3.2基因工程的基本操作程序第三章

基因工程目標與問題1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？3.針對人類生產或生活中的某一需求，選取適當的基因工程的技術和方法，嘗試設計獲得某一轉基因產品的方案。4.通過設計引物和模擬PCR的過程，進一步加深對PCR原理和過程的理解，闡明PCR技術的原理和基本過程。1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。非轉基因抗蟲棉轉基因抗蟲棉

從社會中來問題探討1.為什么傳統的雜交育種培育不出轉基因抗蟲棉，而基因工程卻可以？2.轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入與載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建（核心）3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因請表述出培育轉基因抗蟲棉的四個步驟蘇云金桿菌閱讀教材P76-77內容，思考以下問題1.什么是目的基因？抗蟲棉的目的基因是什么？2.篩選合適的目的基因的方法有哪些？【目的基因的篩選與獲取】3.獲取目的基因的方法有哪些？①通過構建基因文庫來獲取目的基因前提：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學方法直接合成③利用PCR特異性地快速擴增目的基因②人工合成目的基因方法：任務一序列數據庫，如Genbank序列比對工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool)生物信息學數據庫網址：/genbank/包括：所有已知的核苷酸及蛋白質序列、以及與之相關的生物學信息和參考文獻簡介：美國國立衛生研究院維護的基因序列數據庫，匯集并注釋了所有公開的核酸序列與日本DNA數據庫（DDBJ）和歐洲分子生物學實驗室核酸數據庫（EMBL）構成國際核酸序列數據庫合作，每天交換數據檢索方式：輸入基因名稱、物種名稱二、篩選合適的目的基因6序列數據庫，如Genbank序列比對工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool)生物信息學數據庫網址：/Blast.cgi簡介：可將輸入的核酸或蛋白質序列與數據庫中的已知序列進行比對，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來源或進化關系。二、篩選合適的目的基因包括：75’3’

怎樣獲取Bt基因呢？體內DNA復制所需的基本條件在DNA復制中的作用體內DNA復制條件DNA母鏈解旋酶4種脫氧核苷酸DNA聚合酶提供DNA復制的模板打開DNA雙鏈合成子鏈DNA的原料催化形成磷酸二酯鍵，進而合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物任務一閱讀教材P77-79內容，思考以下問題1.說出體外擴增目的基因的方法、原理、優點、條件2.什么是引物？PCR擴增為什么需要引物？【利用PCR獲取和擴增目的基因】方法：PCR,聚合酶鏈式反應，原理：DNA半保留復制優點：特異性快速擴增目的基因條件：緩沖液（一般要添加Mg2+)、DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶、

控制溫度引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸

在DNA復制中的作用體內DNA復制條件DNA母鏈解旋酶4種脫氧核苷酸DNA聚合酶提供DNA復制的模板打開DNA雙鏈合成子鏈DNA的原料催化形成磷酸二酯鍵，進而合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物PCR的條件

耐高溫DNA聚合酶

高溫DNA母鏈4種脫氧核苷酸引物歸納總結：

比較PCR反應和體內DNA復制所需的基本條件活動1.根據查詢的Bt基因編碼鏈序列，嘗試設計引物。小組內合作討論完成（3min）要求：1.寫出互補鏈的堿基序列，并注明方向。2.從①－④中選擇2個合適的位置設計引物，寫出引物的部分序列，并注明方向。5’ATG……ATCGAGACCGGT……TAA3’3’TAC……TAGCTCTGGCCA……ATT5’①②

③④3’…ATT5’5’ATG…3’要求：請利用所給材料和活動1中設計的引物，小組合作討論并模擬PCR擴增的過程（4min）活動2.模擬PCR擴增過程14【利用PCR獲取和擴增目的基因】活動2.模擬PCR擴增過程思考：觀察下列過程，回答問題15①n次循環后，DNA分子有_____個②n次循環后，DNA鏈有_____條③第____次循環出現完整的目的基因④n次循環后，含引物的DNA分子有__個⑤n次循環后，共消耗_______個引物⑥第n次循環時，消耗______個引物⑦n次循環后，完整的目的基因有_______個2n2n+132n2n+1-22n2n-2nPCR結果分析16（1）引物的作用是

引物應結合在模板鏈的

（5’端、3’端）。（2）1個DNA分子經PCR擴增n次，可得到

個DNA分子，從而在體外快速擴增目的基因。

（3）鑒定PCR產物的方法是

。歸納總結：

使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸3’端2n瓊脂糖凝膠電泳18常見的PCR儀：Veriti熱循環儀練習與嘗試

1.變性過程破壞的是哪種化學鍵？是否需要酶？2.引物是什么？在復性過程中引物結合到模板鏈的哪一端？3.延伸過程是否需要ATP供能？4.PCR為什么需要引物？氫鍵；不需要酶，需要90℃以上的高溫短單鏈核酸3’端不需要，由dNTP水解供能DNA復制不能從頭開始，DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈（DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羥基上）195.旁欄思考：用PCR技術可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因導入受體細胞嗎？直接將目的基因導入受體細胞后一般不能表達，就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解

不能原因P80頁旁欄思考任務二閱讀教材P80內容，思考以下問題1.構建基因表達載體的目的？2.基因表達載體由哪些元件組成？它們的作用分別是什么？【基因表達載體的構建】——基因工程的核心任務二【基因表達載體的構建】——基因工程的核心①

;②

。啟動子：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動轉錄。終止子：終止轉錄1.構建基因表達載體的目的使目的基因在受體細胞中穩定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用2.組成標記基因：目的基因：復制原點：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細胞目的基因必須插入到

與

之間。終止子DNA復制的起始位點。載體的種類：質粒（常用）、噬菌體、動植物病毒啟動子誘導型啟動子？02復制原點：DNA復制的起始位點標記基因：作用為鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。二、基因表達載體的構建——核心步驟啟動子：本質：有特殊序列結構的

片段位置：基因的

。功能：

識別和結合的部位，驅動基因轉錄出

。DNA上游RNA聚合酶mRNA抗生素抗性基因，熒光蛋白基因等。終止子：本質：有特殊序列結構的

片段位置：基因的

。功能：終止

。DNA下游轉錄目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀必須插到

和

之間啟動子終止子項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質_________________________位置功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA使轉錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結束信號(不編碼氨基酸)啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端活動3.模擬基因表達載體的構建（5min）要求：1.利用所給材料，從4個方案中選擇一個最優方案,模擬基因表達載體的構建過程

2.各組選派代表展示成果，并說明其它方案的不足之處。

活動3.模擬基因表達載體的構建

EcoRⅠ

XbaⅠ

HindⅢ

BamHⅠ

XbaⅠ

Bt基因方案一：HindⅢ方案二：EcoRⅠ、HindⅢ方案三:XbaⅠ、BamHⅠ方案四:HindⅢ、BamHⅠ

利用所給材料，從4個方案中選擇一個最優方案,模擬基因表達載體的構建過程

歸納總結：

限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因，所以不能選擇方案

。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點。(3)善用“雙酶切”，注意方向性。常使

切割目的基因和質粒，優點是可以避免目的基因和質粒自身環化和隨意連接（或為了保證目的基因和質粒發生定向連接），因此不選擇方案

。目的基因和載體啟動子的方向必須是

，否則目的基因導入后無法正常轉錄，因此不選擇方案

。三不同的限制酶相同的二一典例1.如圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列有關敘述不正確的是(

)

注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環素抗性基因。A.可選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養基就能篩選出含重組質粒的受體菌D.啟動子是RNA聚合酶的識別和結合部位，可以驅動遺傳信息的轉錄

C任務二【基因表達載體的構建】——基因工程的核心載體（質粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同種[易錯提醒]若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會出現三種情況：目的基因與目的基因連接；目的基因與質粒連接；質粒與質粒的連接，需篩選出重組質粒。任務三【將目的基因導入受體細胞】閱讀教材P81-82內容，完成表格：生物種類植物動物微生物常用方法

處理法受體細胞_______________________轉化過程農桿菌轉化法花粉管通道法（我國創造）體細胞或受精卵受精卵Ca2＋將目的基因插入Ti質粒的T－DNA中→農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態→基因表達載體導入顯微注射法原核細胞只有該步驟沒涉及堿基互補配對原則將目的基因導入受體細胞——植物細胞:花粉管通道法1.花粉管通道法我國科學家獨創的一種方法。②可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。31①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。將目的基因導入受體細胞——植物細胞:花粉管通道法優點①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進

入胚囊，此時的受精卵未形成細胞壁，且正在進行活躍的DNA復制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡單、技術成本低，免去了組織培養以及誘導再生植株

的全套人工培養過程。受體細胞：受精卵32將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法①農桿菌特點：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對大多數____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物隨著轉化方法的突破，農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。采用最多將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法b.當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，農桿菌能將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)

轉移到被侵染的細胞，并將其整合到該細胞的染色體DNA上。①農桿菌特點：將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法②載體：農桿菌Ti質粒（T-DNA)·毒性區(vir區)︰激活T-DNA的轉移·T-DNA區:侵染植物時，從Ti質粒上被切割，轉移到植物細胞中，帶有與腫瘤形成有關的基因。該區內基因表達調控序列與真核生物類似，因而可以不在農桿菌中表達而在植物中表達。將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法將目的基因插入__________________中，通過農桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。③利用農桿菌進行轉化的思路：Ti質粒的T-DNA轉化進入植物細胞轉化目的基因進入____________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程。受體細胞穩定表達此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒表現出新性狀的植株導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質粒T-DNA含重組Ti質粒的農桿菌轉入農桿菌過程Ti質粒目的基因構建基因表達載體轉入農桿菌導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀植物組織培養將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法⑤方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。受體細胞為_______體細胞受體細胞為_______受精卵38將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；將目的基因導入受體細胞——農桿菌轉化法39可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。將目的基因導入受體細胞——農桿菌轉化法40該過程經過____次拼接、____次導入？(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導入_____________________________________________________________________(4)第二次導入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法【P83拓展應用】

提示：外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數情況下，插入的位點難以做到定點插入;插入的拷貝數也是隨機的。因此，外源基因在轉基因植物中的遺傳是很復雜的。

例如，科研人員在對轉GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進行基因表達分析時，發現部分轉基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩定性。42將目的基因導入受體細胞——動物細胞顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達載體提純→顯微注射入動物的受精卵→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物受體細胞：受精卵43將目的基因導入受體細胞——微生物細胞1.原核生物的作為受體細胞的優點①繁殖快②單細胞③遺傳物質少2.導入方法：Ca2+處理法(感受態細胞法)大腸桿菌感受態細胞Ca2+混合表達載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉化使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入宿主細胞。44將目的基因導入受體細胞——微生物細胞胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉錄重組質粒質粒導入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工用原核生物生產胰島素示意圖注：原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。45受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射技術Ca2+處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上↓轉入農桿菌中↓導入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上提純含目的基因的表達載體↓顯微注射↓受精卵發育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細胞↓感受態細胞↓基因表達載體與感受態細胞混合↓感受態細胞吸收DNA分子46將目的基因導入受體細胞將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行基因表達載體的構建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因導入了受體植物。4748①目的基因是否進入受體細胞？②受體細胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？③目的基因是否轉錄（mRNA）？④是否有翻譯產物（蛋白質）？⑤是否賦予了生物個體新性狀？篩選含有重組質粒的受體細胞檢測與鑒定分子水平個體水平第四步：檢測和鑒定目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。任務四【目的基因的檢測與鑒定】閱讀教材P82內容，思考下列問題：49①目的基因是否進入受體細胞？篩選含有重組質粒的受體細胞插入目的基因自身環化a.重組質粒b.空質粒酶連接注：僅有少數質粒能進入受體細胞，使細胞轉化A.導入重組質粒C.未導入質粒B.導入空質粒青霉素X-galA含有重組質粒的大腸桿菌菌落B含有空質粒的大腸桿菌菌落C不含質粒的大腸桿菌菌落生長生長不生長白色藍色AmpR：檢測質粒是否進入大腸桿菌LacZ：區分空質粒（藍色）和重組質粒（白色）【實例】藍白斑篩選P98變式：將混合處理后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的是含重組質粒的細菌和含自身環化質粒的細菌，如下圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如下圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環素培養基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如下圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。51②受體細胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測與鑒定PCR等技術方法：過程：1）設計引物2）模板DNA的制備提取植物基因組DNA或總DNA;檢測時要有陽性和陰性對照,

陽性對照可用質粒DNA，

陰性對照可從未轉基因的植株中提取。3）PCR反應4）電泳結果分析52②受體細胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測與鑒定PCR等技術方法：過程：結果示例：53【練一練】B②受體細胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測與鑒定(2019·江蘇高考真題）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是__________________________54【練一練】乙丙②受體細胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測與鑒定55③目的基因是否轉錄（mRNA）？檢測與鑒定PCR等技術方法：過程：RT-PCR（逆轉錄PCR）以植物總RNA或mRNA為模板進行逆轉錄，然后再經PCR擴增。如果從細胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴增條帶，則表明外源基因實現了轉錄。56④是否有翻譯產物（蛋白質）？檢測與鑒定抗原-抗體雜交技術方法：過程：從轉基因生物中提取出蛋白質，用相應的抗體進行抗原－抗體雜交，若出現雜交帶，則表明目的基因已形成蛋白質產品。57⑤是否賦予了生物個體新性狀？檢測與鑒定觀察是否賦予個體生物新的特性或抗性方法：轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常目的基因的篩選和獲取利用PCR獲取和擴增化學方法人工合成構建基因表達載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法(植物)、顯微注射法(動物)、Ca2+處理(微生物);目的基因的檢測與鑒定分子檢測：是否插入、轉錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等?；蚬こ痰幕静僮鞒绦颍?個步驟）1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構建含有afp基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（

）（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（

）2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是（

）

A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶

B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶

C.復