《癌生物學》第十章（2）端粒和端粒酶

前言：上一期我們已經介紹了腫瘤細胞無限增殖面臨的兩個障礙。

今天我們主要是學習〃端粒〃和〃端粒酶〃的相關內容。相信通過本

期的學習，我們對端粒和端粒酶的理解會更上一層樓~

端粒的結構

在哺乳動物細胞（以及許多其他后生動物細胞）中，端粒由重復

的六核甘酸序列組成，其中一條鏈（富含G）上為5'-TTAGGG-3）互補鏈

上（富含。為5'-CCCTAA-3'e在正常人體細胞中,端粒DNA由數千

個重復的六核昔酸序列組成，在染色體末端形成5?10kb長的序列重復

片段。

端粒DNA通常為5-10kb長。在功能性端粒DNA（中間）與非端粒

染色體DNA（最左側）之間還存在著亞端粒DNA區域。亞端粒DNA

區域里含有TTAGGG類似片段，但并沒有染色體末端保護功能。然而,

由于亞端粒DNA含有端粒類似序列，它通常也是端粒限制性片段（TRF）

的組成部分。但是只有單純的端粒重復片段能夠保護染色體DNA末端:

當單純串聯重復片段的重復次數減少到12次以下時就會喪失末端保護

功能。因此,即使仍然有數kb長度的TRF存在，但端粒已經喪失了阻

止染色體DNA末端融合的能力。

粼弋

5??■TTAGGGTTAGGGTTAGGG??--TTAGGG3'

y????AATCCC5,

11M\II__________________________________|

染色體作端粒DNA上??二蟠粒DNA雙鏈區端粒DNA富G鏈3，

圖1：端粒DNA的結構

特殊的是，富G鏈多出一百至數百個核昔酸，導致該鏈3'單鏈端

外懸。這種凸出的鏈會形成一種最不尋常的分子構型——t環。當E寸通

過電子顯微鏡分析端粒DNA時發現了一種環形結構，實質上是套索結

構。這種構型的形成依賴于三鏈DNA復合體的形成。有可能所有端

粒DNA的末端均含有t環，但是由于在電子顯微鏡下保存和觀察此結

構的技術上的限制，只有一部分端粒在電子顯微鏡下可以觀察到t環。

t環有助于保護線性DNA分子未端，因為單鏈末端的外懸區被巧妙地

塞進雙鏈區域，以保護其免受損傷。

下圖為t環的示意圖，顯示了3'端凸出的富G鏈（粉色）與富C鏈

（藍色）的小段區域退火形成詈換（D環）（粉色鏈）。圖中箭頭方向為

5'一3'。

下圖再次顯示了t環，3'端伸入染色體形成雙鏈螺旋，在圖中用粗

線標明（粉色）。

（C）

島（進

染色體體

富G鏈

圖3:t環結構

相對較長的雙鏈端粒DNA和相對較短的外懸單鏈末端都與特定蛋

白質相結合。這些蛋白質中含有能夠特異識別并結合該六核昔酸序列

的結構域，能夠與端粒DNA的雙鏈和單鏈區結合。端粒結合蛋白、尚

未被發現的相關蛋白及端粒DNA一起構成的核蛋白復合體就稱為端粒。

構成端粒復合物的一些端粒相關蛋白能保護端粒免于降解。其中，

TRF1和TRF2能夠結合端粒的雙鏈DNA部分，而第三個蛋白P0T1

既能結合富G鏈的3,端外懸單鏈,又能與置換環（D環）的單鏈DNA結

4

口o

圖4:端粒復合物

每個端粒中會出現多個端粒復合物，它們負責t環的結構維持。如

下圖所示,POT1通過和D環結合能夠維持其結構穩定性并維持t環結

構完整性。

(B)

圖5:端粒復合物

在細胞周期的S期，復制機制能高效地復制線性DNA分子中間的

序列，即染色體的主體部分，但復制染色體末端序列是極其困難的。

困難之處在于所有DNA鏈的合成必須從已有DNA的3'羥基端開始,

DNA3,羥基端以與引物相似的方式來延伸核DNA鏈。如果沒有可用的

DNA弓|物，則以RNA分子的3端作為DNA合成的引物。

如果引物酶（其作用是安置RNA引物）恰巧在距模板鏈（‘滯后鏈

合成〃發生處）3,端的一定距離處放置了一個RNA引物,那么DNA

聚合酶新合成的DNA鏈的3'端將缺少一定數量與模板鏈互補的堿基。

即使引物酶恰巧位于模板鏈的末端，并合成了一條RNA引物，在新合

成的子鏈中仍缺失大約10個核昔酸，這正相當于RNA引物的長度，

因為RNA在引物完成起始DNA延伸的使命后就被降解了。最后的結

果是DNA兩條模板鏈的其中一條末端的核苗酸序列不能被適當復制。

在正常DNA復制過程中，親本的雙螺旋DNA在解旋酶作用下解

開，使得復制過程持續進行。新合成的滯后鏈由短的RNA引物片段引

導,引物酶按數百個核昔酸的間隔依次安置這些RNA引物。RNA分

子的3'羥基端作為新合成子鏈的起始。在這些RNA引物尚未移去、片

段尚未融合之前，這些片段稱為岡崎片段。因為合成按5'-3'方向進

行，所以滯后鏈的合成與延伸的方向和復制叉前進的方向相反。而另

一個親本鏈的復制由于延伸方向和復制叉的移動方向一致，能夠連續

進行復制，隨著親本鏈的解旋向3'端延伸。下圖中每條鏈5'-3'的方

向由箭頭指示。粗線代表親本DNA鏈，細線代表新合成鏈。

圖6:正常DNA復制

由于以上原因，前導鏈DNA的合成將會一直進行到端粒的末端，

產生和原來端粒DNA序列一致的拷貝。然而，滯后鏈的合成需要用到

端粒末端DNA（環狀）附近對應的RNA引物。由于此RNA引物隨后

會被移除，而且它也未必確定位于藍色模板鏈的末端精確互補，因此

最終合成的DNA鏈是缺少一段親本鏈的互補序列的，最后造成部分親

本鏈DNA（粗線，藍色）沒有被復制，以及子代細胞基因組中端粒

DNA序列的丟失。下圖中每條鏈的方向由箭頭指示。粗線代表

親本DNA鏈，細線代表新合成鏈。

(B)端粒

圖7:端粒DNA的復制

末端復制的問題可以解釋正常細胞每一次分裂后端粒DNA的縮短。

除了端粒DNA末端的復制不足，細胞中核酸外切酶也會對端粒DNA

的末端造成損壞，其最終所導致的端粒末端侵蝕也許會更大。無論何

種原因，在許多類型的正常人類細胞中，細胞每分裂增殖一代端粒將

會丟失50-100bp的DNA。這種對端粒DNA的持續性破壞是限制細

胞傳代能力的分子機制。

工山也L布M

麻粒酶

早期癌細胞可以通過表達端粒酶逃脫細胞危象。端粒酶能特異地

延長端粒DNA。通過端粒重復序列擴增實驗(telomericrepeat

amplificationprotocol,TRAP)進行檢測發現，在85%-90%的人月中

瘤細胞樣品中都能檢測到端粒酶活性，而其在正常細胞中水平很低。

低水平的端粒酶活性，雖然能最低限度地維持端粒DNA的穩定(如修

復t環或使其再生)，但不能阻止每一次正常細胞周期復制分裂過程中

端粒的進行性損耗。

一般成人正常細胞中觀察到的端粒酶活性都很低，但也有例外。

例如，睪丸的精子細胞中存在高端粒酶活性，功能性活化的淋巴細胞

也會表達高水平端粒酶。端粒酶在早期胚胎生成過程中高表達，而在

隨后細胞分化形成機體組織過程中大幅減少。人體大多數細胞中雖然

含有端粒酶的全基因序列，卻因不能足量表達此基因而表現出該酶的

活性。

哺乳動物細胞端粒酶全酶的核心由兩個亞基組成，即

hTERT（humantelomerasereversetranscriptase）催化亞單位和與

之相關的hTRRNA亞單位（構成功能性全酶還需要5個其他蛋白質，

有的蛋白質出現兩個拷貝）。hTERT催化亞單位為DNA聚合酶,更確

切地說是逆轉錄酶，其作用與逆轉錄病毒產生的逆轉錄酶、其他一些

病毒和轉座元件類似,能以RNA為模板合成DNA。但是與其他逆轉

錄酶不同,端粒酶巧妙地組裝自身RNA模板即hTRRNA亞單位（由

415個核吉酸長度的RNA分子）的一小部分作為模板來指導全酶的逆轉

錄活性。

hTERT催化亞單位能夠合成與端粒酶相關RNA分子（hTR;其編碼

基因有時被稱為TERC）中六核苗酸序列互補的DNA分子，使這些核

苗酸結合到端粒DNA3,端富G鏈外懸區域。端粒DNA的互補鏈據推

測由常見DNA聚合酶生成。

下圖中,全酶附著在3'端富含G凸出末端（粉色）,部分通過hTR

的氫鍵結合到富含G鏈的最后5個核酸上。因此通過對hTR亞單位序

列的逆轉錄，hTERT能夠以每次6個核甘酸的形式使富含G鏈延伸（黑

色）。通過重復每次增加6個核昔酸這個過程，該酶能在富含G鏈上延

伸成百上千個核甘酸。箭頭方向為5,-3’,在完成延伸后，傳統的

DNA聚合酶會結合到互補鏈（藍色）完成DNA合成。

(A)

初始案鍵結合區

新延伸六枝甘酸

圖8:人端粒酶全酶的結構

在細胞即將進入危象狀態之前，轉染hTERT基因的cDNA,可誘導

細胞端粒酶活性并促使已明顯縮短的端粒得以延伸，阻止細胞進入危

象狀態從而使細胞永生化。

a

d

、

率

削

球

皴

°0102030405060

時間/天

?轉染hTERT的HEK細胞

圖9:表達端粒酶可阻止細胞進入危象

該實驗及類似實驗結果支持三點結論。首先，端粒酶的全酶可能

由多個不同的亞單位構成，在正常危象前人類細胞中僅僅缺失了

hTERT基因編碼的催化亞單位；端粒酶全酶的其他亞單位（包括hTR端

粒酶相關的RNA分子）在危象前細胞中都是足量存在的。其次，端粒

酶的表達（而不是其他酶）使細胞逃過危象,并且端粒酶特異地作用于端

粒DNA上，這些觀察表明危象的關鍵原因之一就是端粒的極度縮短。

最后，該實驗顯示端粒酶活性的獲得（如在一些處于危象狀態的細胞群

中僅有極少數的變異細胞可自發地獲得端粒酶活性）足以使細胞逃脫危

象并使其子代細胞獲得永生化能力。

端粒酶活性對腫瘤細胞增殖能力的重要性還通過導入反義RNA降

低端粒酶活性和催化能力喪失的hTERT酶突變體（dnhTERT）的實驗得

到了驗證。值得注意的是，端粒酶陽性細胞一旦進入危象后，將觀察

不到dnhTERT酶對細胞增殖的作用，這就排除了另一種可能性：酶突

變體本身具有細胞毒性，其對細胞的作用可能是非特異性的毒性損傷。

為了合理解釋上述結果，研究者提出〃汽車模型〃的比喻來解釋

人類腫瘤細胞的生長：癌基因激活被形象地比喻為踩油門，而抑癌基

因失活被比作剎車系統失靈，端粒酶好比是高速公路上的加油站，為

一路前行的汽車提供汽油。

ALT機制

85%?90%的人腫瘤細胞中端粒酶為陽性,而其余10%~15%的

腫瘤細胞缺乏可檢測到的酶活性。然而，這類腫瘤細胞也能維持最短

的端粒長度，滿足無限增殖的需要。事實上，這些細胞大部分可通過

端粒延長的替代（alternativelengtheningoftelomerase,ALT）機制保

護端粒，使細胞存活下來。ALT是一種不依賴端粒酶活性的端粒長度

維持機制，少數缺乏端粒酶活性的人腫瘤細胞可利用ALT維持端粒長

度。

ALT細胞中維持端粒的一種可能機制就是端粒間的序列信息交換

（如下圖所示）,這一點可能基于染色體復制過程中DNA聚合酶作用依賴

于多條染色體模板。一個端粒（棕色和綠色，左下）延伸3,突出末端（綠

色），取代了另一染色體端粒上相同極性的一條鏈（粉色），使3’突出末

端退火結合到后一條染色體端粒的互補鏈上（藍色）。常規DNA聚合酶

能以互補鏈（藍色）為模板延伸這條鏈（綠色虛線），隨后，富含G鏈從藍

色互補鏈（藍色）上解離出來。新延長的富含G鏈可被常規DNA聚合酶

轉化成雙鏈形式（棕色虛線，右下）。這個過程可被重復數十次，導致序

列信息從一個端粒傳遞到另一端粒上，最終在無端粒酶存在的情況下,

端粒長度延長數千個堿基。實際上，就是DNA聚合酶借用另一個染色

體的序列作為模板，并將其序列信息整合到第一個染色體新合成的子

鏈中。

第二條染色體的端粒NDA

；一..3'第二條染色體

、二二一單鋅延伸

~J、從第二條染色體脫高

\.

二….

第一條濃伍體的談的NDAI

圖10:ALT的替換機制

止匕外，ALT細胞中也會發生端粒之間的不平等交叉互換機制交換

序列片段，導致一個端粒長度增加而另一個端粒長度減少，這或許可

解釋這些細胞中為何端粒的長度極不穩定。

第二條染色體端粒DNA

不平等互換\/\><

圖11:ALT的不平等交叉互換機制

我們仍未能成功在ALT陽性的人腫瘤細胞中鑒定維持端粒結構的

酶。