA上的特定序列，將RTA定位到病毒基因的啟動子區(qū)域。隨后，激活功能域與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中的其他成分相互作用，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動HHV-8基因的轉(zhuǎn)錄。這一過程對于病毒的復(fù)制和傳播至關(guān)重要，因為只有通過激活病毒基因的轉(zhuǎn)錄，才能合成病毒復(fù)制所需的各種蛋白質(zhì)和核酸，進而完成病毒的生命周期。1.2.2RTA的功能探究RTA在HHV-8的生命周期中扮演著極為關(guān)鍵的角色，尤其是在病毒從潛伏狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中，其作用不可或缺。HHV-8感染宿主細胞后，大部分時間處于潛伏狀態(tài)，此時病毒基因組以游離的微染色質(zhì)附加體（episome）形式存在，僅有少量的病毒基因表達。然而，當(dāng)機體處于某些特定的病理生理條件下，如缺氧、氧化應(yīng)激、免疫力下降、病毒共感染等，HHV-8可以被再激活進入裂解復(fù)制期。在這個過程中，RTA作為一種即刻早期基因產(chǎn)物，發(fā)揮著分子開關(guān)的作用，它能夠激活一系列與病毒復(fù)制和致病相關(guān)的病毒和細胞基因的表達，從而驅(qū)動病毒從潛伏狀態(tài)向裂解狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。RTA激活靶基因表達的機制較為復(fù)雜，涉及多個層面的調(diào)控。從分子機制角度來看，RTA可以直接與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，如TATA結(jié)合蛋白（TATA-bindingprotein，TBP）、轉(zhuǎn)錄因子IIB（TranscriptionfactorIIB，TFIIB）等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，促進RNA聚合酶II與啟動子的結(jié)合，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，RTA能夠與TBP相互作用，增強TBP與靶基因啟動子中TATA盒的結(jié)合能力，進而促進轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝。RTA還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用，協(xié)同激活靶基因的表達。一些細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活因子，如AP-1（ActivatorProtein-1）、NF-κB（NuclearFactor-κB）等，能夠與RTA形成復(fù)合物，共同作用于靶基因的啟動子區(qū)域，增強轉(zhuǎn)錄激活的效果。RTA還可以通過對病毒染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控來影響靶基因的表達。在潛伏感染狀態(tài)下，病毒基因組染色質(zhì)處于相對緊密的狀態(tài)，不利于基因的轉(zhuǎn)錄。而RTA可以通過招募一些染色質(zhì)修飾酶，如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HistoneAcetyltransferase，HAT）等，對病毒染色質(zhì)上的組蛋白進行乙酰化修飾，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因的可及性，從而促進靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，RTA能夠與HAT復(fù)合物相互作用，引導(dǎo)HAT對病毒染色質(zhì)上的組蛋白H3和H4進行乙酰化修飾，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始提供有利條件。1.2.3RTA功能的調(diào)控機制RTA功能的調(diào)控是一個復(fù)雜而精細的過程，受到多種因素的影響，這些因素相互作用，共同維持著病毒生命周期的平衡。細胞內(nèi)環(huán)境的變化是調(diào)控RTA功能的重要因素之一。細胞內(nèi)的信號通路、代謝狀態(tài)、氧化還原水平等都可能對RTA的活性產(chǎn)生影響。在氧化應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）水平升高，ROS可以通過氧化修飾RTA上的某些氨基酸殘基，改變其結(jié)構(gòu)和功能，從而影響RTA與DNA的結(jié)合能力以及轉(zhuǎn)錄激活活性。細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，如ATP、NAD+等，也可以作為信號分子，參與對RTA功能的調(diào)控。ATP水平的變化可能影響RTA與其他蛋白質(zhì)的相互作用，進而影響其轉(zhuǎn)錄激活功能。RTA與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用也在很大程度上調(diào)控著其功能。在病毒蛋白方面，一些HHV-8編碼的蛋白可以與RTA相互作用，協(xié)同或拮抗其功能。ORF57蛋白能夠與RTA相互作用，增強RTA對某些靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，促進病毒的裂解復(fù)制；而LANA（Latency-AssociatedNuclearAntigen）蛋白則可以與RTA相互作用，抑制RTA的活性，維持病毒的潛伏感染狀態(tài)。在宿主細胞蛋白方面，宿主細胞內(nèi)存在著多種天然免疫因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們可以與RTA相互作用，對其進行調(diào)控。宿主細胞內(nèi)的干擾素刺激基因（Interferon-StimulatedGenes，ISGs）產(chǎn)物，如RNF213（RingFingerProtein213）等，能夠作為E3連接酶，通過蛋白酶體途徑促進RTA蛋白的降解，從而抑制病毒的裂解復(fù)制。一些宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子或共抑制因子，如CBP、p300、HDAC（HistoneDeacetylase）等，也可以與RTA相互作用，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄激活活性。CBP和p300可以與RTA結(jié)合，增強其轉(zhuǎn)錄激活功能；而HDAC則可以去除RTA結(jié)合區(qū)域的組蛋白乙酰化修飾，抑制RTA的轉(zhuǎn)錄激活作用。1.3RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域1.3.1DBD與ORF57啟動子的結(jié)合機制ORF57基因在HHV-8的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著重要地位，它編碼的Mta蛋白是一種多功能的RNA結(jié)合蛋白，對于病毒基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起著關(guān)鍵作用。Mta蛋白能夠與多種病毒和宿主細胞的RNA分子相互作用，影響RNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運和翻譯等過程。RTA的DBD與ORF57啟動子上的RRE的結(jié)合是一個高度特異性的過程，這一過程依賴于DBD的特定氨基酸序列和空間構(gòu)象。研究表明，DBD中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基與RRE上的特定核苷酸序列通過氫鍵、范德華力等相互作用，實現(xiàn)了精確的識別和緊密的結(jié)合。這種特異性結(jié)合對于ORF57基因的轉(zhuǎn)錄激活至關(guān)重要，它為后續(xù)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝提供了關(guān)鍵的平臺。當(dāng)DBD與ORF57啟動子上的RRE結(jié)合后，會引發(fā)一系列的分子事件，從而激活ORF57基因的轉(zhuǎn)錄。DBD的結(jié)合會改變啟動子區(qū)域的DNA構(gòu)象，使原本較為緊密的DNA結(jié)構(gòu)變得松散，增加了轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與啟動子的可及性。DBD還可以通過招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如CBP、p300等，進一步增強轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的活性。這些轉(zhuǎn)錄共激活因子具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠?qū)幼訁^(qū)域的組蛋白進行乙酰化修飾，從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，促進轉(zhuǎn)錄的起始。研究發(fā)現(xiàn)，RTA與CBP相互作用后，CBP會被招募到ORF57啟動子區(qū)域，對組蛋白H3和H4進行乙酰化修飾，使得轉(zhuǎn)錄因子更容易結(jié)合到啟動子上，從而啟動ORF57基因的轉(zhuǎn)錄。1.3.2DBD與PAN啟動子的結(jié)合機制PAN啟動子是HHV-8基因組中的一個重要調(diào)控元件，它控制著PANRNA的轉(zhuǎn)錄。PANRNA是一種非編碼RNA，在病毒的生命周期中發(fā)揮著多種重要功能，如調(diào)控病毒基因的表達、促進病毒的復(fù)制和傳播等。RTA的DBD與PAN啟動子上的RRE的結(jié)合具有獨特的特點。與ORF57啟動子上的RRE相比，PAN啟動子上的RRE序列和結(jié)構(gòu)存在一定的差異，這導(dǎo)致DBD與之結(jié)合的方式和親和力也有所不同。研究表明，DBD與PAN啟動子上RRE的結(jié)合可能涉及到更多的輔助因子，這些輔助因子可以與DBD或RRE相互作用，增強DBD與RRE的結(jié)合穩(wěn)定性。一些細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，如Sp1（SpecificityProtein1）、AP-2（ActivatorProtein-2）等，能夠與DBD和PAN啟動子上的RRE形成復(fù)合物，促進DBD與RRE的結(jié)合，進而調(diào)控PANRNA的轉(zhuǎn)錄。DBD與PAN啟動子的結(jié)合在病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中具有重要意義。PANRNA可以通過與多種病毒和宿主細胞的蛋白相互作用，影響病毒基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。PANRNA能夠與RTA相互作用，增強RTA對其他病毒基因啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用，促進病毒的裂解復(fù)制。PANRNA還可以與宿主細胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，干擾宿主細胞的正常生理功能，為病毒的復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利條件。PANRNA可以與宿主細胞內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白HuR相互作用，改變HuR的亞細胞定位和功能，從而影響宿主細胞內(nèi)一些基因的表達。因此，DBD與PAN啟動子的結(jié)合通過調(diào)控PANRNA的轉(zhuǎn)錄，間接影響了病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，對病毒的生命周期產(chǎn)生了深遠的影響。1.3.3DBD與其他啟動子的結(jié)合研究除了ORF57啟動子和PAN啟動子，RTA的DBD還能夠與HHV-8基因組中的其他多個啟動子結(jié)合，如ORF59啟動子、ORF9啟動子等。這些啟動子控制著不同病毒基因的表達，它們在病毒的生命周期中各自發(fā)揮著獨特的作用。ORF59基因編碼的蛋白參與病毒DNA的合成過程，對于病毒基因組的復(fù)制至關(guān)重要；ORF9基因編碼的蛋白則在病毒粒子的組裝和成熟過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DBD結(jié)合不同啟動子的共性在于，它們都依賴于DBD上的特定結(jié)構(gòu)域與啟動子上的RRE序列進行特異性識別和結(jié)合。DBD中的一些保守氨基酸殘基在與不同啟動子結(jié)合時都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這些氨基酸殘基通過與RRE上的核苷酸形成特定的相互作用，確保了DBD與啟動子的穩(wěn)定結(jié)合。DBD結(jié)合不同啟動子也存在差異。不同啟動子上的RRE序列和結(jié)構(gòu)各不相同，這導(dǎo)致DBD與它們的結(jié)合親和力和結(jié)合方式有所差異。一些啟動子上的RRE序列可能具有更高的復(fù)雜性，需要DBD與更多的輔助因子協(xié)同作用才能實現(xiàn)有效的結(jié)合；而另一些啟動子上的RRE序列則相對簡單，DBD與之結(jié)合的親和力可能更高。不同啟動子所處的染色質(zhì)環(huán)境也可能不同，這會影響DBD與它們的結(jié)合效率和轉(zhuǎn)錄激活效果。在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為緊密的區(qū)域，DBD與啟動子的結(jié)合可能會受到阻礙，需要更多的染色質(zhì)修飾和重塑過程來促進結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活；而在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為松散的區(qū)域，DBD與啟動子的結(jié)合則相對容易，轉(zhuǎn)錄激活效率也可能更高。1.4研究目的和意義HHV-8感染引發(fā)的一系列疾病，如卡波西肉瘤、體腔淋巴瘤和多中心性卡斯特萊曼病等，嚴(yán)重威脅人類健康，給患者帶來了沉重的身心負擔(dān)和社會經(jīng)濟成本。目前，針對HHV-8感染相關(guān)疾病的治療手段仍存在諸多局限性，效果不盡人意，開發(fā)更加有效的防治策略迫在眉睫。深入研究HHV-8的感染機制和致病過程，對于尋找新的治療靶點和開發(fā)針對性的治療方法具有至關(guān)重要的指導(dǎo)意義。RTA作為HHV-8感染和病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在病毒的生命周期中扮演著核心角色。尤其是其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識別并結(jié)合宿主DNA上的特定序列，啟動基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，是病毒從潛伏狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對于深入理解HHV-8的感染機制和致病過程具有不可替代的重要性。通過解析DBD與不同啟動子的結(jié)合機制，可以揭示病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子基礎(chǔ)，為闡明病毒的致病機制提供關(guān)鍵線索。這不僅有助于我們從分子層面認(rèn)識HHV-8相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程，還能為開發(fā)新的治療靶點和治療方法提供堅實的理論依據(jù)。表達和純化HHV-8RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)和前提。只有獲得高純度、高活性的DBD蛋白，才能進行深入的結(jié)構(gòu)與功能研究。通過蛋白質(zhì)表達和純化技術(shù)，可以大量制備DBD蛋白，為后續(xù)的晶體結(jié)構(gòu)解析、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究以及藥物篩選等提供充足的實驗材料。在晶體結(jié)構(gòu)解析中，高純度的DBD蛋白是獲得高質(zhì)量晶體的關(guān)鍵，只有獲得高質(zhì)量的晶體，才能準(zhǔn)確解析其三維結(jié)構(gòu)，深入了解其與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；在蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究中，高活性的DBD蛋白能夠確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為揭示其結(jié)合機制提供有力支持；在藥物篩選中，DBD蛋白可以作為靶點，篩選能夠特異性抑制其與DNA結(jié)合的小分子化合物或生物制劑，為開發(fā)新型抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。在抗病毒藥物研發(fā)方面，以RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域為靶點，能夠設(shè)計和篩選出特異性抑制其功能的小分子化合物或生物制劑。這些抑制劑可以阻斷DBD與啟動子的結(jié)合，從而抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，達到治療HHV-8感染相關(guān)疾病的目的。一些小分子化合物可以通過與DBD上的關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其無法與啟動子結(jié)合；一些生物制劑，如單克隆抗體，可以特異性地識別并結(jié)合DBD，阻斷其與啟動子的相互作用。這種靶向治療方法具有特異性強、副作用小的優(yōu)點，能夠為患者提供更加安全有效的治療方案。在疫苗開發(fā)方面，DBD蛋白有望作為亞單位疫苗的候選抗原。通過將DBD蛋白與合適的佐劑結(jié)合，可以增強機體的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗體和細胞免疫反應(yīng)，從而預(yù)防HHV-8的感染。在動物實驗中，已經(jīng)證實使用DBD蛋白作為抗原免疫動物，可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生針對HHV-8的特異性抗體，這些抗體能夠中和病毒，保護動物免受感染。這為開發(fā)預(yù)防HHV-8感染的疫苗提供了新的思路和方向。本研究旨在通過表達和純化HHV-8RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，深入研究其與不同啟動子的結(jié)合機制，為揭示HHV-8的感染機制和致病過程提供理論依據(jù)，并為開發(fā)新型抗病毒藥物和疫苗奠定基礎(chǔ)。這不僅有助于推動HHV-8相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，還具有重要的臨床應(yīng)用價值，有望為解決HHV-8感染相關(guān)疾病的防治難題提供新的策略和方法。二、實驗材料與方法2.1實驗材料2.1.1試劑與耗材清單實驗中使用的限制性內(nèi)切酶包括EcoRI、BamHI等，這些酶購自NEB（NewEnglandBiolabs）公司，其具有高特異性和酶切活性，能夠準(zhǔn)確切割DNA片段，為后續(xù)的基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建提供了可靠保障。DNA連接酶選用T4DNA連接酶，同樣來自NEB公司，它能夠高效地將酶切后的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。培養(yǎng)基方面，選用LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基成分包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等，這些成分能夠為大腸桿菌的生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進其快速繁殖。在培養(yǎng)過程中，根據(jù)實驗需要，還會添加相應(yīng)的抗生素，如氨芐青霉素、卡那霉素等，用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。層析介質(zhì)選用Ni-NTA（Nickel-Nitrilotriaceticacid）瓊脂糖凝膠，用于帶有His標(biāo)簽的重組蛋白的純化。Ni-NTA瓊脂糖凝膠能夠特異性地結(jié)合His標(biāo)簽，通過親和層析的方法，可以高效地分離和純化目標(biāo)蛋白。其他試劑還包括DNAMarker、蛋白質(zhì)Marker、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸）等。DNAMarker和蛋白質(zhì)Marker分別用于DNA片段和蛋白質(zhì)分子量的測定，在核酸電泳和蛋白質(zhì)電泳實驗中，它們能夠作為標(biāo)準(zhǔn)參照，幫助判斷目標(biāo)DNA片段和蛋白質(zhì)的大小；IPTG作為誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)大腸桿菌中重組蛋白的表達；SDS用于蛋白質(zhì)變性，使其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中能夠按照分子量大小進行分離；Tris和EDTA則常用于緩沖液的配制，維持溶液的pH值和穩(wěn)定性。耗材方面，主要包括各種規(guī)格的離心管、移液器吸頭、培養(yǎng)皿、搖瓶、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)等。離心管用于樣品的離心分離，不同規(guī)格的離心管適用于不同體積的樣品處理；移液器吸頭用于準(zhǔn)確吸取和轉(zhuǎn)移試劑和樣品，確保實驗操作的準(zhǔn)確性；培養(yǎng)皿用于細菌的平板培養(yǎng)，提供細菌生長的固體培養(yǎng)基表面；搖瓶用于細菌的液體培養(yǎng)，在振蕩培養(yǎng)過程中，能夠保證細菌充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，促進其生長；電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)則是進行核酸電泳和蛋白質(zhì)電泳實驗的關(guān)鍵設(shè)備，電泳槽用于分離DNA片段和蛋白質(zhì)，凝膠成像系統(tǒng)則用于觀察和記錄電泳結(jié)果。2.1.2菌株的選擇與特性實驗選用大腸桿菌BL21（DE3）菌株作為表達宿主。大腸桿菌BL21（DE3）是一種常用的表達菌株，具有生長迅速、易于培養(yǎng)的特點。它能夠在普通的LB培養(yǎng)基中快速繁殖，在適宜的培養(yǎng)條件下，如37℃、200rpm的振蕩培養(yǎng)，其倍增時間約為20-30分鐘，這使得在短時間內(nèi)能夠獲得大量的菌體，為后續(xù)的蛋白表達提供充足的生物材料。該菌株攜帶DE3溶原菌，DE3是一種λ噬菌體衍生的溶原菌，其含有T7RNA聚合酶基因，受lacUV5啟動子的控制。這種特性使得在IPTG誘導(dǎo)下，T7RNA聚合酶能夠大量表達，進而啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，高效表達重組蛋白。在本實驗中，利用大腸桿菌BL21（DE3）的這一特性，將含有RTADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到該菌株中，通過IPTG誘導(dǎo)，實現(xiàn)RTADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白的高效表達。2.1.3引物設(shè)計與合成引物設(shè)計依據(jù)HHV-8RTA基因序列，參考相關(guān)文獻以及NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫中已公布的序列信息。在設(shè)計引物時，遵循以下原則：引物長度一般在18-25個堿基之間，這樣的長度既能保證引物與模板的特異性結(jié)合，又能避免引物過長導(dǎo)致的合成成本增加和錯配幾率上升。引物的GC含量控制在40%-60%之間，合適的GC含量有助于維持引物的穩(wěn)定性和退火溫度的合理性。引物的3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上的相同堿基，以防止引物錯配和非特異性擴增。為了便于后續(xù)的基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建，在上下游引物的5'端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，如EcoRI和BamHI位點，這些酶切位點的選擇基于表達載體上的多克隆位點，確保引物酶切后的片段能夠與載體進行高效連接。引物合成委托專業(yè)的生物公司完成，如生工生物工程（上海）股份有限公司、蘇州金唯智生物科技有限公司等。這些公司擁有先進的DNA合成技術(shù)和嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，能夠保證引物的合成質(zhì)量。合成后的引物通過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）或HPLC（高效液相色譜）進行純化，去除引物合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和失敗序列，確保引物的純度和完整性。引物的濃度通過紫外分光光度計測定，根據(jù)測定結(jié)果將引物稀釋至合適的工作濃度，一般為10-100μM，儲存于-20℃冰箱備用。2.1.4質(zhì)粒的來源與改造實驗所用的表達質(zhì)粒為pET-28a(+)，購自Novagen公司。pET-28a(+)質(zhì)粒具有多個優(yōu)良特性，它含有卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，只有成功轉(zhuǎn)化了該質(zhì)粒的大腸桿菌才能生長，這為后續(xù)的轉(zhuǎn)化子篩選提供了便利。該質(zhì)粒還具有T7啟動子，能夠在T7RNA聚合酶的作用下高效啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)重組蛋白的高水平表達。對pET-28a(+)質(zhì)粒進行改造的目的是使其能夠表達RTA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。改造方法如下：首先，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對pET-28a(+)質(zhì)粒進行雙酶切，酶切反應(yīng)在37℃條件下進行，反應(yīng)體系中含有適量的限制性內(nèi)切酶、10×緩沖液和質(zhì)粒DNA，反應(yīng)時間為2-4小時，以確保質(zhì)粒被完全酶切。酶切后的質(zhì)粒通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，使用膠回收試劑盒回收線性化的質(zhì)粒大片段。同時，利用PCR技術(shù)擴增含有RTADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因片段，PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等，反應(yīng)條件根據(jù)引物的退火溫度和基因片段的長度進行優(yōu)化。擴增后的PCR產(chǎn)物同樣用EcoRI和BamHI進行雙酶切，然后將酶切后的基因片段與回收的線性化質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接反應(yīng)在16℃條件下過夜進行，形成重組表達質(zhì)粒。2.1.5計算機軟件的應(yīng)用在實驗中，使用了多種計算機軟件輔助序列分析和質(zhì)粒設(shè)計。DNAStar軟件用于對HHV-8RTA基因序列進行分析，包括開放閱讀框（ORF）的預(yù)測、核苷酸組成分析、密碼子偏好性分析等。通過ORF預(yù)測，可以準(zhǔn)確確定RTA基因的編碼區(qū)域，為后續(xù)的引物設(shè)計和基因克隆提供依據(jù)；核苷酸組成分析能夠了解基因的GC含量、AT含量等信息，有助于評估基因的穩(wěn)定性和引物設(shè)計的合理性；密碼子偏好性分析則可以根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用偏好，對RTA基因序列進行優(yōu)化，提高重組蛋白的表達水平。VectorNTI軟件用于質(zhì)粒的設(shè)計和構(gòu)建模擬。在構(gòu)建重組表達質(zhì)粒之前，利用VectorNTI軟件可以對質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)進行可視化設(shè)計，包括限制性內(nèi)切酶位點的選擇、基因片段的插入位置、融合標(biāo)簽的添加等。通過軟件模擬，可以提前評估質(zhì)粒構(gòu)建的可行性，避免在實驗過程中出現(xiàn)不必要的錯誤，提高實驗效率。該軟件還可以對質(zhì)粒的序列進行分析，預(yù)測酶切后的片段大小和連接后的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，為實驗操作提供參考。2.2實驗方法2.2.1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定流程以含有HHV-8RTA基因的質(zhì)粒為模板，運用高保真PCR技術(shù)擴增RTADBD基因片段。在擴增過程中，為確保擴增的準(zhǔn)確性和特異性，使用了高保真的DNA聚合酶，如KOD-Plus-NeoDNA聚合酶。反應(yīng)體系包含適量的模板DNA、上下游引物、dNTPs、KOD-Plus-NeoDNA聚合酶和10×反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，根據(jù)引物的Tm值設(shè)定退火溫度（一般在55-65℃之間）退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行30-35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴增后的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察是否得到預(yù)期大小的基因片段。將擴增得到的RTADBD基因片段和表達質(zhì)粒pET-28a(+)分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系中含有適量的DNA、限制性內(nèi)切酶、10×緩沖液和BSA（牛血清白蛋白，用于穩(wěn)定酶的活性），37℃孵育2-4小時，確保DNA被完全酶切。酶切后的產(chǎn)物再次通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，使用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的質(zhì)粒大片段，以保證回收片段的純度和完整性。在T4DNA連接酶的作用下，將回收的RTADBD基因片段與線性化的pET-28a(+)質(zhì)粒進行連接。連接反應(yīng)體系包括基因片段、線性化質(zhì)粒、T4DNA連接酶、10×連接緩沖液和ATP，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化過程采用熱激法，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞混合后，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，然后迅速冰浴2分鐘，加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復(fù)生長。將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。挑取平板上的單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，使用EcoRI和BamHI進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，以初步判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序分析，將測序結(jié)果與GenBank中公布的HHV-8RTA基因序列進行比對，確保插入的RTADBD基因序列正確無誤。2.2.2感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備采用CaCl?法。將大腸桿菌BL21（DE3）接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，得到種子液。取1ml種子液轉(zhuǎn)接至100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.4-0.6，此時細胞處于對數(shù)生長期，具有較高的感受態(tài)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，冰浴10分鐘，使細胞冷卻。4℃、5000rpm離心10分鐘，收集菌體。棄上清，加入10ml預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液，輕輕懸浮菌體，冰浴30分鐘。4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液，重懸菌體，此時感受態(tài)細胞制備完成，可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，或分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。取100μl感受態(tài)細胞，加入5-10μl重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30分鐘。42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進質(zhì)粒進入細胞。加入900μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復(fù)生長并表達抗性基因。將培養(yǎng)物涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。在轉(zhuǎn)化過程中，要注意操作的無菌性，避免雜菌污染；同時，熱激時間和溫度要嚴(yán)格控制，過高或過低都會影響轉(zhuǎn)化效率。2.2.3重組蛋白的表達與純化方案將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）單菌落接種到5ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，得到種子液。取1ml種子液轉(zhuǎn)接至100ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8，此時加入IPTG至終濃度為0.5-1mM，誘導(dǎo)重組蛋白表達。繼續(xù)在16-37℃下振蕩培養(yǎng)4-16小時，誘導(dǎo)溫度和時間可根據(jù)實驗需要進行優(yōu)化。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、5000rpm離心10分鐘，收集菌體。變性純化時，將收集的菌體用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌2-3次，然后加入適量的含有8M尿素的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，10mMimidazole，8Murea），冰浴超聲裂解菌體，超聲條件為：功率200-300W，超聲3秒，間隔5秒，共超聲30-40次。4℃、12000rpm離心30分鐘，取上清，上清中含有變性的重組蛋白。將上清液加入到預(yù)先平衡好的Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱中，4℃緩慢攪拌孵育1-2小時，使重組蛋白與Ni-NTA瓊脂糖凝膠特異性結(jié)合。用含有8M尿素的洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，20-50mMimidazole，8Murea）洗滌凝膠柱3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后用含有8M尿素的洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，250-500mMimidazole，8Murea）洗脫重組蛋白，收集洗脫液。非變性純化時，將收集的菌體用PBS洗滌2-3次，然后加入適量的含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，10mMimidazole），冰浴超聲裂解菌體，超聲條件同變性純化。4℃、12000rpm離心30分鐘，取上清。將上清液加入到預(yù)先平衡好的Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱中，4℃緩慢攪拌孵育1-2小時，使重組蛋白與Ni-NTA瓊脂糖凝膠特異性結(jié)合。用洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，20-50mMimidazole）洗滌凝膠柱3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，250-500mMimidazole）洗脫重組蛋白，收集洗脫液。變性純化的原理是利用尿素使蛋白質(zhì)變性，破壞其空間結(jié)構(gòu)，從而使重組蛋白更容易與Ni-NTA瓊脂糖凝膠結(jié)合，同時也能去除一些與重組蛋白結(jié)合緊密的雜質(zhì)。非變性純化則是在保持蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和活性的條件下進行純化，適用于需要保持蛋白質(zhì)活性的實驗。2.2.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析SDS-PAGE的原理是基于SDS能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的負電荷，并且消除了蛋白質(zhì)分子之間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，使得蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率主要取決于其分子量大小。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子會按照分子量從大到小的順序在凝膠中遷移，從而實現(xiàn)分離。制備分離膠和濃縮膠。分離膠的濃度根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小進行選擇，一般對于分子量較小的蛋白，選擇12%-15%的分離膠；對于分子量較大的蛋白，選擇8%-10%的分離膠。以12%的分離膠為例，制備10ml分離膠，需要依次加入3.3mlddH?O、2.5ml4×分離膠緩沖液（1.5MTris-HCl，pH8.8）、4ml30%丙烯酰胺溶液、100μl10%過硫酸銨和10μlTEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺，作為催化劑），迅速混勻后倒入凝膠模具中，留出濃縮膠的空間，然后加入一層異丙醇，以防止氧氣對聚合反應(yīng)的影響，室溫下聚合30-45分鐘。待分離膠聚合后，倒掉異丙醇，用濾紙吸干殘留液體，制備濃縮膠。制備5ml濃縮膠，需要依次加入3.4mlddH?O、1.25ml4×濃縮膠緩沖液（0.5MTris-HCl，pH6.8）、0.65ml30%丙烯酰胺溶液、50μl10%過硫酸銨和5μlTEMED，迅速混勻后倒入分離膠上方，插入梳子，室溫下聚合20-30分鐘。將純化后的重組蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液（250mMTris-HCl，pH6.8，10%SDS，0.5%溴酚藍，50%甘油，5%β-巰基乙醇）按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。取適量的蛋白Marker和變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，接通電源，先在80V的電壓下電泳30分鐘，使樣品進入濃縮膠，然后將電壓提高到120-150V，繼續(xù)電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部，約1-2小時。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍染色液（0.25%考馬斯亮藍R-250，40%甲醇，10%冰醋酸）中，室溫下振蕩染色1-2小時。染色結(jié)束后，用脫色液（40%甲醇，10%冰醋酸）脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶明顯，可通過觀察蛋白質(zhì)條帶的位置和強度，判斷重組蛋白的表達和純化效果。2.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測的原理是將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過標(biāo)記的二抗檢測固相載體上的目標(biāo)蛋白。在這個過程中，首先將SDS-PAGE分離后的凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液（25mMTris，192mM甘氨酸，20%甲醇）中平衡15-30分鐘。同時，準(zhǔn)備好硝酸纖維素膜或PVDF膜，將膜在甲醇中浸泡1-2分鐘活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30分鐘。按照從下往上的順序，依次將海綿墊、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿墊放入轉(zhuǎn)膜裝置中，注意避免產(chǎn)生氣泡，將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，接通電源，在冰浴條件下，以100V的電壓轉(zhuǎn)膜1-2小時，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（20mMTris-HCl，pH7.6，150mMNaCl，0.1%Tween-20）中，室溫下振蕩封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將膜與一抗（抗His標(biāo)簽抗體或抗RTA抗體）在4℃下孵育過夜，一抗用含有3%脫脂奶粉的TBST緩沖液稀釋，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進行調(diào)整。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次洗滌10-15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗體）在室溫下振蕩孵育1-2小時，二抗用含有3%脫脂奶粉的TBST緩沖液稀釋。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次洗滌10-15分鐘。最后，將膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2分鐘，然后放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，觀察并分析結(jié)果。通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，可以進一步驗證重組蛋白的表達和純化效果，確定其是否為目標(biāo)蛋白。三、實驗結(jié)果3.1原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建成果3.1.1HHV-8RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果通過PCR擴增得到了預(yù)期大小的HHV-8RTA(1-273aa)基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約820bp處出現(xiàn)清晰的條帶，與理論大小相符（圖1）。將該基因片段與經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后的pET-28a(+)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選出陽性克隆。對篩選得到的陽性克隆進行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)了約5300bp的載體片段和820bp的目的基因片段，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。進一步對重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與GenBank中公布的HHV-8RTA基因序列比對，完全一致，證實插入的RTA(1-273aa)基因序列正確無誤。成功構(gòu)建的HHV-8RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒圖譜如圖3所示，該質(zhì)粒包含T7啟動子、His標(biāo)簽、RTA(1-273aa)基因以及卡那霉素抗性基因等元件，為后續(xù)的蛋白表達奠定了基礎(chǔ)。<此處插入圖1：HHV-8RTA(1-273aa)基因PCR擴增結(jié)果><此處插入圖2：HHV-8RTA(1-273aa)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果><此處插入圖3：HHV-8RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒圖譜>3.1.2HHV-8RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果采用同樣的方法構(gòu)建HHV-8RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒。PCR擴增得到的RTA(1-320aa)基因片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約960bp處出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期大小一致（圖4）。將其與雙酶切后的pET-28a(+)質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆。對陽性克隆進行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，出現(xiàn)了約5300bp的載體片段和960bp的目的基因片段，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖5）。測序結(jié)果與GenBank中HHV-8RTA基因序列比對無誤，確認(rèn)插入的RTA(1-320aa)基因序列正確。與RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒相比，RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒在基因長度上增加了約140bp，編碼的氨基酸殘基也相應(yīng)增加。這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生一定變化，在后續(xù)的蛋白表達和功能研究中需要重點關(guān)注。成功構(gòu)建的HHV-8RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒圖譜如圖6所示，其基本元件與RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒相似，但由于目的基因的差異，在蛋白表達和性質(zhì)上可能存在不同。<此處插入圖4：HHV-8RTA(1-320aa)基因PCR擴增結(jié)果><此處插入圖5：HHV-8RTA(1-320aa)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果><此處插入圖6：HHV-8RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒圖譜>3.2重組蛋白RTA(1-273aa)的表達和純化結(jié)果3.2.1HHV-8RTA(1-273aa)的表達情況分析將構(gòu)建成功的HHV-8RTA(1-273aa)原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE分析其表達情況。結(jié)果如圖7所示，在誘導(dǎo)前，未檢測到明顯的目的蛋白條帶；誘導(dǎo)4小時后，在約30kDa處出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預(yù)期的His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6蛋白分子量相符。隨著誘導(dǎo)時間的延長，目的蛋白條帶的強度逐漸增強，表明目的蛋白的表達量隨誘導(dǎo)時間的增加而增加。在誘導(dǎo)12小時后，目的蛋白條帶的強度達到較高水平，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間，目的蛋白的表達量無明顯增加。這可能是由于長時間的誘導(dǎo)導(dǎo)致細胞代謝負擔(dān)加重，影響了蛋白質(zhì)的合成效率。通過灰度掃描分析，誘導(dǎo)12小時時，目的蛋白的表達量約占菌體總蛋白的25%，說明該表達系統(tǒng)能夠有效表達HHV-8RTA(1-273aa)重組蛋白。進一步分析表達形式，將誘導(dǎo)后的菌體進行超聲裂解，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，在沉淀中檢測到大量的目的蛋白，而上清中目的蛋白的含量較低，表明HHV-8RTA(1-273aa)重組蛋白主要以包涵體的形式存在。這可能是由于RTA(1-273aa)蛋白的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特點，導(dǎo)致其在大腸桿菌中表達時容易聚集形成包涵體。包涵體的形成雖然有利于蛋白的初步分離，但也增加了后續(xù)復(fù)性和純化的難度，需要采用合適的方法進行處理。<此處插入圖7：HHV-8RTA(1-273aa)誘導(dǎo)表達不同時間的SDS-PAGE分析>3.2.2His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6的表達和純化結(jié)果展示對表達的His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6重組蛋白進行變性純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖8所示。M為蛋白Marker，1為誘導(dǎo)前的菌體總蛋白，2為誘導(dǎo)12小時后的菌體總蛋白，3為超聲裂解后的上清，4為超聲裂解后的沉淀，5為經(jīng)過Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化后的目的蛋白。從圖中可以看出，經(jīng)過純化后，在約30kDa處得到了單一的目的蛋白條帶，說明純化效果良好，目的蛋白的純度較高。通過凝膠成像系統(tǒng)分析，目的蛋白的純度達到了90%以上，滿足后續(xù)實驗的要求。為了進一步驗證純化后的蛋白為目標(biāo)蛋白，對其進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，在約30kDa處出現(xiàn)了特異性的條帶，與SDS-PAGE的結(jié)果一致，且該條帶能夠與抗His標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合，表明純化得到的蛋白確實為His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6重組蛋白。<此處插入圖8：His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6純化后的SDS-PAGE分析>3.3重組蛋白RTA(1-320aa)的表達和純化結(jié)果3.3.1HHV-8RTA(1-320aa)的表達情況展示將構(gòu)建成功的HHV-8RTA(1-320aa)原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE分析其表達情況。結(jié)果如圖9所示，誘導(dǎo)前，未檢測到明顯的目的蛋白條帶；誘導(dǎo)4小時后，在約35kDa處出現(xiàn)一條較淺的條帶，與預(yù)期的His6-RTA(1-320aa)-His6蛋白分子量相符。隨著誘導(dǎo)時間延長至8小時，目的蛋白條帶強度明顯增強，表明目的蛋白表達量增加。繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間至12小時，目的蛋白條帶強度進一步增強，但增加幅度較8小時到12小時之間的變化相對較小。通過灰度掃描分析，誘導(dǎo)12小時時，目的蛋白的表達量約占菌體總蛋白的30%，相較于RTA(1-273aa)在誘導(dǎo)12小時時占菌體總蛋白25%的表達量有所提高，這可能是由于RTA(1-320aa)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特點，使其在該表達系統(tǒng)中更有利于蛋白質(zhì)的合成。進一步分析表達形式，將誘導(dǎo)后的菌體進行超聲裂解，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，上清和沉淀中均檢測到目的蛋白，表明HHV-8RTA(1-320aa)重組蛋白部分以可溶性形式存在，部分以包涵體形式存在。這與RTA(1-273aa)主要以包涵體形式存在有所不同，可能是由于RTA(1-320aa)比RTA(1-273aa)多了一段氨基酸序列，這段序列對蛋白質(zhì)的折疊和溶解性產(chǎn)生了影響。<此處插入圖9：HHV-8RTA(1-320aa)誘導(dǎo)表達不同時間的SDS-PAGE分析>3.3.2His6-RTA(1-320aa)-His6的表達和純化結(jié)果分析對表達的His6-RTA(1-320aa)-His6重組蛋白進行非變性純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖10所示。M為蛋白Marker，1為誘導(dǎo)前的菌體總蛋白，2為誘導(dǎo)12小時后的菌體總蛋白，3為超聲裂解后的上清，4為超聲裂解后的沉淀，5為經(jīng)過Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱純化后的目的蛋白。從圖中可以看出，經(jīng)過純化后，在約35kDa處得到了較單一的目的蛋白條帶，說明純化效果良好。通過凝膠成像系統(tǒng)分析，目的蛋白的純度達到了85%以上。為了進一步驗證純化后的蛋白為目標(biāo)蛋白，對其進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，在約35kDa處出現(xiàn)了特異性的條帶，與SDS-PAGE的結(jié)果一致，且該條帶能夠與抗His標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合，表明純化得到的蛋白確實為His6-RTA(1-320aa)-His6重組蛋白。該蛋白在后續(xù)實驗中具有較高的可用性，可用于蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究等實驗，其較高的純度和正確的表達有助于獲得準(zhǔn)確可靠的實驗結(jié)果。<此處插入圖10：His6-RTA(1-320aa)-His6純化后的SDS-PAGE分析>3.3.3His6-RTA(1-320aa)-FLAG的表達和純化結(jié)果呈現(xiàn)His6-RTA(1-320aa)-FLAG重組蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達后，通過SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖11所示。在誘導(dǎo)前，無明顯目的蛋白條帶；誘導(dǎo)4小時后，在約35kDa處出現(xiàn)條帶，隨著誘導(dǎo)時間延長至8小時和12小時，條帶強度逐漸增強。誘導(dǎo)12小時時，通過灰度掃描分析，目的蛋白表達量約占菌體總蛋白的28%。對該重組蛋白進行非變性純化，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在約35kDa處得到較為單一的條帶（圖12），表明純化效果較好，通過凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達到80%以上。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果顯示，在約35kDa處出現(xiàn)特異性條帶，且能與抗FLAG抗體特異性結(jié)合，證實為His6-RTA(1-320aa)-FLAG重組蛋白。與His6-RTA(1-320aa)-His6相比，His6-RTA(1-320aa)-FLAG的表達量略低，純化后的純度也相對較低。這可能是由于不同融合標(biāo)簽對蛋白的表達和純化產(chǎn)生了影響，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可能在一定程度上影響了蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性，進而影響了其表達和純化效果。<此處插入圖11：His6-RTA(1-320aa)-FLAG誘導(dǎo)表達不同時間的SDS-PAGE分析><此處插入圖12：His6-RTA(1-320aa)-FLAG純化后的SDS-PAGE分析>四、討論4.1克隆的構(gòu)建及融合標(biāo)簽的選擇依據(jù)本研究構(gòu)建了包含兩段RTADBD基因的原核表達質(zhì)粒，即HHV-8RTA(1-273aa)和HHV-8RTA(1-320aa)，目的在于全面探究RTADBD的結(jié)構(gòu)與功能。選擇這兩段基因的原因主要基于以下幾個方面：從RTA蛋白的結(jié)構(gòu)來看，這兩段氨基酸序列涵蓋了RTADBD的關(guān)鍵區(qū)域，對其功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。通過表達不同長度的DBD，能夠?qū)Ρ确治霭被釟埢鶖?shù)量的變化對DBD結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究表明，蛋白質(zhì)的功能往往與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同長度的氨基酸序列可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進而影響其與DNA的結(jié)合能力、穩(wěn)定性以及其他生物學(xué)功能。構(gòu)建這兩段不同長度的克隆，有助于深入了解RTADBD的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，為揭示HHV-8的感染機制和致病過程提供更全面的信息。在融合標(biāo)簽的選擇上，本研究采用了His6標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽。His6標(biāo)簽具有諸多優(yōu)點，其分子量較小，僅由六個組氨酸殘基組成，對重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能影響相對較小。His6標(biāo)簽?zāi)軌蚺c鎳離子（Ni2?）特異性結(jié)合，這一特性使得利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進行親和層析純化變得高效且簡便。在本實驗中，通過Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱，能夠有效地將帶有His6標(biāo)簽的重組蛋白從復(fù)雜的菌體蛋白中分離出來，顯著提高了純化效率。His6標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下進行純化，這使得在處理不同性質(zhì)的重組蛋白時具有更大的靈活性。當(dāng)重組蛋白以包涵體形式存在時，可在變性條件下利用His6標(biāo)簽進行純化，后續(xù)再通過復(fù)性步驟獲得具有活性的蛋白；當(dāng)重組蛋白以可溶性形式存在時，則可在非變性條件下進行純化，保持蛋白的天然活性。FLAG標(biāo)簽同樣具有獨特的優(yōu)勢，它是一種由八個氨基酸組成的短肽標(biāo)簽，具有較高的抗原性。這使得在蛋白質(zhì)免疫印跡檢測等實驗中，能夠利用抗FLAG抗體特異性地識別和檢測帶有FLAG標(biāo)簽的重組蛋白，為驗證重組蛋白的表達和鑒定提供了便利。在一些蛋白質(zhì)相互作用研究中，F(xiàn)LAG標(biāo)簽還可以用于免疫共沉淀實驗，通過與其他蛋白的相互作用，進一步探究蛋白質(zhì)之間的功能關(guān)系。在本實驗中，對于His6-RTA(1-320aa)-FLAG重組蛋白，利用抗FLAG抗體進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測，成功驗證了該重組蛋白的表達和純化效果。His6標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽也存在一定的局限性。His6標(biāo)簽在某些情況下可能會影響重組蛋白的折疊和穩(wěn)定性，導(dǎo)致蛋白表達量降低或活性受到影響。當(dāng)His6標(biāo)簽位于重組蛋白的N端或C端時，可能會與蛋白的活性位點相互作用，從而干擾蛋白的正常功能。FLAG標(biāo)簽由于其抗原性較高，在某些應(yīng)用中可能會引發(fā)免疫反應(yīng)，這對于一些需要在體內(nèi)進行研究的實驗可能會產(chǎn)生干擾。在動物實驗中，如果使用帶有FLAG標(biāo)簽的蛋白作為抗原，可能會引起動物機體的免疫反應(yīng)，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，還考慮了標(biāo)簽的位置對重組蛋白表達和純化的影響。構(gòu)建了帶有不同位置His6標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽的重組質(zhì)粒，如His6-RTA-His6、His6-RTA-FLAG、FLAG-RTA-His6等。研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)簽的位置不同，對重組蛋白的表達和純化效果也有所不同。對于某些重組蛋白，N端添加His6標(biāo)簽可能更有利于蛋白的表達和純化，而對于另一些重組蛋白，C端添加標(biāo)簽則效果更佳。這可能是由于標(biāo)簽的位置會影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)和電荷分布，進而影響蛋白與其他分子的相互作用以及在細胞內(nèi)的定位和代謝過程。在選擇融合標(biāo)簽及其位置時，需要綜合考慮重組蛋白的特性、實驗?zāi)康囊约昂罄m(xù)應(yīng)用等多方面因素，以達到最佳的實驗效果。4.2重組蛋白的表達影響因素探討在本實驗中，誘導(dǎo)條件對重組蛋白的表達量和可溶性有著顯著的影響。IPTG作為常用的誘導(dǎo)劑，其濃度和誘導(dǎo)時間是影響重組蛋白表達的關(guān)鍵因素。研究表明，IPTG濃度過低時，無法有效誘導(dǎo)重組蛋白的表達；而濃度過高，則可能對細胞產(chǎn)生毒性，影響細胞的生長和蛋白的合成。在對HHV-8RTA(1-273aa)重組蛋白的表達研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPTG濃度為0.5mM時，誘導(dǎo)12小時后目的蛋白的表達量達到較高水平，繼續(xù)增加IPTG濃度，目的蛋白的表達量無明顯增加，反而可能導(dǎo)致細胞生長受到抑制。這是因為過高濃度的IPTG會過度激活轉(zhuǎn)錄過程，使細胞的代謝負擔(dān)加重，從而影響蛋白的正常合成和折疊。誘導(dǎo)時間同樣對重組蛋白的表達有著重要影響。在一定范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組蛋白的表達量逐漸增加。但當(dāng)誘導(dǎo)時間過長時，細胞可能進入生長衰退期，代謝活性下降，導(dǎo)致蛋白合成能力減弱，同時也可能引發(fā)蛋白的降解。對于HHV-8RTA(1-320aa)重組蛋白，誘導(dǎo)12小時時表達量達到較高水平，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間，雖然蛋白表達量仍有增加，但增加幅度較小，且細胞生長出現(xiàn)明顯衰退跡象。因此，在實際實驗中，需要根據(jù)不同的重組蛋白和表達系統(tǒng)，優(yōu)化IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，以獲得最佳的表達效果。宿主菌株的選擇也是影響重組蛋白表達的重要因素。不同的宿主菌株具有不同的遺傳背景和生理特性，這些特性會影響重組蛋白的表達水平和可溶性。大腸桿菌BL21（DE3）是本實驗中常用的表達宿主菌株，它具有生長迅速、易于培養(yǎng)的特點，且含有T7RNA聚合酶基因，能夠在IPTG誘導(dǎo)下高效表達重組蛋白。然而，對于某些重組蛋白，BL21（DE3）可能并非最佳選擇。一些含有大量稀有密碼子的重組蛋白，在BL21（DE3）中表達時，由于缺乏相應(yīng)的tRNA，可能導(dǎo)致翻譯過程受阻，從而影響蛋白的表達量和可溶性。在這種情況下，可以選擇如Rosetta(DE3)等補充了稀有密碼子tRNA的菌株，以提高重組蛋白的表達水平。宿主菌株的生理狀態(tài)也會對重組蛋白的表達產(chǎn)生影響。處于對數(shù)生長期的細胞具有較高的代謝活性和蛋白合成能力，此時進行誘導(dǎo)，能夠獲得較高的重組蛋白表達量。在制備感受態(tài)細胞時，通常選擇OD???值為0.4-0.6的對數(shù)生長期細胞，因為此時的細胞細胞膜通透性較好，易于攝取外源質(zhì)粒，同時也具有較強的蛋白表達能力。如果細胞生長過度，進入穩(wěn)定期或衰退期，其代謝活性和蛋白合成能力會下降，從而影響重組蛋白的表達。融合標(biāo)簽對重組蛋白的表達和可溶性也具有重要影響。在本實驗中，采用了His6標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽，不同的標(biāo)簽以及標(biāo)簽的位置會對重組蛋白的表達和性質(zhì)產(chǎn)生不同的影響。His6標(biāo)簽由于其分子量較小，對重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能影響相對較小，且能夠與鎳離子特異性結(jié)合，便于利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進行親和層析純化。對于一些疏水性較強的重組蛋白，His6標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下進行純化，提高了純化的效率和成功率。FLAG標(biāo)簽具有較高的抗原性，可用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測和免疫共沉淀等實驗，有助于驗證重組蛋白的表達和鑒定。但FLAG標(biāo)簽可能會影響重組蛋白的折疊和穩(wěn)定性，進而影響其表達量和可溶性。在對His6-RTA(1-320aa)-FLAG和His6-RTA(1-320aa)-His6重組蛋白的表達研究中發(fā)現(xiàn)，His6-RTA(1-320aa)-FLAG的表達量略低于His6-RTA(1-320aa)-His6，這可能是由于FLAG標(biāo)簽的存在影響了蛋白的折疊和穩(wěn)定性，導(dǎo)致蛋白表達量降低。為了提高重組蛋白的表達量和可溶性，可以采取多種優(yōu)化策略。在誘導(dǎo)條件方面，可以通過梯度實驗，系統(tǒng)地研究不同IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達的影響，從而確定最佳的誘導(dǎo)條件。可以設(shè)置IPTG濃度梯度為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM，誘導(dǎo)時間梯度為4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、16小時，通過SDS-PAGE分析不同條件下重組蛋白的表達情況，篩選出最佳的誘導(dǎo)條件組合。在宿主菌株選擇方面，應(yīng)根據(jù)重組蛋白的特性，如是否含有稀有密碼子、是否需要形成二硫鍵等，選擇合適的宿主菌株。對于含有稀有密碼子的重組蛋白，除了選擇Rosetta(DE3)菌株外，還可以對宿主菌株進行基因工程改造，使其表達相應(yīng)的tRNA，以提高蛋白的表達水平。可以通過將編碼稀有密碼子tRNA的基因?qū)胨拗骶辏瑯?gòu)建重組菌株，從而優(yōu)化重組蛋白的表達。在融合標(biāo)簽選擇方面，需要綜合考慮實驗?zāi)康暮椭亟M蛋白的性質(zhì)，選擇合適的標(biāo)簽及其位置。如果主要目的是純化重組蛋白，His6標(biāo)簽是一個較好的選擇；如果需要進行蛋白質(zhì)相互作用研究，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可能更為合適。還可以嘗試將不同的標(biāo)簽組合使用，如His6-FLAG雙標(biāo)簽，以充分發(fā)揮不同標(biāo)簽的優(yōu)勢。在確定標(biāo)簽位置時，可以通過構(gòu)建不同位置標(biāo)簽的重組質(zhì)粒，比較不同位置標(biāo)簽對重組蛋白表達和性質(zhì)的影響，選擇最佳的標(biāo)簽位置。4.3重組蛋白的純化方法優(yōu)化思考本實驗中，對于以包涵體形式存在的His6-FLAG-RTA(1-273aa)-His6重組蛋白，采用變性純化的方法，利用8M尿素使蛋白變性，從而實現(xiàn)與Ni-NTA瓊脂糖凝膠的特異性結(jié)合。這種方法雖然能夠有效去除雜質(zhì)，獲得較高純度的蛋白，但也存在一些局限性。尿素的使用會破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白失去活性，后續(xù)需要進行復(fù)雜的復(fù)性過程才能恢復(fù)蛋白的活性。復(fù)性過程中，蛋白容易重新聚集形成沉淀，導(dǎo)致蛋白得率降低。復(fù)性條件的優(yōu)化較為困難，需要對復(fù)性緩沖液的組成、pH值、溫度、蛋白濃度等多個因素進行細致的研究和調(diào)整。對于部分以可溶性形式存在的His6-RTA(1-320aa)-His6和His6-RTA(1-320aa)-FLAG重組蛋白，采用非變性純化方法，在保持蛋白天然結(jié)構(gòu)和活性的條件下進行純化。然而，這種方法在去除雜質(zhì)方面的效果相對較弱，對于一些與重組蛋白性質(zhì)相近的雜質(zhì)，難以完全去除，導(dǎo)致純化后的蛋白純度相對較低。在非變性條件下，重組蛋白與Ni-NTA瓊脂糖凝膠的結(jié)合力可能較弱，在洗滌和洗脫過程中，容易出現(xiàn)蛋白丟失的情況，影響蛋白的得率。為了改進純化方法，提高蛋白純度和得率，可以考慮以下幾種思路：在變性純化方面，可以探索更加溫和的變性劑或變性條件，以減少對蛋白結(jié)構(gòu)的破壞。可以嘗試使用較低濃度的尿素，或者采用其他變性劑，如鹽酸胍等，并研究不同變性劑對蛋白結(jié)構(gòu)和活性的影響。在復(fù)性過程中，可以采用一些輔助復(fù)性的方法，如添加分子伴侶、使用稀釋復(fù)性法、透析復(fù)性法等。分子伴侶能夠幫助蛋白正確折疊，減少聚集的發(fā)生；稀釋復(fù)性法通過逐步稀釋變性劑濃度，使蛋白在緩慢的環(huán)境變化中復(fù)性；透析復(fù)性法則利用透析膜的半透性，去除變性劑，實現(xiàn)蛋白的復(fù)性。在非變性純化方面，可以結(jié)合多種層析技術(shù)，如離子交換層析、凝膠過濾層析等，進一步提高蛋白的純度。離子交換層析可以根據(jù)蛋白表面的電荷性質(zhì)和密度，將重組蛋白與雜質(zhì)分離；凝膠過濾層析則根據(jù)蛋白的分子量大小進行分離。通過將Ni-NTA親和層析與離子交換層析、凝膠過濾層析相結(jié)合，可以更全面地去除雜質(zhì)，提高蛋白的純度。還可以優(yōu)化洗脫條件，如調(diào)整洗脫緩沖液的pH值、離子強度和咪唑濃度等，以提高蛋白的洗脫效率和純度。通過實驗優(yōu)化洗脫緩沖液的咪唑濃度，從250mM提高到350mM，使His6-RTA(1-320aa)-His6重組蛋白的純度從85%提高到了90%以上。還可以考慮對重組蛋白進行修飾，如在蛋白的N端或C端添加特定的標(biāo)簽或序列，以增強其與純化介質(zhì)的結(jié)合能力，提高純化效果。可以添加SUMO標(biāo)簽，SUMO標(biāo)簽不僅可以提高蛋白的可溶性，還能夠增強蛋白與親和介質(zhì)的結(jié)合力，從而提高純化效率。還可以利用基因工程技術(shù)，對重組蛋白的氨基酸序列進行優(yōu)化，去除可能導(dǎo)致蛋白聚集或影響純化的序列，提高蛋白的表達和純化效果。4.