NLRP3炎癥小體介導內皮損傷促進肺動脈高壓的機制解析與治療新策略一、引言1.1研究背景與意義肺動脈高壓（PulmonaryHypertension，PH）是一類以肺動脈壓力異常升高為主要特征的進行性、慢性肺血管疾病，能夠導致右心衰竭，甚至死亡，嚴重威脅人類健康。2018年第6屆世界肺動脈高壓研討會上，PH被定義為：靜息狀態下，平均肺動脈壓（meanpulmonaryarterialpressure，mPAP）>20mmHg且肺毛細血管楔壓（pulmonaryarterywedgepressure，PAWP）>15mmHg或肺血管阻力（pulmonaryvascularresistance，PVR）>3WU。根據病因的不同，PH可分為五大類，包括動脈性PH（PAH）、左心疾病所致PH、肺部疾病和（或）缺氧導致的PH、慢性血栓栓塞性PH（CTEPH）以及具有不明確和（或）多因素機制的PH。PH具有較高的發病率和病死率，嚴重影響患者的生活質量和生存預期。在全球范圍內，不同類型的肺動脈高壓均給患者和社會帶來了沉重的負擔。據統計，特發性肺動脈高壓（IPAH）的發病率約為（2-3）/百萬人，且近年來有逐漸上升的趨勢。由于早期癥狀不典型，多數患者在確診時病情已進展至中晚期，5年生存率僅為30%-40%，與惡性腫瘤相當。而在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者中，約有20%-40%會并發肺動脈高壓，這顯著增加了COPD患者的住院率和死亡率。此外，先天性心臟病相關性肺動脈高壓也是兒童和青少年常見的嚴重心血管疾病之一，嚴重影響患兒的生長發育和生活質量。目前，盡管臨床上已開發出多種治療肺動脈高壓的藥物，如內皮素受體拮抗劑、前列環素類似物、磷酸二酯酶-5抑制劑等，但這些治療手段只能緩解癥狀、延緩疾病進展，無法從根本上治愈肺動脈高壓，患者仍面臨著較高的死亡風險。因此，深入探究肺動脈高壓的發病機制，尋找新的治療靶點，對于改善患者的預后具有至關重要的意義。近年來，隨著對肺動脈高壓發病機制研究的不斷深入，越來越多的證據表明炎癥在肺動脈高壓的發生、發展過程中起著關鍵作用。炎癥反應可導致肺血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖、血管重塑以及右心室肥厚等一系列病理生理改變，從而促進肺動脈高壓的進展。NLRP3（NOD-likereceptorfamilypyrindomain-containingprotein3）炎癥小體作為炎癥反應的關鍵調節因子，在肺動脈高壓的發病機制中受到了廣泛關注。NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）組成的多蛋白復合物，在固有免疫應答中發揮著重要作用。當機體受到病原體感染、危險信號或損傷相關分子模式（DAMPs）刺激時，NLRP3炎癥小體被激活，進而招募ASC和Caspase-1，促使Caspase-1活化。活化的Caspase-1可將無活性的前炎性細胞因子IL-1β和IL-18切割成有活性的成熟形式，釋放到細胞外，引發強烈的炎癥反應。越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體的異常激活與多種疾病的發生、發展密切相關，包括心血管疾病、神經系統疾病、代謝性疾病以及腫瘤等。在肺動脈高壓的發病過程中，NLRP3炎癥小體的激活被認為是一個重要的病理事件。研究發現，在肺動脈高壓患者的肺組織和血清中，NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達顯著升高，且與疾病的嚴重程度呈正相關。動物實驗也證實，通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，可以減輕肺血管重構、降低肺動脈壓力，改善右心室功能，從而延緩肺動脈高壓的進展。然而，目前關于NLRP3炎癥小體在肺動脈高壓中具體作用機制的研究仍存在許多空白，其激活的上游信號通路以及下游效應分子尚未完全明確。本研究旨在深入探討NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓的機制，通過細胞實驗和動物實驗，從分子、細胞和整體水平揭示NLRP3炎癥小體在肺動脈高壓發病過程中的作用及調控機制，為肺動脈高壓的防治提供新的理論依據和潛在治療靶點。這不僅有助于加深我們對肺動脈高壓發病機制的認識，還可能為開發更加有效的治療策略提供新的思路和方向，對于改善肺動脈高壓患者的預后具有重要的臨床意義。1.2國內外研究現狀國外對于NLRP3炎癥小體與肺動脈高壓關系的研究起步較早，取得了一系列重要成果。在發病機制方面，多項研究表明，NLRP3炎癥小體的激活在肺動脈高壓的發生發展中扮演關鍵角色。如美國學者通過動物實驗發現，野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，肺組織內NLRP3炎癥小體相關蛋白表達顯著升高，且與肺動脈壓力升高、肺血管重構程度呈正相關。進一步研究揭示，NLRP3炎癥小體激活后，通過促進炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放，引發炎癥級聯反應，導致肺血管內皮細胞損傷，促進平滑肌細胞增殖，最終致使肺血管重構，肺動脈壓力升高。在信號通路研究上，國外學者對NLRP3炎癥小體激活的上游信號通路進行了深入探索。發現線粒體功能障礙產生的活性氧（ROS）可作為重要的上游信號，激活NLRP3炎癥小體。當線粒體受到損傷或處于應激狀態時，會產生大量ROS，ROS通過多種途徑激活NLRP3，如直接氧化修飾NLRP3蛋白，使其構象改變從而活化；或通過調節細胞內離子濃度，間接激活NLRP3。此外，細胞內的鉀離子外流也是激活NLRP3炎癥小體的重要信號之一，當細胞受到刺激后，鉀離子外流，可啟動NLRP3炎癥小體的組裝與激活。在治療靶點研究方面，國外科研人員致力于尋找能夠抑制NLRP3炎癥小體激活的藥物或干預措施。研究發現，MCC950作為一種特異性的NLRP3抑制劑，在動物實驗中能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活性，減輕肺血管重構，降低肺動脈壓力，改善右心室功能。這為肺動脈高壓的治療提供了新的潛在藥物靶點，有望開發出新型治療藥物。國內在該領域的研究也取得了顯著進展。在發病機制研究上，國內學者通過對臨床肺動脈高壓患者樣本分析，發現患者血漿和肺組織中NLRP3炎癥小體相關指標升高，且與疾病嚴重程度和預后密切相關。在動物實驗中，利用脂多糖聯合低氧誘導的肺動脈高壓小鼠模型，證實NLRP3炎癥小體激活介導的炎癥反應參與肺血管重塑過程，并且發現巨噬細胞在這一過程中發揮重要作用，巨噬細胞來源的NLRP3炎癥小體激活后，釋放的炎性因子可促進肺血管平滑肌細胞增殖和遷移。在信號通路研究方面，國內研究團隊深入探討了NLRP3炎癥小體激活與其他信號通路的交互作用。研究表明，Toll樣受體4（TLR4）信號通路與NLRP3炎癥小體激活存在緊密聯系。在肺動脈高壓發生發展過程中，TLR4被激活后，可通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴的途徑激活核因子κB（NF-κB），促使NLRP3等炎癥因子表達上調，進而激活NLRP3炎癥小體，形成炎癥正反饋環路，加劇肺動脈高壓的進展。在治療研究方面，國內學者積極探索中藥及天然產物對NLRP3炎癥小體的調控作用。有研究發現，地龍提取物能夠通過降低肺血管內皮NLRP3誘導的線粒體ROS水平升高和炎癥反應，減輕肺動脈高壓。實驗表明，給予地龍提取物干預后，可顯著降低模型大鼠右心室收縮壓和右心肥大指數，改善肺血管重構，同時下調肺組織NLRP3蛋白表達及炎性因子水平，為肺動脈高壓的治療提供了新的中藥治療思路。1.3研究目的與內容本研究旨在深入揭示NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓的內在機制，為肺動脈高壓的防治提供關鍵理論依據和潛在治療靶點。具體研究內容涵蓋以下幾個方面：NLRP3炎癥小體的激活機制研究：在細胞和動物水平，探究NLRP3炎癥小體激活的上游信號通路，明確活性氧（ROS）、線粒體功能障礙、鉀離子外流等因素在激活過程中的作用及相互關系，分析這些信號通路如何精準調控NLRP3炎癥小體的組裝和活化，從分子層面闡釋激活的啟動和放大機制。NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷的機制研究：利用體外培養的肺動脈內皮細胞，給予NLRP3激動劑尼日利亞菌素等誘導細胞損傷，觀察細胞凋亡、線粒體功能、氧化應激水平等指標的變化，探究NLRP3炎癥小體激活后，如何通過釋放炎性細胞因子IL-1β、IL-18等，介導炎癥反應，損傷內皮細胞，破壞內皮屏障功能，導致血管內皮功能紊亂，進而影響血管的正常生理功能。NLRP3炎癥小體在肺動脈高壓發生發展中的作用研究：建立野百合堿（MCT）誘導的大鼠肺動脈高壓模型、脂多糖聯合低氧誘導的小鼠肺動脈高壓模型等，通過檢測右心室收縮壓、右心肥大指數、肺血管重構程度等指標，明確NLRP3炎癥小體在肺動脈高壓發病過程中的關鍵作用，分析其激活與肺動脈壓力升高、肺血管重構、右心室肥厚等病理生理改變的相關性，揭示NLRP3炎癥小體在疾病進程中的動態變化和作用規律。NLRP3炎癥小體相關信號通路在肺動脈高壓中的研究：深入探討NLRP3炎癥小體激活后下游信號通路的變化，如NF-κB、MAPK等信號通路的激活情況，以及這些信號通路如何進一步調節炎癥因子、細胞增殖和凋亡相關基因的表達，從而影響肺動脈高壓的發生發展，明確信號通路之間的交互作用和調控網絡，為干預提供精準靶點。1.4研究方法與技術路線文獻研究法：全面檢索國內外數據庫，如PubMed、WebofScience、中國知網、萬方等，收集NLRP3炎癥小體、內皮損傷與肺動脈高壓相關的文獻資料。對文獻進行篩選、整理和分析，掌握該領域的研究現狀、熱點問題及發展趨勢，為研究提供堅實的理論基礎，明確研究的切入點和創新點。實驗研究法：動物實驗：選用SPF級SD大鼠和C57BL/6小鼠，構建野百合堿（MCT）誘導的大鼠肺動脈高壓模型以及脂多糖聯合低氧誘導的小鼠肺動脈高壓模型。將動物隨機分為對照組、模型組、抑制劑干預組等。通過腹腔注射MCT、氣管內滴注脂多糖結合低氧環境暴露等方式造模。定期監測動物體重、呼吸頻率、活動狀態等一般指標。實驗結束后，采用右心導管法測定右心室收縮壓（RVSP），計算右心肥大指數（RVHI），評估肺動脈高壓程度；取肺組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺血管形態學變化；免疫組化、免疫熒光及Westernblotting法檢測肺組織中NLRP3炎癥小體相關蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）、炎性細胞因子（IL-1β、IL-18）、內皮損傷相關標志物（vWF、ICAM-1）等的表達水平；采用ELISA法檢測血清和肺組織勻漿中炎性因子含量；利用透射電鏡觀察肺血管內皮細胞和線粒體超微結構。細胞實驗：體外培養人肺動脈內皮細胞（HPAEC）和大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMC）。實驗分組為正常對照組、NLRP3激動劑（如尼日利亞菌素）處理組、抑制劑（如MCC950）預處理+激動劑處理組等。利用CCK-8法檢測細胞活力；流式細胞術檢測細胞凋亡率、細胞周期分布；DCFH-DA探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平；JC-1探針檢測線粒體膜電位；ELISA法檢測細胞培養上清中IL-1β、IL-18等炎性細胞因子含量；Westernblotting法檢測細胞內NLRP3炎癥小體相關蛋白、凋亡相關蛋白（Bax、Bcl-2）、細胞增殖相關蛋白（PCNA）等的表達變化。數據分析方法：采用GraphPadPrism、SPSS等統計軟件進行數據分析。實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若差異具有統計學意義（P<0.05），進一步采用LSD法或Dunnett's法進行兩兩比較。通過相關性分析研究各指標之間的關系，利用回歸分析探討NLRP3炎癥小體與肺動脈高壓相關指標的定量關系。技術路線方面，在動物實驗中，先進行動物模型構建，完成模型鑒定后，進行樣本采集，然后對肺組織和血清進行相關指標檢測，最后對數據進行統計學分析并得出結論。在細胞實驗中，先進行細胞培養和分組處理，然后進行細胞功能檢測和蛋白表達檢測，同樣對數據進行統計學分析得出結論。將動物實驗和細胞實驗結果相互驗證，深入探討NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓的機制。二、NLRP3炎癥小體概述2.1NLRP3炎癥小體的結構與組成NLRP3炎癥小體是一種在固有免疫中發揮關鍵作用的多蛋白復合物，由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）組成。它在機體抵御病原體入侵、維持內環境穩定以及參與多種疾病的病理過程中扮演著重要角色。NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（NLR）家族成員，是NLRP3炎癥小體的核心組件。其蛋白質結構具有典型的特征，從N端到C端依次包含三個主要結構域：N端的熱蛋白結構域（PYD）、中部的NACHT結構域和C端的富含亮氨酸重復序列（LRR）結構域。PYD結構域主要介導蛋白質-蛋白質之間的相互作用，在NLRP3炎癥小體的組裝過程中，PYD結構域能夠與ASC蛋白的PYD結構域相互識別并結合，從而將NLRP3與ASC連接起來，這是炎癥小體組裝的關鍵步驟之一。研究表明，PYD結構域的氨基酸序列保守性較高，其特定的空間構象決定了它與其他PYD結構域相互作用的特異性和親和力，對炎癥小體的形成起著不可或缺的作用。NACHT結構域具有ATP酶活性，在NLRP3炎癥小體激活過程中發揮重要功能。當NLRP3受到上游信號刺激時，NACHT結構域結合ATP并發生水解，引起NLRP3蛋白構象的改變，進而啟動炎癥小體的組裝和激活過程。ATP酶活性的調節對于NLRP3炎癥小體的活化至關重要，若NACHT結構域的ATP酶活性被抑制，NLRP3炎癥小體的激活也會受到阻礙。LRR結構域則主要參與識別病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），是NLRP3感知外界危險信號的關鍵結構域。LRR結構域由多個串聯的亮氨酸重復序列組成，這些重復序列形成特殊的馬蹄形結構，能夠與多種不同的配體相互作用，具有較高的識別多樣性。例如，當機體受到細菌感染時，LRR結構域可以識別細菌表面的脂多糖（LPS）等PAMPs；在細胞受到損傷時，LRR結構域能夠識別細胞內釋放的尿酸結晶、ATP等DAMPs，從而觸發NLRP3炎癥小體的激活。ASC是一種接頭蛋白，其作用是連接NLRP3和Caspase-1，在NLRP3炎癥小體的組裝和激活過程中起到橋梁的作用。ASC蛋白包含兩個結構域，N端的PYD結構域和C端的半胱天冬酶募集結構域（CARD）。ASC通過N端的PYD結構域與NLRP3的PYD結構域相互作用，然后通過C端的CARD結構域與Caspase-1前體（pro-Caspase-1）的CARD結構域相互結合，從而將NLRP3和Caspase-1招募到一起，促進NLRP3炎癥小體的組裝和活化。研究發現，ASC基因敲除的細胞中，NLRP3炎癥小體無法正常組裝，Caspase-1也不能被有效激活，表明ASC在NLRP3炎癥小體的形成和功能發揮中具有不可替代的作用。Caspase-1是NLRP3炎癥小體的效應蛋白，以無活性的酶原形式（pro-Caspase-1）存在于細胞中。在NLRP3炎癥小體激活過程中，pro-Caspase-1通過其CARD結構域與ASC的CARD結構域相互作用，被招募到NLRP3炎癥小體復合物中。隨后，pro-Caspase-1發生自我剪切，形成具有活性的Caspase-1?；罨腃aspase-1具有多種生物學功能，它能夠特異性地切割無活性的前炎性細胞因子IL-1β和IL-18，使其轉化為具有生物活性的成熟形式，釋放到細胞外，引發炎癥反應。此外，Caspase-1還可以切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域，該結構域能夠在細胞膜上打孔，導致細胞發生焦亡，進一步放大炎癥反應。2.2NLRP3炎癥小體的激活機制NLRP3炎癥小體的激活是一個復雜且精細調控的過程，主要涉及經典激活途徑和非經典激活途徑，這兩種途徑在不同的生理和病理條件下發揮作用，共同參與機體的免疫防御和炎癥反應。經典激活途徑是目前研究較為深入的NLRP3炎癥小體激活方式，該途徑通常需要兩種信號的刺激。在靜息狀態下，細胞內NLRP3和促炎細胞因子前體（如pro-IL-1β、pro-IL-18）的表達水平較低，NLRP3炎癥小體處于未活化狀態。當細胞受到病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）等刺激時，首先啟動第一信號，即通過細胞膜上的Toll樣受體（TLRs）等模式識別受體識別外來病原體或內源性危險信號。以脂多糖（LPS）為例，LPS與細胞膜上的TLR4結合，激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路，進而激活核因子κB（NF-κB）?；罨腘F-κB轉位進入細胞核，結合到NLRP3、pro-IL-1β等基因的啟動子區域，促進它們的轉錄和表達，使細胞內NLRP3和pro-IL-1β等蛋白水平升高，完成NLRP3炎癥小體激活的啟動階段。在啟動階段之后，細胞還需要接受第二信號的刺激才能進一步激活NLRP3炎癥小體。第二信號來源廣泛，包括多種結構和功能迥異的物質，如ATP、尼日利亞菌素、尿酸結晶、膽固醇結晶等。這些信號可以通過多種機制激活NLRP3，其中較為關鍵的是離子平衡失調和線粒體功能紊亂及活性氧（ROS）產生。當細胞受到第二信號刺激時，細胞膜上的離子通道發生改變，導致鉀離子外流。鉀離子外流被認為是激活NLRP3的關鍵事件之一，它可以觸發NLRP3蛋白的構象改變，使其從無活性狀態轉變為有活性狀態。同時，第二信號還可以誘導線粒體功能障礙，使線粒體產生大量的ROS。ROS作為重要的信號分子，一方面可以直接氧化修飾NLRP3蛋白，使其活化；另一方面，ROS可以通過激活下游的信號通路，間接促進NLRP3炎癥小體的激活。此外，溶酶體內容物釋放、內質網應激等也可能參與NLRP3炎癥小體的激活過程。在NLRP3被激活后，其N端的PYD結構域與ASC的PYD結構域相互作用，招募ASC。隨后，ASC通過其C端的CARD結構域與pro-Caspase-1的CARD結構域結合，將pro-Caspase-1招募到NLRP3炎癥小體復合物中，促使pro-Caspase-1發生自我剪切，形成具有活性的Caspase-1，從而完成NLRP3炎癥小體的激活。非經典激活途徑主要由細胞內的脂多糖（LPS）介導，在小鼠中主要涉及caspase-11，在人類中則對應caspase-4和caspase-5。當細胞內檢測到LPS時，caspase-11（或caspase-4/5）被激活，活化的caspase-11可以直接切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域。GSDMD-N端結構域能夠在細胞膜上打孔，導致細胞發生焦亡，同時釋放出大量的炎癥介質。此外，caspase-11的激活還可以間接激活NLRP3炎癥小體，但其具體機制尚未完全明確。最新研究表明，孤兒受體Nur77可能在非經典NLRP3炎癥小體激活途徑中發揮關鍵作用。在非經典NLRP3炎癥小體激活刺激下，GSDMD的N端引起線粒體DNA的釋放，Nur77同時結合線粒體DNA和LPS后能與NLRP3產生相互作用并活化NLRP3，從而引發caspase-1的切割和IL-1β的釋放。非經典激活途徑不依賴于第一信號對NF-κB的激活，是一種相對獨立的NLRP3炎癥小體激活方式，在宿主抵御細菌感染等過程中發揮重要作用。2.3NLRP3炎癥小體的功能與作用NLRP3炎癥小體在免疫防御和炎癥反應中扮演著舉足輕重的角色，其激活后引發的一系列生物學效應，對細胞焦亡、炎癥因子釋放及組織損傷修復等過程產生著深遠影響。在免疫防御方面，NLRP3炎癥小體作為機體固有免疫的重要組成部分，能夠識別多種病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），迅速啟動免疫應答，為機體抵御病原體入侵提供關鍵的早期防御機制。當細菌、病毒等病原體感染機體時，NLRP3炎癥小體可以識別病原體表面的特定分子，如細菌的脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白，病毒的核酸等，激活炎癥小體，促使Caspase-1活化，進而切割并釋放成熟的IL-1β和IL-18等炎性細胞因子。這些細胞因子能夠招募和激活免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，增強它們對病原體的吞噬和殺傷能力，從而有效地清除病原體，保護機體免受感染。例如，在肺炎鏈球菌感染小鼠模型中，NLRP3炎癥小體被激活后，釋放的IL-1β和IL-18能夠促進巨噬細胞的活化和聚集，增強巨噬細胞對肺炎鏈球菌的吞噬作用，降低肺部細菌載量，減輕肺部炎癥。在炎癥反應過程中，NLRP3炎癥小體的激活是炎癥級聯反應的關鍵環節。一旦NLRP3炎癥小體被激活，Caspase-1被活化，它不僅能夠切割前炎性細胞因子IL-1β和IL-18，使其成熟并釋放到細胞外，引發局部炎癥反應；還能切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域，該結構域可在細胞膜上打孔，導致細胞發生焦亡。細胞焦亡是一種程序性壞死，伴隨著大量炎癥介質的釋放，如IL-1α、IL-1β、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，這些炎癥介質進一步吸引免疫細胞浸潤，擴大炎癥反應范圍，形成炎癥級聯放大效應。以痛風性關節炎為例，尿酸結晶作為一種DAMP，能夠激活NLRP3炎癥小體，引發細胞焦亡和炎癥因子釋放，導致關節局部炎癥反應加劇，出現紅腫、疼痛等癥狀。細胞焦亡是NLRP3炎癥小體激活后的重要效應之一。如前所述，Caspase-1切割GSDMD產生的GSDMD-N端結構域會在細胞膜上形成孔道，使細胞內的離子和小分子物質外流，細胞外的水分內流，導致細胞腫脹、破裂，最終發生焦亡。細胞焦亡與細胞凋亡不同，它是一種炎癥性程序性壞死，在清除病原體感染細胞的同時，也會釋放大量炎癥介質，引發強烈的炎癥反應。研究表明，在腸道感染模型中，NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡能夠有效地清除感染的腸道上皮細胞，阻止病原體的進一步擴散，但同時也會導致腸道黏膜炎癥損傷，影響腸道正常功能。炎癥因子釋放是NLRP3炎癥小體發揮作用的重要方式。IL-1β和IL-18是NLRP3炎癥小體激活后釋放的關鍵炎癥因子，它們具有廣泛的生物學活性。IL-1β可以激活T細胞、B細胞等免疫細胞，促進它們的增殖和分化，增強免疫應答；還能誘導血管內皮細胞表達黏附分子，促進白細胞的黏附和遷移，加重炎癥反應。IL-18則主要協同IL-12等細胞因子，促進Th1細胞的分化和IFN-γ的產生，增強機體的細胞免疫功能。此外，NLRP3炎癥小體激活還可能導致其他炎癥因子如TNF-α、IL-6等的釋放，這些炎癥因子相互作用，形成復雜的炎癥網絡，共同調節炎癥反應的強度和持續時間。在膿毒癥模型中，NLRP3炎癥小體的過度激活會導致大量炎癥因子釋放，引發全身炎癥反應綜合征，嚴重時可導致多器官功能衰竭。NLRP3炎癥小體對組織損傷修復也具有重要影響。在生理狀態下，適度的NLRP3炎癥小體激活有助于啟動組織修復過程。炎癥因子的釋放可以招募成纖維細胞、內皮細胞等參與組織修復的細胞到損傷部位，促進細胞外基質的合成和血管新生，加速組織修復。然而，在病理狀態下，NLRP3炎癥小體的過度激活可能導致炎癥反應失控，對組織造成進一步損傷，阻礙組織修復進程。例如，在心肌梗死模型中，早期NLRP3炎癥小體的激活可以促進炎癥細胞浸潤，清除壞死組織，啟動修復過程；但如果NLRP3炎癥小體持續過度激活，炎癥因子大量釋放，會導致心肌細胞凋亡增加，心肌纖維化加重，影響心臟功能的恢復。三、內皮損傷與肺動脈高壓的關系3.1內皮細胞的功能與特點肺動脈內皮細胞（PulmonaryArteryEndothelialCells，PAECs）作為襯覆在肺動脈血管內壁的單層扁平上皮細胞，在維持肺血管系統的正常生理功能中發揮著不可或缺的作用。其獨特的結構和生理功能，使其成為肺循環穩定的關鍵因素。從結構上看，PAECs呈扁平狀，細胞間緊密連接，形成了一道連續的屏障，有效分隔血管內血液與血管壁組織。這種緊密連接結構不僅維持了血管壁的完整性，還嚴格調控著物質的跨膜運輸，確保只有特定的營養物質、氣體和信號分子能夠在血液與組織間進行交換，阻止有害物質進入血管壁，保護肺血管免受損傷。此外，PAECs表面還存在豐富的微絨毛和凹陷，這些特殊結構增加了細胞的表面積，有助于其與血液成分充分接觸，更高效地感知血流動力學變化和循環中的信號分子，從而及時做出相應的生理調節反應。PAECs具有活躍的代謝能力，能夠合成和分泌多種生物活性物質，這些物質在調節血管張力、維持凝血與纖溶平衡、抑制炎癥反應以及調控細胞增殖和凋亡等方面發揮著關鍵作用。在調節血管張力方面，PAECs主要通過釋放血管舒張因子和血管收縮因子來實現。一氧化氮（NO）作為一種重要的血管舒張因子，由PAECs內的一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成。NO能夠迅速擴散到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶，使細胞內cGMP水平升高，導致血管平滑肌舒張，從而降低肺動脈壓力。前列環素（PGI?）也是PAECs分泌的一種強效血管舒張劑，它通過刺激腺苷酸環化酶，增加細胞內cAMP水平，抑制血管平滑肌細胞的收縮，同時還具有抑制血小板聚集的作用。與之相對，PAECs分泌的內皮素-1（ET-1）則是一種強烈的血管收縮因子。ET-1與血管平滑肌細胞表面的內皮素受體結合，激活磷脂酶C，促使細胞內鈣離子濃度升高，引發血管平滑肌收縮，使肺動脈壓力升高。正常情況下，PAECs分泌的血管舒張因子和收縮因子處于動態平衡，維持著肺動脈的正常張力。當這種平衡被打破時，就可能導致肺動脈高壓的發生。在維持凝血與纖溶平衡方面，PAECs同樣發揮著重要作用。PAECs能夠合成和分泌多種凝血因子和抗凝因子，如組織因子（TF）、血栓調節蛋白（TM）、蛋白C、組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）等。TF是外源性凝血途徑的啟動因子，當PAECs受損時，TF表達增加，可啟動凝血級聯反應，促進血栓形成。而TM則與凝血酶結合，激活蛋白C，蛋白C在蛋白S的協同作用下，能夠滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa，發揮抗凝作用。t-PA可將纖溶酶原轉化為纖溶酶，促進纖維蛋白溶解，而PAI-1則抑制t-PA的活性，調節纖溶過程。PAECs通過精細調控這些凝血和纖溶因子的表達和釋放，維持著血管內血液的正常流動狀態，防止血栓形成和出血傾向。PAECs還具有抑制炎癥反應的功能。在生理狀態下，PAECs能夠分泌多種抗炎因子，如一氧化氮、前列環素等，這些因子不僅具有舒張血管的作用，還能夠抑制炎癥細胞的黏附、遷移和活化，減輕炎癥反應對血管壁的損傷。此外，PAECs表面表達的黏附分子，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等，在炎癥反應中起到關鍵作用。當PAECs受到炎癥刺激時，這些黏附分子的表達上調，能夠與炎癥細胞表面的相應配體結合，介導炎癥細胞向血管壁的黏附和遷移，引發炎癥反應。PAECs也能夠通過分泌趨化因子，如單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，吸引炎癥細胞到炎癥部位，參與免疫防御反應。正常情況下，PAECs能夠嚴格控制炎癥反應的程度和范圍，使其在抵御病原體入侵和修復組織損傷的同時，避免過度炎癥反應對血管造成損害。PAECs在調控細胞增殖和凋亡方面也發揮著重要作用。在生理狀態下，PAECs的增殖和凋亡處于動態平衡，以維持血管內皮的正常結構和功能。PAECs能夠分泌多種生長因子和細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些因子可以促進內皮細胞的增殖和遷移，參與血管的生長和修復過程。PAECs也受到多種內源性和外源性因素的調控，當細胞受到損傷或應激時，PAECs可能發生凋亡，以清除受損細胞，維持血管內皮的完整性。然而，在某些病理情況下，如炎癥、氧化應激等，PAECs的增殖和凋亡平衡被打破，可能導致內皮細胞過度增殖或凋亡，進而影響血管的正常功能。3.2內皮損傷在肺動脈高壓發病中的作用內皮損傷在肺動脈高壓（PH）的發病過程中扮演著關鍵角色，是引發一系列病理生理改變的重要起始環節。當肺動脈內皮細胞受到各種致病因素的刺激，如炎癥、氧化應激、血流動力學異常等，其結構和功能會遭到破壞，進而引發一系列復雜的病理變化，最終導致肺動脈高壓的發生和發展。內皮損傷會打破血管活性物質的平衡狀態。正常情況下，肺動脈內皮細胞能夠合成和釋放多種血管活性物質，包括血管舒張因子如一氧化氮（NO）和前列環素（PGI?），以及血管收縮因子如內皮素-1（ET-1）等，這些物質相互協調，維持著肺血管的正常張力。然而，當內皮細胞受損時，這種平衡被打破。研究表明，在多種肺動脈高壓模型及患者體內，均發現內皮細胞合成和釋放NO及PGI?的能力顯著下降。這是因為內皮損傷可導致一氧化氮合酶（NOS）活性降低，使NO生成減少；同時，前列環素合酶表達下調，PGI?合成受阻。NO作為一種重要的血管舒張因子，具有強大的舒張血管平滑肌、抑制血小板聚集和抗增殖作用。NO生成減少會削弱其對血管的舒張作用，導致肺血管阻力增加。PGI?同樣具有舒張血管、抑制血小板聚集和抑制血管平滑肌細胞增殖的功能，其合成減少也會促進肺血管收縮和重構。與之相反，內皮損傷會促使血管收縮因子ET-1的合成和釋放顯著增加。ET-1是一種強效的血管收縮肽，由內皮細胞產生。內皮損傷后，ET-1基因表達上調，其分泌量增多。ET-1與血管平滑肌細胞表面的內皮素受體結合，激活磷脂酶C，促使細胞內鈣離子濃度升高，引發血管平滑肌強烈收縮，導致肺動脈壓力升高。ET-1還具有促有絲分裂作用，可刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移，促進肺血管重構。血管活性物質失衡導致的肺血管收縮和重構是肺動脈高壓發病的重要機制之一。內皮損傷會激活炎癥反應，在肺動脈高壓的發生發展中起著重要作用。內皮細胞受損后，會表達和釋放多種炎性細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些炎性因子能夠招募和激活炎癥細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等，使其向肺血管壁浸潤。巨噬細胞被招募到肺血管壁后，會釋放更多的炎癥介質，進一步放大炎癥反應。炎癥細胞釋放的活性氧（ROS）、蛋白水解酶等物質會進一步損傷內皮細胞，形成惡性循環，加劇肺動脈高壓的進展。研究發現，在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，肺組織中IL-1β、IL-6等炎性因子水平顯著升高，同時伴有大量炎癥細胞浸潤，且炎癥反應的程度與肺動脈高壓的嚴重程度呈正相關。內皮損傷引發的炎癥反應還會導致血管內皮細胞表面黏附分子表達上調，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些黏附分子能夠與炎癥細胞表面的相應配體結合，促進炎癥細胞黏附到血管內皮細胞上，進而遷移到血管壁內，引發炎癥反應和血管重構。ICAM-1和VCAM-1的高表達在肺動脈高壓患者的肺血管內皮細胞中得到證實，阻斷這些黏附分子的作用可以減輕炎癥細胞浸潤和肺血管重構，改善肺動脈高壓的病情。血管重構是肺動脈高壓的重要病理特征，而內皮損傷在這一過程中發揮著關鍵作用。內皮損傷后，由于血管活性物質失衡和炎癥反應的激活，會促使肺血管平滑肌細胞（PASMCs）發生增殖、遷移和表型轉換，導致血管壁增厚、管腔狹窄，肺血管阻力增加。ET-1等血管收縮因子不僅能引起血管平滑肌收縮，還能作為促有絲分裂原，刺激PASMCs增殖和遷移。在體外實驗中，給予ET-1刺激可顯著促進PASMCs的增殖和遷移能力。炎癥細胞釋放的細胞因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，也能促進PASMCs的增殖和遷移，并誘導其表型從收縮型向合成型轉換，合成更多的細胞外基質，導致血管壁增厚。研究表明，在肺動脈高壓患者和動物模型中，肺血管壁中PASMCs數量增多，細胞外基質成分如膠原蛋白、彈性纖維等含量增加，血管壁增厚，管腔狹窄，肺血管重構明顯。內皮損傷還會導致肺動脈內皮細胞的凋亡增加，這進一步破壞了血管內皮的完整性，促進了血管重構的發生。氧化應激、炎癥因子等因素均可誘導內皮細胞凋亡。內皮細胞凋亡后，會釋放一些促凝物質和細胞碎片，這些物質會激活凝血系統，促進血栓形成，進一步加重肺血管阻塞和肺動脈高壓。研究發現，在低氧誘導的肺動脈高壓小鼠模型中，肺血管內皮細胞凋亡明顯增加，且與肺血管重構和肺動脈壓力升高密切相關。3.3內皮損傷的檢測指標與方法在研究內皮損傷與肺動脈高壓的關系時，準確檢測內皮損傷的程度和相關變化至關重要。目前，常用的檢測指標涵蓋了內皮素-1、一氧化氮、血管內皮生長因子等多個關鍵物質，這些指標從不同角度反映了內皮細胞的功能狀態和損傷程度。內皮素-1（ET-1）作為一種由內皮細胞分泌的強效血管收縮肽，在維持血管張力和血壓穩定方面發揮著重要作用。在病理狀態下，如肺動脈高壓時，內皮細胞受損，ET-1的合成和釋放會顯著增加。檢測血漿或組織中的ET-1水平，能有效反映內皮損傷程度。臨床上，常采用放射免疫法（RIA）來測定ET-1含量。該方法利用放射性核素標記的抗原與未標記的抗原競爭性結合特異性抗體的原理，通過測量放射性強度來計算樣品中ET-1的含量。酶聯免疫吸附測定法（ELISA）也被廣泛應用，其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體表面，通過抗原-抗體特異性結合，再加入酶標記的二抗，最后利用酶底物顯色來檢測ET-1水平。ELISA法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優點，能夠快速準確地測定大量樣品中的ET-1含量。一氧化氮（NO）是內皮細胞產生的重要血管舒張因子，對維持血管的正常舒張功能起著關鍵作用。當內皮細胞受損時，NO的合成和釋放減少，導致血管舒張功能障礙，進而參與肺動脈高壓的發生發展。檢測NO水平可間接反映內皮細胞的功能狀態。目前，常用的檢測方法有硝酸還原酶法和化學發光法。硝酸還原酶法是利用硝酸還原酶將NO??還原為NO??，通過比色法測定NO??的含量，從而間接反映NO的水平?；瘜W發光法則是基于NO與臭氧發生化學反應產生激發態的NO?，當激發態的NO?回到基態時會發射出光子，通過檢測光子的強度來定量測定NO的含量。化學發光法具有靈敏度高、檢測速度快等優點，能夠實時準確地檢測NO水平的變化。血管內皮生長因子（VEGF）是一種對血管內皮細胞的增殖、遷移和存活具有重要調節作用的細胞因子。在生理狀態下，VEGF參與血管的生成和修復過程；而在病理狀態，如內皮損傷時，VEGF的表達會發生改變。檢測VEGF水平有助于評估內皮損傷程度和血管修復情況。通常采用ELISA法檢測血漿或組織中的VEGF含量。此外，實時熒光定量PCR技術也可用于檢測VEGF基因的表達水平，通過測定VEGFmRNA的含量，從基因層面了解VEGF的表達變化。實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、特異性強、可定量等優點，能夠準確地反映VEGF基因的表達情況。血管性假血友病因子（vWF）作為內皮細胞特有的一種血漿糖蛋白，在止血和血栓形成過程中發揮重要作用。當內皮細胞受損時，vWF從內皮細胞的棒管狀小體中釋放增加，其血漿水平升高。因此，檢測血漿vWF水平可作為內皮損傷的重要指標之一。臨床常用ELISA法測定vWF含量。通過將vWF特異性抗體包被在酶標板上，與樣品中的vWF結合，再加入酶標記的二抗，利用酶底物顯色反應來檢測vWF的含量。ELISA法操作簡便、靈敏度高，能夠準確地測定血漿vWF水平，為內皮損傷的診斷和評估提供重要依據。細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）是內皮細胞表面的重要黏附分子，在炎癥反應和白細胞黏附、遷移過程中發揮關鍵作用。當內皮細胞受到損傷或炎癥刺激時，ICAM-1和VCAM-1的表達上調。檢測血漿中可溶性ICAM-1（sICAM-1）和可溶性VCAM-1（sVCAM-1）的水平，或通過免疫組化、免疫熒光等方法檢測內皮細胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達情況，可評估內皮損傷和炎癥反應程度。免疫組化法是利用抗原-抗體特異性結合的原理，通過標記的抗體與組織切片中的ICAM-1或VCAM-1結合，再利用顯色劑顯色，在顯微鏡下觀察其表達情況。免疫熒光法則是用熒光素標記的抗體與組織切片中的ICAM-1或VCAM-1結合，通過熒光顯微鏡觀察熒光強度來確定其表達水平。這些方法能夠直觀地反映ICAM-1和VCAM-1在組織中的表達位置和強度，為研究內皮損傷與炎癥反應的關系提供重要信息。四、NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷的機制4.1NLRP3炎癥小體激活對內皮細胞的直接作用NLRP3炎癥小體激活后，會對內皮細胞的存活、增殖和遷移能力產生直接影響，進而改變內皮細胞的形態和功能。在細胞存活方面，研究表明NLRP3炎癥小體的激活可誘導內皮細胞凋亡，降低細胞存活率。當給予人肺動脈內皮細胞（HPAEC）NLRP3激動劑尼日利亞菌素刺激后，通過流式細胞術檢測發現，細胞凋亡率顯著升高。這一現象與NLRP3炎癥小體激活后，Caspase-1的活化密切相關?；罨腃aspase-1可切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域，該結構域在細胞膜上打孔，導致細胞發生焦亡。研究還發現，NLRP3炎癥小體激活后釋放的炎性細胞因子IL-1β和IL-18，也能通過激活下游凋亡相關信號通路，如caspase-3、caspase-9等，誘導內皮細胞凋亡，進一步降低細胞存活率。對內皮細胞增殖能力的影響同樣顯著。利用CCK-8法檢測發現，經尼日利亞菌素處理的HPAEC細胞，其增殖能力明顯受到抑制。這是因為NLRP3炎癥小體激活引發的炎癥反應，干擾了細胞周期的正常進程。研究表明，NLRP3炎癥小體激活后，細胞周期相關蛋白如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等的表達下調，導致細胞周期阻滯在G0/G1期，無法進入S期進行DNA合成和細胞增殖。炎癥因子IL-1β和IL-18還可通過抑制細胞增殖相關信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，抑制內皮細胞的增殖。內皮細胞的遷移能力在維持血管內皮完整性和修復受損血管中起著重要作用，而NLRP3炎癥小體激活會損害這一能力。采用Transwell小室實驗和劃痕實驗檢測內皮細胞遷移能力，結果顯示，經NLRP3激動劑刺激的內皮細胞遷移能力明顯下降。這主要是因為NLRP3炎癥小體激活后，細胞骨架蛋白的表達和分布發生改變。研究發現，NLRP3炎癥小體激活后，肌動蛋白（actin）的聚合和解聚過程受到干擾，導致細胞偽足形成和伸展受阻，從而影響內皮細胞的遷移能力。炎癥因子IL-1β和IL-18還可通過抑制內皮細胞表面黏附分子如整合素（integrin）的表達，降低內皮細胞與細胞外基質的黏附能力，進一步抑制內皮細胞的遷移。在形態方面，正常情況下，內皮細胞呈扁平狀，細胞間緊密連接，形成連續的單層結構。然而，當NLRP3炎癥小體激活后，內皮細胞形態發生明顯改變。通過顯微鏡觀察發現，內皮細胞變得腫脹、變形，細胞間連接松散，出現間隙。這是由于NLRP3炎癥小體激活引發的細胞凋亡、焦亡以及細胞骨架改變等多種因素共同作用的結果。細胞形態的改變會破壞血管內皮的完整性，增加血管通透性，導致血液中的物質滲出到血管外，引發局部組織水腫和炎癥反應。在功能方面，NLRP3炎癥小體激活會導致內皮細胞分泌功能紊亂。正常情況下，內皮細胞能夠合成和分泌多種生物活性物質，如一氧化氮（NO）、前列環素（PGI?）、內皮素-1（ET-1）等，這些物質對于維持血管張力、抑制血小板聚集和調節血管平滑肌細胞增殖等具有重要作用。當NLRP3炎癥小體激活后，內皮細胞合成和釋放NO和PGI?的能力顯著下降，而ET-1的分泌則明顯增加。研究表明，NLRP3炎癥小體激活后，一氧化氮合酶（NOS）的活性受到抑制，導致NO生成減少；同時，前列環素合酶表達下調，PGI?合成受阻。相反，ET-1基因表達上調，其分泌量增多。這種血管活性物質的失衡會導致血管收縮增強、血小板聚集增加以及血管平滑肌細胞增殖，進而促進肺動脈高壓的發生發展。4.2NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應對內皮損傷的影響NLRP3炎癥小體激活后，會引發一系列炎癥反應，這對內皮細胞造成了嚴重損傷。其釋放的炎癥因子如IL-1β、IL-18等，在其中發揮著關鍵作用。IL-1β作為一種重要的促炎細胞因子，在NLRP3炎癥小體激活后大量釋放。它能夠與內皮細胞表面的特異性受體IL-1R結合，激活下游的信號通路，如NF-κB和MAPK信號通路。激活的NF-κB轉位進入細胞核，調節相關基因的表達，促使多種炎癥介質和黏附分子的合成與釋放增加，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些黏附分子的上調使得內皮細胞與炎癥細胞之間的黏附作用增強，導致炎癥細胞大量黏附并遷移至內皮細胞表面，進一步釋放活性氧（ROS）和蛋白水解酶等物質，對內皮細胞造成直接損傷，破壞內皮細胞的結構和功能。研究表明，在體外培養的人肺動脈內皮細胞中，加入外源性IL-1β刺激后，ICAM-1和VCAM-1的表達顯著增加，細胞活力明顯下降，且細胞凋亡率升高。IL-18同樣對內皮細胞具有顯著的損傷作用。IL-18可以誘導內皮細胞產生氧化應激反應，促使細胞內ROS水平升高。ROS的積累會導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質氧化修飾以及DNA損傷，從而破壞內皮細胞的正常結構和功能。IL-18還能通過激活JNK和p38MAPK等信號通路，誘導內皮細胞凋亡相關蛋白如Bax的表達上調，同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，使細胞凋亡相關蛋白比例失衡，最終導致內皮細胞凋亡增加。有研究在小鼠肺動脈高壓模型中發現，給予IL-18抗體阻斷IL-18的作用后，肺血管內皮細胞的凋亡明顯減少，肺血管重構程度減輕，肺動脈壓力降低，這進一步證實了IL-18在介導內皮損傷和肺動脈高壓發展中的重要作用。炎癥反應還可通過其他途徑導致內皮細胞凋亡和壞死。NLRP3炎癥小體激活后，Caspase-1的活化不僅會切割IL-1β和IL-18前體，還會切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域。GSDMD-N端結構域在細胞膜上形成孔道，導致細胞內離子失衡、滲透壓改變，細胞發生腫脹、破裂，最終導致細胞壞死，這種壞死過程伴有炎癥介質的釋放，進一步加劇了炎癥反應和內皮損傷。炎癥反應還會導致線粒體功能障礙，使線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡誘導因子，激活caspase-9和caspase-3等凋亡相關蛋白酶，引發內皮細胞凋亡。在脂多糖誘導的內皮細胞炎癥損傷模型中，觀察到線粒體膜電位明顯降低，細胞色素C釋放增加，caspase-3活性顯著升高，內皮細胞凋亡率明顯上升。4.3NLRP3炎癥小體與氧化應激在內皮損傷中的協同作用NLRP3炎癥小體激活與氧化應激之間存在著緊密且復雜的相互關系，在肺動脈高壓的發生發展過程中，兩者協同作用，共同導致內皮細胞損傷和功能障礙，進一步推動疾病的惡化。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內活性氧（ROS）產生過多，超出了機體抗氧化防御系統的清除能力，導致ROS在體內蓄積，從而引起氧化損傷的病理過程。在肺動脈高壓中，氧化應激扮演著關鍵角色，它不僅是NLRP3炎癥小體激活的重要上游信號，還能與NLRP3炎癥小體相互促進，形成惡性循環，加劇內皮細胞損傷。研究表明，多種因素可導致肺動脈內皮細胞內ROS水平升高，引發氧化應激。低氧是肺動脈高壓發生發展過程中常見的刺激因素之一，在低氧環境下，內皮細胞線粒體呼吸鏈功能受損，電子傳遞受阻，導致ROS生成顯著增加。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等也能誘導內皮細胞產生氧化應激。這些炎癥因子與內皮細胞表面的相應受體結合后，激活細胞內的信號通路，促使NADPH氧化酶等ROS生成酶的活性增強，從而導致ROS大量產生。升高的ROS可以通過多種途徑激活NLRP3炎癥小體。ROS可直接氧化修飾NLRP3蛋白，改變其構象，使其從無活性狀態轉變為有活性狀態。研究發現，在氧化應激條件下，NLRP3蛋白上的半胱氨酸殘基可被氧化，形成二硫鍵，從而導致NLRP3蛋白的寡聚化和活化。ROS還能通過調節細胞內離子濃度，間接激活NLRP3炎癥小體。ROS可促使細胞內的鉀離子外流，而鉀離子外流是NLRP3炎癥小體激活的關鍵信號之一。ROS還能通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促進NLRP3炎癥小體的激活。一旦NLRP3炎癥小體被激活，又會進一步加重氧化應激。NLRP3炎癥小體激活后，Caspase-1被活化，促使炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放。這些炎性細胞因子可以刺激內皮細胞產生更多的ROS，加劇氧化應激。IL-1β能夠激活NADPH氧化酶，增加ROS的生成；IL-18則可以誘導內皮細胞產生一氧化氮（NO），NO與超氧陰離子反應生成過氧化亞硝酸鹽，進一步加重氧化損傷。NLRP3炎癥小體激活還可導致細胞焦亡，細胞焦亡過程中會釋放大量炎癥介質和ROS，進一步加劇氧化應激和炎癥反應。在這種協同作用下，內皮細胞損傷不斷加重。氧化應激導致細胞膜脂質過氧化，破壞細胞膜的完整性和流動性，使細胞膜的通透性增加，細胞內的離子和小分子物質外流，細胞外的水分內流，導致細胞腫脹、破裂。氧化應激還能使蛋白質氧化修飾，影響蛋白質的結構和功能，如導致酶活性降低、信號傳導通路異常等。DNA損傷也是氧化應激的重要后果之一，ROS可攻擊DNA，導致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷，影響細胞的正常增殖和分化，甚至引發細胞凋亡。NLRP3炎癥小體激活引發的炎癥反應和細胞焦亡，進一步破壞內皮細胞的結構和功能。炎癥因子的釋放會招募和激活炎癥細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，這些炎癥細胞在吞噬病原體和損傷組織的同時，也會釋放大量的ROS和蛋白水解酶，對內皮細胞造成直接損傷。細胞焦亡導致細胞膜破裂，細胞內容物釋放，引發炎癥反應，進一步加重內皮細胞損傷。研究表明，在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，肺血管內皮細胞內ROS水平顯著升高，NLRP3炎癥小體相關蛋白表達上調，IL-1β和IL-18等炎性細胞因子釋放增加，內皮細胞損傷明顯。給予抗氧化劑或NLRP3炎癥小體抑制劑干預后，可顯著降低ROS水平，抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少炎性細胞因子的釋放，減輕內皮細胞損傷，降低肺動脈壓力。在體外培養的肺動脈內皮細胞實驗中，也觀察到類似的結果，證實了NLRP3炎癥小體與氧化應激在導致內皮損傷中的協同作用。五、NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷在肺動脈高壓中的作用機制5.1NLRP3炎癥小體-內皮損傷-肺動脈高壓軸的形成NLRP3炎癥小體的激活、內皮損傷與肺動脈高壓的發生發展之間存在著緊密的聯系，它們相互作用，形成了一個復雜的病理生理軸，共同推動疾病的進展。在正常生理狀態下，肺血管內皮細胞保持著良好的結構和功能，能夠有效維持肺血管的正常張力和通透性，確保肺循環的穩定。然而，當機體受到各種致病因素的刺激時，如長期低氧、炎癥、氧化應激等，NLRP3炎癥小體的激活成為了這個病理生理過程的起始環節。這些致病因素可通過多種途徑激活NLRP3炎癥小體，如前文所述，低氧可導致線粒體功能障礙，產生大量活性氧（ROS），ROS作為重要的上游信號，可直接氧化修飾NLRP3蛋白，使其活化；同時，低氧還能引起細胞內鉀離子外流，進一步促進NLRP3炎癥小體的組裝和激活。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等也能通過與細胞表面受體結合，激活下游信號通路，啟動NLRP3炎癥小體的激活過程。一旦NLRP3炎癥小體被激活，便會對內皮細胞產生直接的損傷作用。NLRP3炎癥小體激活后，Caspase-1被活化，它不僅能夠切割無活性的前炎性細胞因子IL-1β和IL-18，使其成熟并釋放到細胞外，引發強烈的炎癥反應；還能切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域，該結構域可在細胞膜上打孔，導致細胞發生焦亡。細胞焦亡伴隨著大量炎癥介質的釋放，進一步加重了炎癥反應對內皮細胞的損傷。研究表明，在體外培養的人肺動脈內皮細胞中，給予NLRP3激動劑尼日利亞菌素刺激后，細胞凋亡率顯著升高，細胞增殖能力受到抑制，遷移能力下降，細胞形態發生改變，變得腫脹、變形，細胞間連接松散，出現間隙。同時，內皮細胞的分泌功能也發生紊亂，合成和釋放一氧化氮（NO）、前列環素（PGI?）等血管舒張因子的能力顯著下降，而內皮素-1（ET-1）等血管收縮因子的分泌則明顯增加。NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應也對內皮細胞造成了嚴重的損傷。IL-1β和IL-18等炎癥因子釋放后，可與內皮細胞表面的特異性受體結合，激活下游的信號通路，如NF-κB和MAPK信號通路。激活的NF-κB轉位進入細胞核，調節相關基因的表達，促使多種炎癥介質和黏附分子的合成與釋放增加，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些黏附分子的上調使得內皮細胞與炎癥細胞之間的黏附作用增強，導致炎癥細胞大量黏附并遷移至內皮細胞表面，進一步釋放活性氧（ROS）和蛋白水解酶等物質，對內皮細胞造成直接損傷，破壞內皮細胞的結構和功能。IL-1β和IL-18還能誘導內皮細胞產生氧化應激反應，促使細胞內ROS水平升高，導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質氧化修飾以及DNA損傷，從而破壞內皮細胞的正常結構和功能。內皮損傷在肺動脈高壓的發病過程中起著關鍵作用，它是連接NLRP3炎癥小體激活與肺動脈高壓發生發展的重要橋梁。內皮損傷導致血管活性物質失衡，NO和PGI?等血管舒張因子合成和釋放減少，ET-1等血管收縮因子分泌增加，從而導致肺血管收縮，肺動脈壓力升高。內皮損傷還會激活炎癥反應，促進炎癥細胞浸潤，進一步加重肺血管損傷和重構。研究表明，在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，肺血管內皮細胞損傷明顯，同時伴有炎癥細胞浸潤和肺血管重構，肺動脈壓力顯著升高。肺血管重構是肺動脈高壓的重要病理特征，也是NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷導致肺動脈高壓的重要環節。內皮損傷后，由于血管活性物質失衡和炎癥反應的激活，會促使肺血管平滑肌細胞（PASMCs）發生增殖、遷移和表型轉換，導致血管壁增厚、管腔狹窄，肺血管阻力增加。ET-1等血管收縮因子不僅能引起血管平滑肌收縮，還能作為促有絲分裂原，刺激PASMCs增殖和遷移。炎癥細胞釋放的細胞因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，也能促進PASMCs的增殖和遷移，并誘導其表型從收縮型向合成型轉換，合成更多的細胞外基質，導致血管壁增厚。在肺動脈高壓患者和動物模型中，均觀察到肺血管壁中PASMCs數量增多，細胞外基質成分如膠原蛋白、彈性纖維等含量增加，血管壁增厚，管腔狹窄，肺血管重構明顯。右心室肥厚是肺動脈高壓進展到一定階段的重要表現，也是NLRP3炎癥小體-內皮損傷-肺動脈高壓軸的最終結果之一。隨著肺動脈壓力的持續升高，右心室需要克服更大的后負荷，導致右心室心肌細胞代償性肥大，心肌間質纖維化，最終導致右心室肥厚和右心衰竭。研究表明，在肺動脈高壓患者中，右心室肥厚程度與NLRP3炎癥小體激活程度、內皮損傷程度以及肺動脈壓力升高程度密切相關。NLRP3炎癥小體的激活通過誘導內皮損傷，引發血管活性物質失衡、炎癥反應和肺血管重構等一系列病理生理變化，最終導致肺動脈高壓的發生發展，形成了NLRP3炎癥小體-內皮損傷-肺動脈高壓軸。深入研究這個軸的形成機制，對于揭示肺動脈高壓的發病機制，尋找新的治療靶點具有重要意義。5.2相關信號通路在其中的調節作用在NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓的復雜病理過程中，NF-κB和MAPK等信號通路發揮著關鍵的調節作用，它們相互交織，共同調控炎癥反應、細胞增殖與凋亡等生理病理過程，深刻影響著疾病的發生發展。NF-κB信號通路在NLRP3炎癥小體激活及內皮損傷中扮演著核心角色。在靜息狀態下，NF-κB以無活性的形式存在于細胞質中，與抑制蛋白IκB結合形成復合物。當細胞受到病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）等刺激時，細胞膜上的Toll樣受體（TLRs）等模式識別受體被激活，進而招募髓樣分化因子88（MyD88），激活下游的絲氨酸蛋白激酶IKK復合體。IKK復合體使IκB發生磷酸化，導致IκB降解，從而釋放出NF-κB?；罨腘F-κB迅速轉位進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，調控相關基因的表達。在NLRP3炎癥小體激活過程中，NF-κB信號通路的活化是重要的起始步驟。研究表明，脂多糖（LPS）刺激可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，上調NLRP3、pro-IL-1β等基因的表達，為NLRP3炎癥小體的組裝和激活提供物質基礎。在肺動脈內皮細胞中，NF-κB的激活還會促使細胞表達和釋放多種炎性細胞因子和趨化因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等，這些炎癥介質進一步招募和激活炎癥細胞，引發炎癥反應，導致內皮細胞損傷。通過使用NF-κB抑制劑PDTC處理細胞，可顯著抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體相關蛋白表達和炎性細胞因子釋放，減輕內皮細胞損傷。MAPK信號通路也是NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓的重要調節通路，主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條途徑。當細胞受到炎癥、氧化應激等刺激時，MAPK信號通路被激活。以ERK通路為例，生長因子、細胞因子等刺激可使細胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）磷酸化，招募并激活Ras蛋白，Ras激活Raf蛋白，進而依次激活MEK1/2和ERK1/2?；罨腅RK1/2可轉位進入細胞核，調節相關基因的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。在NLRP3炎癥小體激活過程中，MAPK信號通路發揮著重要的調節作用。研究發現，ROS等刺激可激活MAPK信號通路，其中p38MAPK和JNK的活化可促進NLRP3炎癥小體的組裝和激活，增加IL-1β和IL-18的成熟與釋放。在肺動脈高壓模型中，MAPK信號通路的激活與肺血管平滑肌細胞增殖、遷移和表型轉換密切相關。抑制p38MAPK的活性，可減少肺血管平滑肌細胞的增殖和遷移，減輕肺血管重構，降低肺動脈壓力。在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，給予p38MAPK抑制劑SB203580后，肺血管平滑肌細胞的增殖明顯受到抑制，肺血管重構程度減輕，肺動脈壓力降低。NF-κB和MAPK信號通路之間還存在著復雜的交互作用。在NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷過程中，NF-κB信號通路的激活可促進MAPK信號通路的活化，反之亦然。IL-1β等炎癥因子可通過與內皮細胞表面受體結合，激活NF-κB信號通路，同時也能激活MAPK信號通路，兩者相互協同，進一步放大炎癥反應。研究表明，在脂多糖刺激的肺動脈內皮細胞中，抑制NF-κB信號通路可部分抑制MAPK信號通路的激活，減少炎性細胞因子的釋放和內皮細胞損傷。反之，抑制MAPK信號通路也能影響NF-κB信號通路的活性，說明兩條信號通路在NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷與肺動脈高壓過程中相互影響，共同調節疾病的發展。其他信號通路如PI3K/Akt信號通路也參與了這一病理過程。PI3K可被多種刺激激活，如生長因子、細胞因子等，激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活Akt蛋白。Akt蛋白可通過磷酸化多種底物，調節細胞的存活、增殖、代謝等過程。在NLRP3炎癥小體誘導內皮損傷中，PI3K/Akt信號通路的激活可抑制細胞凋亡，促進細胞存活。研究發現，在低氧誘導的肺動脈內皮細胞損傷模型中，激活PI3K/Akt信號通路可減少細胞凋亡，降低NLRP3炎癥小體的激活程度，減輕炎癥反應。PI3K/Akt信號通路還與肺血管平滑肌細胞的增殖和遷移有關，抑制該信號通路可減少肺血管平滑肌細胞的增殖和遷移，緩解肺血管重構。5.3細胞焦亡在肺動脈高壓中的作用及與NLRP3炎癥小體的關系細胞焦亡是一種程序性壞死，具有獨特的形態學和生物學特征。在形態上，發生焦亡的細胞會出現明顯的腫脹，細胞膜完整性被破壞，形成大量的孔洞，最終導致細胞破裂，釋放出細胞內容物。在生物學特征方面，細胞焦亡伴隨著炎癥反應的發生，會釋放大量的炎癥介質，如白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）等。這些炎癥介質能夠招募和激活炎癥細胞，引發局部或全身的炎癥反應，對組織和器官的功能產生嚴重影響。在肺動脈高壓的發病過程中，細胞焦亡扮演著重要角色。研究表明，在多種肺動脈高壓模型及患者體內，均觀察到細胞焦亡現象的增加。在野百合堿（MCT）誘導的大鼠肺動脈高壓模型中，肺血管內皮細胞和肺動脈平滑肌細胞的焦亡水平顯著升高。細胞焦亡導致血管內皮細胞的損傷和功能障礙，破壞了血管內皮的完整性，使血管通透性增加，血液中的物質滲出到血管外，引發局部組織水腫和炎癥反應。細胞焦亡還會促使炎癥細胞浸潤到肺血管壁，進一步釋放炎癥介質和活性氧（ROS），對血管平滑肌細胞造成損傷，導致血管平滑肌細胞增殖、遷移和表型轉換，促進肺血管重構。肺血管重構使得血管壁增厚、管腔狹窄，肺血管阻力增加，最終導致肺動脈壓力升高。在低氧誘導的肺動脈高壓小鼠模型中，給予細胞焦亡抑制劑干預后，可顯著減輕肺血管重構和肺動脈壓力升高，表明細胞焦亡在肺動脈高壓的發展中起到了推動作用。細胞焦亡與NLRP3炎癥小體之間存在著緊密的聯系，二者相互作用，共同參與肺動脈高壓的發病過程。NLRP3炎癥小體的激活是細胞焦亡的重要啟動因素之一。當NLRP3炎癥小體被激活后，Caspase-1被活化，活化的Caspase-1能夠切割gasderminD（GSDMD），產生具有細胞毒性的GSDMD-N端結構域。GSDMD-N端結構域能夠在細胞膜上打孔，導致細胞膜通透性增加，細胞內離子失衡，細胞發生腫脹、破裂，最終引發細胞焦亡。在體外培養的肺動脈內皮細胞中，給予NLRP3激動劑尼日利亞菌素刺激，可激活NLRP3炎癥小體，進而誘導細胞焦亡，表現為細胞腫脹、細胞膜破裂，以及IL-1β和IL-18等炎癥介質的釋放增加。細胞焦亡過程中釋放的炎癥介質又會進一步激活NLRP3炎癥小體，形成正反饋調節環路。細胞焦亡釋放的IL-1β和IL-18等炎癥介質，可與周圍細胞表面的受體結合，激活NF-κB和MAPK等信號通路，促進NLRP3、pro-IL-1β等基因的表達，為NLRP3炎癥小體的再次激活提供物質基礎。IL-1β還能直接作用于NLRP3炎癥小體，促進其組裝和激活，導致更多的Caspase-1活化，進一步加劇細胞焦亡和炎癥反應。在脂多糖誘導的肺動脈內皮細胞炎癥損傷模型中，觀察到細胞焦亡后釋放的IL-1β能夠顯著上調NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達，增強NLRP3炎癥小體的活性。除了經典的NLRP3炎癥小體-Caspase-1-GSDMD途徑外，細胞焦亡還存在其他相關途徑。研究發現，在某些情況下，Caspase-3可以切割gasderminE（GSDME），導致細胞焦亡。在肺動脈高壓中，氧化應激、炎癥等因素可能激活Caspase-3，進而切割GSDME，引發細胞焦亡。細胞毒性淋巴細胞釋放的顆粒酶也可以切割gasdermin家族蛋白，誘導細胞焦亡。在肺動脈高壓的免疫炎癥反應中，這些非經典途徑可能也參與了細胞焦亡的發生，進一步加重了肺血管損傷和炎癥反應。六、基于NLRP3炎癥小體的肺動脈高壓治療策略研究6.1針對NLRP3炎癥小體的藥物研發進展近年來，針對NLRP3炎癥小體的藥物研發成為肺動脈高壓治療領域的研究熱點，眾多科研團隊致力于開發特異性靶向NLRP3炎癥小體的藥物，以阻斷其激活，減輕炎癥反應，從而改善肺動脈高壓患者的病情。目前，相關藥物研發在小分子抑制劑、抗體藥物等方面均取得了一定的進展。小分子抑制劑是當前研究最為廣泛的一類針對NLRP3炎癥小體的藥物。MCC950是一種特異性的NLRP3小分子抑制劑，它能夠直接作用于NLRP3蛋白，通過與NLRP3的NACHT結構域結合，阻斷NLRP3炎癥小體的組裝和激活。在多項動物實驗中，MCC950展現出了顯著的治療效果。在野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型中，給