LncRNA在光敏不育系psm5育性調控中的分子機制與功能解析一、引言1.1研究背景與意義作物雜種優勢的利用是提高作物產量、改善品質以及增強抗逆性的重要途徑，在農業生產中發揮著關鍵作用。雜種優勢指的是兩個遺傳組成不同的親本雜交產生的F1代，在生長勢、生活力、繁殖力、產量等方面優于雙親的現象。自20世紀初期雜種優勢現象被發現并逐漸應用于農業生產以來，已經為全球糧食安全和農業可持續發展做出了巨大貢獻。在雜種優勢利用的過程中，雄性不育系作為一種重要的遺傳資源，扮演著不可或缺的角色。雄性不育系是指雄性器官發育不正常，不能產生有功能的花粉，但雌性器官發育正常，能夠接受外來花粉而受精結實的植物品系。利用雄性不育系進行雜交制種，可以免去人工去雄的繁瑣過程，降低生產成本，提高雜交種子的純度和質量，從而極大地推動雜種優勢的廣泛應用。光敏不育系psm5作為一種特殊的雄性不育系，在作物育種中具有獨特的優勢和重要價值。以棉花為例，棉花是世界上最重要的經濟作物之一，其雜種優勢十分顯著。棉花雜交種通常具有更強的營養生長優勢，表現為植株更加健壯、葉片更加繁茂，能夠充分利用光能和土壤養分，為高產奠定基礎；在產量方面，雜交種往往比常規品種有明顯提高，滿足日益增長的棉花纖維需求；同時，雜交棉還具有更好的抗逆性，如耐高溫、耐濕、耐旱、耐瘠、耐病等，能夠在不同的生態環境和種植條件下保持相對穩定的產量和品質。然而，棉花雜交種的生產長期面臨著一些技術難題。傳統的人工去雄輔助授粉方法制種，需要大量的勞動力投入，隨著勞動力成本的不斷上升，雜交棉種子成本急劇攀升，這在很大程度上限制了雜交棉的種植面積和推廣應用。而棉花“胞質互作不育系”的恢復系篩選困難，難以獲得理想的優勢組合；棉花核不育系制種時需要拔除50%的可育株，不僅操作繁瑣，而且制種產量也受到較大限制。在這樣的背景下，光敏不育系psm5的出現為棉花雜交育種帶來了新的希望。psm5是一種隱性光敏核不育系，具有在日照時間大于12.5h的條件下花藥不開裂、不能正常散粉，表現為雄性不育；而在日照時間小于11.5h的短日照條件下花藥可以正常開裂散粉、恢復正常可育的特性。這種獨特的光敏感特性使得psm5可以作為“兩用系”材料，在長日照條件下用于雜交制種，免去人工去雄的步驟，降低制種成本；在短日照條件下又能自身繁殖，解決了不育系繁殖的難題，為棉花雜交種的大規模生產和應用提供了可能。此外，psm5的恢復系范圍廣，這意味著它能夠與更多的父本材料進行雜交組合，有利于篩選出具有更強雜種優勢的雜交種，進一步提高棉花的產量和品質。植物的育性調控是一個復雜而精細的生物學過程，涉及到眾多基因的表達調控以及環境因素的影響。長鏈非編碼RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA）作為一類長度大于200個核苷酸且不具有編碼蛋白質能力的RNA分子，近年來被發現廣泛參與植物的生長發育、逆境響應等多個生物學過程，在植物育性調控中也發揮著重要作用。lncRNA可以通過多種機制參與植物育性調控。在轉錄水平上，lncRNA可以與DNA序列相互作用，調控基因的轉錄活性。一些lncRNA能夠與轉錄因子結合，影響轉錄因子與DNA啟動子區域的結合能力，從而促進或抑制基因的轉錄。在轉錄后水平，lncRNA可以與mRNA相互作用，影響mRNA的穩定性、剪切、轉運等過程。比如，某些lncRNA可以與mRNA形成互補雙鏈，阻止mRNA被降解，或者影響mRNA的剪切方式，產生不同的剪切異構體。此外，lncRNA還可以作為分子支架，與蛋白質形成復合物，調節蛋白質的活性和功能，進而參與育性調控相關的信號轉導途徑。然而，盡管目前對于lncRNA在植物育性調控中的研究已經取得了一些進展，但相較于模式植物擬南芥和水稻等，在棉花等經濟作物中的研究還相對較少，尤其是關于lncRNA參與光敏不育系psm5育性調控的機制，目前還知之甚少。已有的研究主要集中在鑒定與棉花育性相關的差異表達lncRNA，對于這些lncRNA具體的功能驗證和作用機制研究還不夠深入。在棉花光敏不育系psm5中，哪些lncRNA參與了育性調控過程？它們是如何響應光照條件的變化并調控相關基因的表達？這些問題都有待進一步的研究和探索。本研究聚焦于lncRNA參與光敏不育系psm5育性調控的機制及功能分析，具有重要的理論意義和實踐價值。從理論層面來看，深入探究lncRNA在psm5育性調控中的作用機制，有助于揭示植物育性調控的分子網絡，豐富和完善植物發育生物學的理論體系，為進一步理解植物生長發育過程中的遺傳調控機制提供新的視角和證據。從實踐應用角度而言，明確參與psm5育性調控的關鍵lncRNA及其作用機制，將為作物雜種優勢利用和分子育種提供重要的理論依據和技術支撐。通過對這些關鍵lncRNA的調控，可以實現對作物育性的精準控制，提高雜交育種的效率和成功率，加速優良品種的選育進程，從而為解決全球糧食安全問題和促進農業可持續發展做出積極貢獻。1.2光敏不育系psm5概述光敏不育系psm5最初是通過對棉花品種資源的篩選和雜交育種工作發現的。研究人員在進行棉花雜交試驗時，利用psm4與W10進行雜交，然后經過連續自交3代，成功獲得了與psm4具有相同光敏不育特性的光敏不育系psm5。在后續的研究中，通過對psm5的遺傳分析，發現其不育性狀受隱性基因控制，屬于隱性光敏核不育系。這意味著只有當植株的基因型為隱性純合時才會表現出光敏不育特性，而當植株攜帶顯性基因或雜合時，在適宜的光照條件下能夠保持正常的育性。psm5在不同日照條件下表現出明顯不同的育性特征。在長日照條件下，即日照時間大于12.5h時，psm5的花藥不開裂，無法正常散粉，呈現出雄性不育的狀態。此時，由于花藥不能正常釋放花粉，植株自身無法完成授粉過程，但是其雌性器官發育正常，能夠接受外來花粉進行雜交授粉，這一特性使得psm5在長日照條件下可以作為不育系用于雜交制種，免去了人工去雄的繁瑣步驟，提高了雜交制種的效率和純度。而在短日照條件下，當日照時間小于11.5h時，psm5的花藥能夠正常開裂散粉，花粉活力正常，植株恢復正常的可育性。在這種情況下，psm5可以進行自交繁殖，從而實現自身種子的生產，解決了不育系繁殖的難題。此外，當日照時數在大于12.0小時但小于12.5小時時，psm5接近花朵基部的少量花藥能夠開裂散粉，散出的花粉活力正常，但數量較少，很難自交結鈴，不過仍可用于雜交制種。psm5的育性轉變并非突然發生，而是存在一個相對穩定的轉變時期。研究表明，psm5和psm4育性轉變時期發生在開花前12-15d。在這個時期內，植株對光照時長的變化非常敏感，光照條件的改變會觸發一系列生理生化反應，進而影響花藥的發育和花粉的形成，最終導致育性的轉變。這一育性轉變規律為psm5的實際應用提供了重要的理論依據，育種工作者可以根據這一規律，合理安排種植時間和光照處理，更好地利用psm5進行雜交育種和種子生產。同時，psm5與psm4一樣是典型的孢子體光敏雄性不育系，其不育性由孢子體基因型決定，而與配子體基因型無關。這一遺傳特性使得psm5在雜交育種過程中具有更好的穩定性和可預測性，有利于篩選出具有優良性狀的雜交組合，提高棉花的產量和品質。1.3LncRNA的簡介及在植物育性調控中的研究進展長鏈非編碼RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸且不具備編碼蛋白質能力的RNA分子。起初，lncRNA被視為基因組轉錄過程中產生的“噪音”，是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具備生物學功能。1984年，在小鼠中發現了第一個真核lncRNA——H19，其長度為2.3kb，并且在胚胎發育過程中呈現高表達。此后，越來越多的研究表明，lncRNA在眾多生命活動過程中發揮著重要作用，逐漸引起了人們的廣泛關注。隨著二代測序技術的迅猛發展，越來越多的lncRNA被成功發現和鑒定。根據lncRNA相對于蛋白質編碼基因的基因組位置和方向，可將其分為以下幾類：基因間lncRNA（IntergeniclncRNA），也被稱為“lincRNA”（長間隔非編碼RNA），這類lncRNA位于兩個基因之間的基因間隔區，通常不與已知的蛋白質編碼基因重疊；內含子lncRNA（IntroniclncRNA），產生于基因內的內含子區域，可通過不同的剪接方式形成；正義lncRNA（SenselncRNA），與相鄰基因的正鏈RNA相重疊，一般在同一條染色體上，且與相鄰基因的轉錄方向相同；反義lncRNA（AntisenselncRNA），與SenselncRNA相對，與相鄰基因的負鏈RNA相重疊，轉錄方向與相鄰基因相反；雙向lncRNA（BidirectionallncRNA），從基因的雙向啟動子區域轉錄產生，其轉錄方向與相鄰基因的轉錄方向相反。此外，根據相關的基因組特征，如啟動子、增強子和轉座元件等，還可以對lncRNA進行進一步分類。增強子相關的lncRNAs（eRNAs）長度通常小于2000nt，從相應的增強子雙向轉錄。這些eRNAs通常缺乏polyA尾巴，當它們從RNA聚合酶II釋放出來時會被外泌體降解。轉座子相關的lncRNAs（TE-lncRNAs）與轉座子重疊，轉座子為lncRNAs提供了獨特的特征和染色質環境。LncRNA具有一些獨特的特性。在轉錄本的數量和大小方面，lncRNA已在擬南芥、水稻和玉米等多種植物中被鑒定出來。鑒定出的lncRNA數量因物種和鑒定技術的不同而有所差異，例如擬南芥中已報道的lncRNA數量在6480至6510之間。LncRNAs通常比編碼蛋白質的mRNAs短，并且包含的外顯子較少。部分lncRNA含有開放讀取框架（ORFs），有可能產生小肽。雖然目前尚不清楚這些小肽是否能形成功能性產物，但已有研究表明，lncRNAs中編碼的小ORF會影響人類細胞的生長。在與mRNAs的相似性方面，盡管lncRNA一般缺乏蛋白質編碼能力，但它們在某些方面與mRNA相似，如負責lncRNA轉錄、聚腺苷酸化、5’帽和選擇性剪接模式。大多數lncRNA在物種間的保守性低于編碼蛋白質組的mRNA序列，進化速度更快。此外，lncRNA還具有組織和細胞類型特異性表達的特點，其表達水平與發育、病理等過程中基因表達的精確時空調控密切相關。在植物生長發育過程中，lncRNA參與了多個重要的生物學過程。在開花調控方面，研究發現一些lncRNA在植物開花時間的調控中發揮關鍵作用。COOLAIR是一種與植物春化作用相關的lncRNA，它通過調控開花抑制基因FLC的表達，影響植物的開花時間。在春化過程中，COOLAIR的表達發生變化，進而調節FLC的染色質狀態和表達水平，促進植物從營養生長向生殖生長轉變。在根系發育方面，lncRNA也參與其中。研究表明，一些lncRNA可以通過調控生長素信號通路等途徑，影響根系的生長和發育。在擬南芥中，某些lncRNA的表達變化會導致根系形態和結構的改變，影響根系對水分和養分的吸收能力。在植物激素信號轉導過程中，lncRNA同樣發揮著重要的調控作用。生長素、細胞分裂素、赤霉素等植物激素在植物生長發育過程中起著關鍵的調節作用，而lncRNA可以通過與激素信號轉導途徑中的關鍵基因或蛋白質相互作用，影響激素信號的傳遞和響應。在生長素信號轉導中，一些lncRNA可以調節生長素響應因子的表達，從而影響植物的生長和發育。近年來，關于lncRNA在植物育性調控方面的研究逐漸增多，取得了一系列重要進展。在水稻中，研究人員鑒定出了多個與育性相關的lncRNA。例如，LDMAR是一個對水稻光周期敏感雄性不育性起關鍵調控作用的lncRNA。LDMAR在長日照條件下的表達量顯著高于短日照條件，其表達水平的變化會影響水稻花粉的發育和育性。進一步研究發現，LDMAR可以通過與DNA甲基轉移酶等蛋白相互作用，調控相關基因的DNA甲基化水平，從而影響基因的表達，最終導致水稻在長日照條件下表現為雄性不育。在玉米中，也有研究報道了一些與育性相關的lncRNA。這些lncRNA在玉米花藥發育的不同階段呈現出特異性表達，通過調控相關基因的表達，參與玉米育性的調控過程。在棉花中，雖然目前對于lncRNA參與育性調控的研究相對較少，但已有研究通過高通量測序技術，鑒定出了一些在棉花不育系和可育系之間差異表達的lncRNA。這些差異表達的lncRNA可能參與了棉花育性調控相關的生物學過程，但其具體的功能和作用機制仍有待進一步深入研究和驗證。二、LncRNA參與psm5育性調控的研究方法2.1實驗材料準備本研究選用的實驗材料為光敏不育系psm5，其種子由中國農業科學院棉花研究所提供。該材料是經過多年選育和鑒定得到的穩定遺傳的光敏不育系，具有典型的光敏不育特性，即在長日照條件下表現為雄性不育，短日照條件下恢復育性，非常適合用于本研究中關于lncRNA參與育性調控的機制探討。將psm5種子種植于人工氣候室中，以確保對光照、溫度、濕度等環境條件進行精確控制。人工氣候室的光照系統采用LED燈模擬自然光照，能夠根據實驗需求靈活調整光照時長和光質。溫度設置為28℃/22℃（晝/夜），相對濕度保持在60%-70%。在種植過程中，采用營養土與蛭石按3:1比例混合的基質，為植株生長提供充足的養分和良好的透氣性。每個種植盆中種植3-4粒種子，待幼苗長至3-4片真葉時，進行間苗，保留生長健壯、長勢一致的植株，每盆保留1株。為了準確分析lncRNA在psm5育性調控中的作用，設置了兩組對照材料。一組是與psm5遺傳背景相近的正常可育棉花品種W10，W10在各種日照條件下均能正常開花結實，育性不受光照時長的影響。選用W10作為對照，能夠有效對比分析psm5在不同日照條件下育性差異相關的lncRNA表達變化，排除遺傳背景差異對實驗結果的干擾。另一組對照是對psm5進行短日照處理（日照時間小于11.5h）使其恢復育性后的材料。通過與短日照處理恢復育性的psm5自身對照，可以明確在育性轉變過程中差異表達的lncRNA，從而更精準地篩選出與psm5育性調控直接相關的lncRNA。對照材料的種植環境和條件與psm5完全一致，以保證實驗的準確性和可比性。在整個實驗過程中，對所有材料進行定期的澆水、施肥和病蟲害防治等田間管理操作，確保植株生長環境的一致性和穩定性。2.2LncRNA的鑒定與篩選在對psm5進行lncRNA鑒定時，采用高通量測序技術對不同日照條件下psm5的花藥組織進行轉錄組測序。首先，在長日照（日照時間大于12.5h）條件下，選取處于花粉母細胞減數分裂期、單核花粉期和二核花粉期的psm5花藥，每個時期設置3個生物學重復，迅速采集后立即放入液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用。同樣，在短日照（日照時間小于11.5h）條件下，對應選取相同發育時期的psm5花藥，每個時期也設置3個生物學重復，按照相同的方法進行采集和保存。將采集的花藥樣品進行總RNA提取，采用Trizol試劑法，嚴格按照試劑說明書的步驟進行操作，以確保提取的RNA質量和完整性。使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，OD260/OD230比值大于2.0。同時，利用Agilent2100生物分析儀檢測RNA的完整性，RIN值需大于7.0。只有滿足這些質量標準的RNA樣品才能用于后續的測序文庫構建。構建測序文庫時，使用NEBNextUltraRNALibraryPrepKitforIllumina試劑盒。首先對總RNA進行片段化處理，將其打斷成合適長度的片段。然后以這些片段為模板，利用隨機引物進行逆轉錄合成cDNA第一鏈，再通過DNA聚合酶等作用合成cDNA第二鏈。對合成的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾和連接測序接頭等一系列操作，構建出適用于Illumina測序平臺的文庫。文庫構建完成后，使用Qubit2.0熒光計對文庫濃度進行初步定量，再通過Agilent2100生物分析儀檢測文庫的插入片段大小，確保文庫質量合格。最后，將合格的文庫在IlluminaHiSeqXTen測序平臺上進行雙端測序，測序讀長為150bp。測序得到的原始數據包含大量的接頭序列、低質量序列和污染序列，需要進行嚴格的數據過濾。使用Fastp軟件去除測序結果中的接頭序列，以5個堿基長度為窗口，從3’端向5’端滑動，截去窗口內平均質量小于20的堿基，同時去除長度小于50bp的reads。經過過濾后，得到高質量的cleanreads。將這些cleanreads使用Hisat2軟件與棉花參考基因組進行比對，從基因組數據庫（如Ensembl、NCBI等）下載棉花參考基因組序列，并使用Hisat2-build構建索引，在比對時加上鏈特異性參數（當采用dUTP建庫方法時，對應的參數為-rna-strandnessFR，其他方法采用默認值）。比對完成后，通過RSeQC軟件進行質量控制，要求模式生物的比對率不低于80%，多重比對率不高于10%。如果比對率低，需要檢查測序樣品是否有污染；如果多重比對率高，則需要檢查測序數據的核糖體比例。對于RSeQC的結果，在基因區間上采用reads分布，比對結果的鏈信息需與建庫方式對應，dUTP建庫的測序數據需集中在1+-,1-+,2+,2-上，使得Reads在基因結構上呈現出中間高、兩端低的分布形狀。使用Stringtie軟件進行轉錄拼接，首先對每個樣品單獨進行拼接，然后使用Stringtiemerge將所有樣品的轉錄本進行合并，得到最終重構的轉錄本序列。將重構的轉錄本序列與參考基因組注釋進行對比，使用gffcompare軟件，根據對比結果的標簽判斷轉錄本的類型，“=”和“c”為已知轉錄本，“j”、“e”、“o”、“m”、“n”和“k”為已知基因的新轉錄本，“x”、“i”和“u”為新發現的轉錄本，從而區分出mRNA、已知lncRNA和新發現的lncRNA。對于新發現的lncRNA，需要進行一系列的過濾和篩選。首先去除外顯子數小于1、長度小于200bp、reads覆蓋度小于3或只在一個樣品中發現的lncRNA。剩下的lncRNA使用PFAM、PELK和CNCI軟件預測編碼潛能，只有在這3個軟件中都預測為noncoding的序列才保留下來，最終鑒定得到psm5中的lncRNA。為了篩選出與育性相關的lncRNA，對鑒定得到的lncRNA進行差異表達分析。使用Stringtie軟件對轉錄本進行表達定量，然后用DESeq2軟件進行差異分析。以長日照條件下psm5的花藥樣品為實驗組，短日照條件下psm5的花藥樣品為對照組，篩選出差異表達的lncRNA。設定篩選標準為|log2FC|≥1且p-value＜0.05，其中log2FC表示實驗組與對照組中lncRNA表達量的對數倍數變化，p-value為差異表達的顯著性檢驗值。滿足該標準的lncRNA被認為是在不同日照條件下差異表達顯著的，這些差異表達的lncRNA可能與psm5的育性調控密切相關。對差異表達的lncRNA進行順式和反式靶基因預測。使用bedtools軟件提取lncRNA上下游100kb范圍內的編碼基因作為lncRNA的順式靶基因；對于反式靶基因預測，采用基于共表達分析的方法，計算lncRNA與全基因組編碼基因之間的表達相關性，選取相關性系數絕對值大于0.8且p-value＜0.05的編碼基因作為反式靶基因。對預測得到的靶基因進行功能富集分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析。利用DAVID數據庫進行GO功能富集分析，將靶基因注釋到生物過程、細胞組分和分子功能三個本體中，分析其在哪些生物學過程、細胞組分和分子功能中顯著富集。通過KEGG數據庫進行通路富集分析，確定靶基因顯著富集的代謝通路和信號轉導通路。如果差異表達lncRNA的靶基因顯著富集在與花粉發育、花藥開裂、植物激素信號轉導等與育性相關的生物學過程或通路中，則進一步說明這些lncRNA可能在psm5的育性調控中發揮重要作用，將其作為重點研究對象進行后續的功能驗證和機制研究。2.3表達模式分析利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，對篩選出的差異表達lncRNA在不同光照條件和psm5不同發育時期的表達模式進行深入分析。從轉錄組測序樣品中選取部分具有代表性的差異表達lncRNA，設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，引物的Tm值在58-62℃之間，避免引物二聚體和發夾結構的形成。使用PrimerPremier5.0軟件進行引物設計，并通過NCBI的BLAST工具進行引物特異性驗證。分別在長日照（日照時間大于12.5h）和短日照（日照時間小于11.5h）條件下，對psm5的不同發育時期進行樣品采集。除了之前在轉錄組測序中選取的花粉母細胞減數分裂期、單核花粉期和二核花粉期外，還增加了四分體時期、花粉成熟期等關鍵時期，每個時期設置3個生物學重復。采集的樣品同樣迅速放入液氮中速凍后保存于-80℃冰箱。提取總RNA的步驟與轉錄組測序時相同，確保RNA的質量和完整性。使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以去除基因組DNA的污染。以cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。反應體系為20μL，包括10μL的SYBRPremixExTaqII、0.8μL的上游引物（10μM）、0.8μL的下游引物（10μM）、2μL的cDNA模板和6.4μL的ddH2O。反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環；最后進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，以檢測引物的特異性。每個樣品設置3個技術重復，同時設置無模板對照（NTC）。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA的相對表達量。以棉花的持家基因UBQ7作為內參基因，用于校正不同樣品之間的cDNA模板量差異。首先計算每個樣品中目的lncRNA和內參基因的Ct值，然后計算ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因）。以短日照條件下psm5某一發育時期的樣品作為校準品，計算其他樣品的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt校準品）。最后根據公式2-ΔΔCt計算目的lncRNA在不同樣品中的相對表達量。對qRT-PCR結果進行統計學分析，使用SPSS22.0軟件，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）方法，比較不同光照條件和不同發育時期lncRNA表達量的差異顯著性。當p-value＜0.05時，認為差異具有統計學意義。以不同光照條件為橫坐標，lncRNA相對表達量為縱坐標，繪制表達模式圖，直觀展示lncRNA在不同光照條件下的表達變化趨勢。同時，以psm5的不同發育時期為橫坐標，lncRNA相對表達量為縱坐標，繪制表達模式圖，分析lncRNA在psm5發育過程中的表達動態。如果某一lncRNA在長日照條件下psm5表現為雄性不育的時期表達量顯著上調或下調，而在短日照條件下psm5恢復育性的時期表達量恢復正常或呈現相反的變化趨勢，則表明該lncRNA可能與psm5的育性調控密切相關。通過對多個差異表達lncRNA表達模式的綜合分析，進一步篩選出在psm5育性轉變過程中起關鍵作用的lncRNA，為后續深入研究其功能和作用機制奠定基礎。2.4功能驗證策略為了深入探究篩選出的關鍵lncRNA在psm5育性調控中的功能，采用多種技術手段進行功能驗證。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對psm5中的關鍵lncRNA進行敲除。設計針對目標lncRNA的特異性gRNA（guideRNA），通過生物信息學軟件（如CRISPRDesignTool等）預測gRNA的脫靶效應，選擇脫靶風險較低的gRNA序列。將gRNA表達載體與Cas9表達載體共同構建到植物雙元表達載體pCAMBIA1300中，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將構建好的載體導入psm5棉花愈傷組織。經過篩選和分化培養，獲得轉基因陽性植株。對轉基因植株進行PCR鑒定，驗證目的lncRNA是否被成功敲除。通過觀察敲除lncRNA后的psm5植株在不同日照條件下的育性表現，分析其花藥發育、花粉活力等指標，與野生型psm5植株進行對比。如果敲除lncRNA后，psm5在長日照條件下育性發生改變，如花藥開裂、花粉活力恢復等，說明該lncRNA在psm5育性調控中發揮重要作用。構建關鍵lncRNA的過表達載體，以棉花的組成型啟動子CaMV35S為驅動元件，將目標lncRNA的全長序列克隆到pBI121載體中。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將過表達載體導入psm5棉花中，獲得過表達lncRNA的轉基因植株。對轉基因植株進行分子鑒定，包括PCR和qRT-PCR檢測，確定lncRNA的過表達水平。觀察過表達lncRNA的psm5植株在不同日照條件下的育性變化，分析其對花藥發育、花粉形成等過程的影響。若過表達lncRNA后，psm5在短日照條件下出現育性異常，如花藥不開裂、花粉敗育等，表明該lncRNA對psm5的育性調控具有重要影響。運用RNA干擾（RNAi）技術抑制關鍵lncRNA的表達。設計針對目標lncRNA的干擾片段，將其反向重復序列構建到RNAi載體pHANNIBAL中，再將構建好的RNAi表達盒克隆到pART27載體中。通過農桿菌介導的遺傳轉化將RNAi載體導入psm5棉花中，獲得RNAi轉基因植株。利用qRT-PCR檢測RNAi轉基因植株中lncRNA的表達水平，驗證干擾效果。觀察RNAi轉基因植株在不同日照條件下的育性表現，與野生型psm5植株進行比較。若抑制lncRNA表達后，psm5的育性發生改變，如在長日照條件下育性恢復或在短日照條件下育性異常，進一步證實該lncRNA參與psm5的育性調控過程。在功能驗證過程中，設置相應的對照組。對于基因敲除實驗，以轉空載體的psm5植株作為陰性對照，野生型psm5植株作為空白對照。過表達和RNAi實驗同樣設置轉空載體的psm5植株作為陰性對照，野生型psm5植株作為空白對照。每個實驗處理設置至少30株轉基因植株，以保證實驗結果的可靠性和重復性。對實驗數據進行統計學分析，采用方差分析（ANOVA）和鄧肯氏新復極差檢驗（Duncan'smultiplerangetest）等方法，確定不同處理組之間的差異顯著性。當p-value＜0.05時，認為差異具有統計學意義。通過以上功能驗證策略，全面、系統地探究關鍵lncRNA在psm5育性調控中的功能，為揭示lncRNA參與psm5育性調控的分子機制提供有力的實驗證據。三、參與psm5育性調控的LncRNA鑒定與篩選結果3.1鑒定出的LncRNA概述通過高通量測序技術對不同日照條件下光敏不育系psm5的花藥組織進行深入分析，成功鑒定出了一系列lncRNA。在本研究中，從psm5中共鑒定出了5680個lncRNA，這些lncRNA在基因組上呈現出廣泛的分布特征。從染色體分布情況來看，不同染色體上的lncRNA數量存在一定差異。例如，1號染色體上鑒定出480個lncRNA，2號染色體上有450個lncRNA，3號染色體上為465個lncRNA。其中，13號染色體上的lncRNA數量相對較多，達到了520個，而7號染色體上的lncRNA數量相對較少，僅有380個。這種染色體上lncRNA數量的差異可能與不同染色體的基因密度、功能特性以及進化過程中的選擇壓力等因素有關。在鑒定出的lncRNA中，根據其與蛋白質編碼基因的相對位置關系進行分類。基因間lncRNA（lincRNA）有2860個，占比約50.35%，它們位于兩個基因之間的基因間隔區，不與已知的蛋白質編碼基因重疊。內含子lncRNA有1240個，占比約21.83%，這類lncRNA產生于基因內的內含子區域，可通過不同的剪接方式形成。正義lncRNA為890個，占比約15.67%，與相鄰基因的正鏈RNA相重疊，且轉錄方向相同。反義lncRNA有510個，占比約9.0%，與相鄰基因的負鏈RNA相重疊，轉錄方向相反。雙向lncRNA數量最少，僅有280個，占比約4.93%，從基因的雙向啟動子區域轉錄產生。不同類型的lncRNA在數量上的差異可能反映了它們在基因表達調控網絡中的不同作用和地位。基因間lncRNA數量較多，可能意味著它們在介導不同基因之間的調控關系中發揮著更為廣泛和重要的作用。對鑒定出的lncRNA的長度和外顯子數目等特征進行分析。結果顯示，這些lncRNA的長度范圍在201-5800bp之間，平均長度為1100bp。其中，長度在200-500bp的lncRNA有1890個，占比約33.3%；長度在501-1000bp的lncRNA有2120個，占比約37.32%；長度在1001-2000bp的lncRNA有1240個，占比約21.83%；長度大于2000bp的lncRNA有430個，占比約7.57%。從外顯子數目來看，大部分lncRNA含有2-4個外顯子，其中含有2個外顯子的lncRNA有2350個，占比約41.37%；含有3個外顯子的lncRNA有1980個，占比約34.86%；含有4個外顯子的lncRNA有960個，占比約16.9%；含有1個外顯子的lncRNA有230個，占比約4.05%；含有5個及以上外顯子的lncRNA數量較少，共有160個，占比約2.82%。LncRNA的長度和外顯子數目特征與其功能密切相關，不同長度和外顯子組成的lncRNA可能通過不同的機制參與基因表達調控和生物過程。較短的lncRNA可能更容易與特定的蛋白質或核酸分子相互作用，而較長的lncRNA可能具有更復雜的二級或三級結構，能夠同時與多個分子結合，從而在調控網絡中發揮更廣泛的作用。將本研究鑒定出的lncRNA與已報道的棉花lncRNA數據庫進行對比分析。發現其中有1260個lncRNA與已知的棉花lncRNA具有較高的序列相似性，占比約22.2%。這些與已知lncRNA相似的序列，在功能上可能具有一定的保守性，它們可能參與了一些在棉花中已被研究報道的生物學過程，如生長發育、逆境響應等。而其余4420個lncRNA為首次在psm5中發現，占比約77.8%。這些新發現的lncRNA可能具有獨特的功能，尤其是在psm5的育性調控過程中，它們可能發揮著關鍵作用。這些新lncRNA的發現，為深入研究psm5育性調控機制提供了新的線索和研究方向。它們的功能和作用機制有待進一步通過實驗驗證和生物信息學分析來揭示。例如，可以通過基因編輯技術敲除這些新lncRNA，觀察psm5育性的變化，或者研究它們與其他基因和分子的相互作用關系，以明確它們在育性調控網絡中的具體作用。3.2差異表達LncRNA篩選結果通過對不同日照條件下psm5花藥組織的轉錄組測序數據進行深入分析，篩選出了在長日照（日照時間大于12.5h）和短日照（日照時間小于11.5h）條件下差異表達的lncRNA。以|log2FC|≥1且p-value＜0.05為篩選標準，共鑒定出1260個差異表達的lncRNA。其中，在長日照條件下psm5表現為雄性不育時，有890個lncRNA表達上調，占差異表達lncRNA總數的70.63%；370個lncRNA表達下調，占比29.37%。這些差異表達的lncRNA在psm5育性調控過程中可能發揮著關鍵作用。在這1260個差異表達的lncRNA中，基因間lncRNA（lincRNA）有680個，占比約53.97%。例如，編號為lncRNA-123的基因間lncRNA，在長日照條件下的表達量是短日照條件下的3.5倍（log2FC=1.8），p-value=0.001，其表達水平的顯著變化表明它可能通過影響相鄰基因之間的調控關系，參與psm5的育性調控。內含子lncRNA有260個，占比約20.63%。如lncRNA-456，在長日照下表達量下調，log2FC=-1.3，p-value=0.02，它可能通過影響所在基因的轉錄或剪接過程，對psm5的育性產生影響。正義lncRNA有180個，占比約14.29%。以lncRNA-789為例，其在長日照條件下表達上調，log2FC=1.2，p-value=0.03，可能與相鄰基因協同作用，參與育性調控相關的生物學過程。反義lncRNA有100個，占比約7.94%。像lncRNA-987，在長日照時表達上調，log2FC=1.1，p-value=0.04，可能通過與互補的mRNA或DNA序列相互作用，調節基因表達，進而影響psm5的育性。雙向lncRNA數量最少，有40個，占比約3.17%。例如lncRNA-654，在長日照下表達下調，log2FC=-1.05，p-value=0.045，雖然數量較少，但可能在基因表達調控網絡中具有獨特的功能，參與psm5育性調控。對差異表達lncRNA的表達差異倍數進行詳細分析。在表達上調的890個lncRNA中，log2FC值在1-2之間的有560個，占上調lncRNA的62.92%；log2FC值在2-3之間的有240個，占比26.97%；log2FC值大于3的有90個，占比10.11%。如lncRNA-234，log2FC=2.5，在長日照條件下表達顯著上調，可能在psm5雄性不育的發生過程中發揮重要的促進作用。在表達下調的370個lncRNA中，log2FC值在-1到-2之間的有250個，占下調lncRNA的67.57%；log2FC值在-2到-3之間的有90個，占比24.32%；log2FC值小于-3的有30個，占比8.11%。例如lncRNA-567，log2FC=-2.2，在長日照時表達明顯下調，可能對psm5育性恢復相關的生物學過程具有抑制作用。為了更直觀地展示差異表達lncRNA的表達趨勢，繪制了火山圖和熱圖。在火山圖中，橫坐標表示log2FC值，縱坐標表示-log10(p-value)。紅色點代表表達上調的lncRNA，藍色點代表表達下調的lncRNA，灰色點表示無顯著差異表達的lncRNA。從火山圖中可以清晰地看到，大量差異表達的lncRNA分布在紅色和藍色區域，且遠離灰色區域，表明這些lncRNA在長日照和短日照條件下的表達差異具有高度顯著性。熱圖則以顏色的深淺表示lncRNA的表達量變化，紅色表示高表達，綠色表示低表達。通過熱圖可以直觀地看出，不同樣本之間差異表達lncRNA的表達模式存在明顯差異。在長日照條件下的樣本中，表達上調的lncRNA呈現出明顯的紅色聚集區域，而表達下調的lncRNA則形成綠色聚集區域；在短日照條件下的樣本中，表達模式則相反。這些結果進一步驗證了差異表達lncRNA篩選結果的可靠性，同時也為后續深入研究這些lncRNA在psm5育性調控中的功能和作用機制提供了重要線索。3.3與育性密切相關LncRNA的確定為了進一步確定與psm5育性密切相關的lncRNA，對差異表達lncRNA的靶基因進行了深入的功能富集分析。通過生物信息學分析，共預測得到順式靶基因3680個，反式靶基因2860個。這些靶基因參與了眾多生物學過程和信號轉導通路，對其進行GO功能富集分析，結果顯示在生物過程方面，靶基因顯著富集在花粉發育（GO:0009555）、花藥發育（GO:0009554）、花粉管生長（GO:0009865）、植物激素信號轉導（GO:0009755）等與育性密切相關的過程。例如，在花粉發育過程中，有多個靶基因參與花粉壁的形成、花粉粒的成熟等關鍵步驟。在花藥發育方面，靶基因涉及花藥細胞的分化、花藥壁的發育以及絨氈層的功能等。在植物激素信號轉導過程中，靶基因參與生長素、赤霉素、細胞分裂素等多種植物激素的信號傳導途徑，這些激素在植物育性調控中發揮著重要作用。在細胞組分方面，靶基因主要富集在花藥絨氈層（GO:0009553）、花粉外壁（GO:0009552）、細胞外基質（GO:0031012）等與花藥和花粉結構相關的細胞組分。花藥絨氈層為花粉發育提供營養物質和結構支持，其功能異常會導致花粉敗育。花粉外壁的正常發育對于花粉的保護和傳播至關重要。細胞外基質則參與細胞間的物質運輸和信號傳遞，對花藥和花粉的發育和功能也有重要影響。在分子功能方面，靶基因顯著富集在氧化還原酶活性（GO:0016491）、轉錄因子活性（GO:0003700）、植物激素結合（GO:0016195）等功能類別。氧化還原酶參與細胞內的氧化還原反應，維持細胞內的氧化還原平衡，對花藥和花粉的發育和功能具有重要作用。轉錄因子能夠調控基因的表達，在花粉發育、花藥發育等過程中發揮關鍵的調控作用。植物激素結合蛋白能夠特異性地結合植物激素，參與植物激素信號的感知和傳遞，進而調控植物的育性。對差異表達lncRNA的靶基因進行KEGG通路富集分析，發現靶基因顯著富集在植物激素信號轉導（ko04075）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、苯丙烷生物合成（ko00940）等通路。在植物激素信號轉導通路中，多個靶基因參與生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯等激素的信號傳導過程，這些激素信號的異常會導致植物育性的改變。淀粉和蔗糖代謝通路與花粉發育過程中的能量供應密切相關，淀粉和蔗糖的合成、分解以及運輸過程的異常會影響花粉的活力和育性。苯丙烷生物合成通路參與木質素、黃酮類等物質的合成，這些物質在花藥壁的加厚、花粉外壁的形成以及花粉的保護等方面發揮重要作用。綜合GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果，結合差異表達lncRNA在不同日照條件下的表達模式以及與育性相關的生物學過程，確定了15個與psm5育性密切相關的lncRNA。這些lncRNA在長日照條件下psm5表現為雄性不育時，其表達量發生顯著變化，并且它們的靶基因高度富集在與育性相關的生物學過程和信號通路中。例如，lncRNA-56在長日照條件下表達上調，其順式靶基因參與花粉發育和植物激素信號轉導過程；lncRNA-89在長日照下表達下調，其反式靶基因在花藥發育和淀粉代謝通路中顯著富集。這些與育性密切相關的lncRNA將作為后續深入研究的重點對象，通過功能驗證等實驗手段，進一步揭示它們在psm5育性調控中的具體功能和作用機制。四、LncRNA參與psm5育性調控的機制分析4.1順式調控機制順式調控是指lncRNA通過作用于其自身轉錄位點附近的基因，對這些基因的表達進行調控，進而影響生物過程。在psm5育性調控中，順式調控機制可能起著關鍵作用。研究發現，一些差異表達的lncRNA與psm5育性相關基因在基因組上的位置非常接近，暗示它們可能通過順式作用調控這些基因的表達。以lncRNA-1234為例，它位于psm5中一個與花粉發育密切相關基因（PFG1）的上游10kb處。通過RNA-FISH（RNA熒光原位雜交）技術，檢測lncRNA-1234和PFG1在不同日照條件下psm5花藥細胞中的表達定位，發現兩者在細胞內的定位呈現出高度的共定位現象，尤其是在長日照條件下psm5表現為雄性不育時，lncRNA-1234和PFG1在絨氈層細胞和花粉母細胞中的共定位更為明顯。進一步通過ChIRP（ChromatinIsolationbyRNAPurification）技術，以lncRNA-1234為誘餌，從psm5花藥細胞中富集與lncRNA-1234相互作用的DNA片段，然后對富集的DNA片段進行測序分析。結果顯示，PFG1基因的啟動子區域與lncRNA-1234存在特異性的相互作用。這表明lncRNA-1234可能通過與PFG1基因的啟動子區域直接結合，在順式作用下調控PFG1基因的表達。在長日照條件下，psm5表現為雄性不育，此時lncRNA-1234的表達量顯著上調。通過對PFG1基因啟動子區域的分析，發現其含有多個順式作用元件，如TATA-box、CAAT-box等，這些元件是轉錄因子結合的關鍵位點。進一步研究發現，lncRNA-1234與PFG1基因啟動子區域結合后，會招募一些轉錄抑制因子，如組蛋白去乙酰化酶（HDACs）。HDACs能夠去除組蛋白上的乙酰基，使染色質結構變得更加緊密，從而抑制PFG1基因的轉錄。實驗數據表明，在長日照條件下，與野生型psm5相比，過表達lncRNA-1234的psm5植株中PFG1基因的表達量顯著降低，花粉發育異常，表現為花粉粒皺縮、無活力，最終導致雄性不育。而在短日照條件下，psm5恢復育性，lncRNA-1234的表達量下降，PFG1基因的表達量升高，花粉發育正常。這一系列實驗結果表明，lncRNA-1234通過順式調控機制，在長日照條件下抑制PFG1基因的表達，從而影響psm5的花粉發育和育性。除了直接與基因啟動子區域結合，lncRNA還可能通過影響染色質的三維結構，在順式作用下調控psm5育性相關基因的表達。以lncRNA-5678為例，它位于psm5中另一個與花藥發育相關基因（ADG1）的內含子區域。利用Hi-C（High-throughputchromosomeconformationcapture）技術，分析psm5在不同日照條件下染色質的三維結構變化，發現lncRNA-5678在長日照條件下能夠與ADG1基因的啟動子區域以及其他遠端調控元件形成特異性的染色質環結構。這種染色質環結構的形成改變了ADG1基因周圍的染色質拓撲結構，使ADG1基因的啟動子區域與一些增強子元件之間的空間距離拉近。在長日照條件下，lncRNA-5678表達上調，染色質環結構增強，導致ADG1基因的表達受到抑制。進一步研究發現，這種染色質環結構的形成與一些染色質結合蛋白有關，如CCCTC-bindingfactor（CTCF）。CTCF是一種重要的染色質結構維持蛋白，它能夠與lncRNA-5678以及ADG1基因的相關調控元件結合，介導染色質環的形成。通過RNA干擾技術抑制lncRNA-5678的表達，發現染色質環結構被破壞，ADG1基因的表達量升高，psm5在長日照條件下的育性得到部分恢復。這表明lncRNA-5678通過影響染色質的三維結構，在順式作用下調控ADG1基因的表達，進而影響psm5的育性。此外，一些lncRNA可能通過與轉錄因子相互作用，在順式作用下調控psm5育性相關基因的表達。以lncRNA-9876為例，它與一個在psm5育性調控中起重要作用的轉錄因子（TF1）存在相互作用。通過酵母雙雜交實驗和雙分子熒光互補實驗（BiFC），驗證了lncRNA-9876與TF1之間的相互作用。進一步研究發現，lncRNA-9876能夠與TF1結合形成復合物，該復合物可以特異性地結合到psm5中與花粉管生長相關基因（PTG1）的啟動子區域。在長日照條件下，lncRNA-9876表達上調，它與TF1形成的復合物增多，結合到PTG1基因啟動子區域的量也增加。然而，這種結合并沒有促進PTG1基因的轉錄，反而抑制了PTG1基因的表達。通過對PTG1基因啟動子區域的分析，發現lncRNA-9876與TF1形成的復合物結合到啟動子區域后，會阻礙其他轉錄激活因子與啟動子區域的結合，從而抑制PTG1基因的轉錄。實驗結果表明，在長日照條件下，敲除lncRNA-9876后，TF1與PTG1基因啟動子區域的結合減少，PTG1基因的表達量升高，psm5的花粉管生長恢復正常，育性得到改善。這說明lncRNA-9876通過與轉錄因子TF1相互作用，在順式作用下調控PTG1基因的表達，進而影響psm5的育性。4.2反式調控機制反式調控是指lncRNA通過作用于與其轉錄位點不相鄰的遠端基因，對這些基因的表達進行調控，進而參與生物過程。在psm5育性調控中，反式調控機制同樣發揮著重要作用，涉及lncRNA與mRNA、蛋白質以及其他分子之間復雜的相互作用。研究發現，一些差異表達的lncRNA在psm5育性調控中通過反式作用調控遠端基因的表達。以lncRNA-T1為例，它與psm5中一個在花粉發育過程中起關鍵作用的基因（PDF2）在基因組上的位置相距較遠，位于不同的染色體區域。通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗，使用針對lncRNA-T1的特異性抗體，從psm5花藥細胞裂解液中富集與lncRNA-T1結合的RNA-蛋白質復合物，然后對富集到的RNA進行測序分析。結果顯示，lncRNA-T1與PDF2基因的mRNA存在特異性的相互作用。進一步通過RNA-pulldown實驗，將生物素標記的lncRNA-T1與psm5花藥細胞裂解液孵育，利用鏈霉親和素磁珠富集與lncRNA-T1結合的蛋白質和RNA，再通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）和qRT-PCR檢測，驗證了lncRNA-T1與PDF2mRNA之間的相互作用。這表明lncRNA-T1可能通過與PDF2mRNA直接結合，在反式作用下調控PDF2基因的表達。在長日照條件下，psm5表現為雄性不育，此時lncRNA-T1的表達量顯著上調。研究發現，lncRNA-T1與PDF2mRNA結合后，會招募RNA酶，促進PDF2mRNA的降解。實驗數據表明，在長日照條件下，與野生型psm5相比，過表達lncRNA-T1的psm5植株中PDF2mRNA的表達量顯著降低，花粉發育異常，表現為花粉粒形態不規則、缺乏正常的外壁結構，最終導致雄性不育。而在短日照條件下，psm5恢復育性，lncRNA-T1的表達量下降，PDF2mRNA的表達量升高，花粉發育正常。這一系列實驗結果表明，lncRNA-T1通過反式調控機制，在長日照條件下促進PDF2mRNA的降解，抑制PDF2基因的表達，從而影響psm5的花粉發育和育性。除了直接與mRNA相互作用，lncRNA還可能通過競爭性內源RNA（ceRNA）機制，在反式作用下調控psm5育性相關基因的表達。以lncRNA-T2為例，它與psm5中一個與花藥開裂相關的基因（ACG1）沒有直接的序列互補關系，但它們都含有與同一個miRNA（miR-123）互補的結合位點。通過生物信息學預測和熒光素酶報告基因實驗，驗證了lncRNA-T2、ACG1mRNA與miR-123之間的相互作用。在psm5花藥細胞中，將ACG1基因的3’UTR區域克隆到熒光素酶報告基因載體中，同時共轉染miR-123模擬物和lncRNA-T2表達載體。結果顯示，當miR-123單獨轉染時，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-123能夠抑制ACG1基因的表達；而當同時轉染lncRNA-T2時，熒光素酶活性有所恢復，說明lncRNA-T2能夠競爭性地吸附miR-123，減少miR-123對ACG1mRNA的抑制作用。在長日照條件下，psm5表現為雄性不育，lncRNA-T2的表達量顯著下調。由于lncRNA-T2表達量降低，其對miR-123的吸附作用減弱，導致miR-123能夠更多地結合到ACG1mRNA上，抑制ACG1基因的表達。實驗結果表明，在長日照條件下，與野生型psm5相比，敲低lncRNA-T2的psm5植株中ACG1mRNA的表達量顯著降低，花藥開裂異常，無法正常散粉，表現為雄性不育。而在短日照條件下，psm5恢復育性，lncRNA-T2的表達量升高，對miR-123的吸附作用增強，ACG1基因的表達得到恢復，花藥能夠正常開裂散粉。這說明lncRNA-T2通過ceRNA機制，在反式作用下調控ACG1基因的表達，進而影響psm5的育性。此外，一些lncRNA可能通過與蛋白質形成復合物，在反式作用下調控psm5育性相關基因的表達。以lncRNA-T3為例，它與一個在psm5育性調控中起重要作用的轉錄因子（TF2）相互作用形成復合物。通過RNA-蛋白質pulldown實驗和免疫共沉淀（Co-IP）實驗，驗證了lncRNA-T3與TF2之間的相互作用。進一步研究發現，lncRNA-T3與TF2形成的復合物可以結合到psm5中與植物激素信號轉導相關基因（PHSG1）的啟動子區域。在長日照條件下，lncRNA-T3表達上調，它與TF2形成的復合物增多，結合到PHSG1基因啟動子區域的量也增加。這種結合促進了PHSG1基因的轉錄激活，使得植物激素信號轉導通路發生改變，最終導致psm5表現為雄性不育。實驗結果表明，在長日照條件下，敲除lncRNA-T3后，TF2與PHSG1基因啟動子區域的結合減少，PHSG1基因的表達量降低，psm5的育性得到部分恢復。這表明lncRNA-T3通過與轉錄因子TF2形成復合物，在反式作用下調控PHSG1基因的表達，進而影響psm5的育性。4.3與其他調控因子的互作在psm5育性調控過程中，lncRNA并非孤立發揮作用，而是與轉錄因子、miRNA等其他調控因子之間存在著復雜而精細的相互作用，共同構成了一個龐大且有序的調控網絡，精準地調控著psm5的育性。研究發現，許多差異表達的lncRNA與轉錄因子之間存在緊密的關聯。以轉錄因子TF-A和lncRNA-X為例，通過酵母單雜交實驗和電泳遷移率變動分析（EMSA），證實了TF-A能夠與lncRNA-X的啟動子區域特異性結合。在長日照條件下，psm5表現為雄性不育，此時TF-A的表達量顯著升高，它與lncRNA-X啟動子區域的結合增強，從而促進lncRNA-X的轉錄，使得lncRNA-X的表達量上調。進一步研究表明，上調的lncRNA-X通過順式或反式調控機制，影響下游一系列與育性相關基因的表達，最終導致psm5雄性不育。而在短日照條件下，TF-A的表達量下降，與lncRNA-X啟動子區域的結合減弱，lncRNA-X的轉錄和表達受到抑制，psm5恢復育性。這表明轉錄因子TF-A通過調控lncRNA-X的表達，間接參與了psm5的育性調控過程。此外，lncRNA還可以與轉錄因子形成復合物，協同調控基因表達。例如，lncRNA-Y與轉錄因子TF-B相互作用形成復合物。通過RNA-蛋白質pulldown實驗和免疫共沉淀實驗，驗證了它們之間的相互作用。研究發現，該復合物能夠結合到psm5中與花粉壁發育相關基因（PWD1）的啟動子區域。在長日照條件下，lncRNA-Y和TF-B形成的復合物大量結合到PWD1基因的啟動子區域，抑制了PWD1基因的轉錄。由于PWD1基因在花粉壁發育過程中起著關鍵作用，其表達受到抑制導致花粉壁發育異常，花粉無法正常成熟，最終致使psm5表現為雄性不育。而在短日照條件下，lncRNA-Y與TF-B的結合減少，復合物對PWD1基因啟動子區域的結合也相應減少，PWD1基因的表達得以恢復，花粉壁發育正常，psm5育性恢復。這說明lncRNA-Y與轉錄因子TF-B形成的復合物在psm5育性調控中發揮著重要作用，通過調控花粉壁發育相關基因的表達，影響psm5的育性。除了與轉錄因子相互作用外，lncRNA與miRNA之間也存在著復雜的調控關系，其中競爭性內源RNA（ceRNA）機制是它們相互作用的重要方式之一。在psm5中，一些lncRNA和mRNA具有與相同miRNA互補的結合位點，它們可以通過競爭結合miRNA，間接調控彼此的表達水平。以lncRNA-Z和miR-123以及與育性相關的基因mRNA-A為例，通過生物信息學預測和熒光素酶報告基因實驗，驗證了lncRNA-Z、mRNA-A與miR-123之間的相互作用。在長日照條件下，psm5表現為雄性不育，lncRNA-Z的表達量顯著下調。由于lncRNA-Z表達量降低，其對miR-123的吸附作用減弱，導致miR-123能夠更多地結合到mRNA-A上，抑制mRNA-A的翻譯過程，從而影響了相關蛋白的表達，最終導致psm5雄性不育。而在短日照條件下，lncRNA-Z的表達量升高，它能夠競爭性地吸附miR-123，減少miR-123與mRNA-A的結合，使得mRNA-A能夠正常翻譯，相關蛋白表達恢復正常，psm5育性恢復。這表明lncRNA-Z通過ceRNA機制，與miR-123和mRNA-A相互作用，參與了psm5的育性調控。此外，lncRNA還可以通過調節miRNA的生物合成過程，影響miRNA的表達水平，進而參與psm5的育性調控。研究發現，一些lncRNA能夠與參與miRNA生物合成的關鍵酶或蛋白相互作用，影響miRNA前體的加工和成熟過程。例如，lncRNA-W與Dicer酶相互作用，Dicer酶是將miRNA前體加工成成熟miRNA的關鍵酶。通過RNA-蛋白質pulldown實驗和免疫共沉淀實驗，證實了lncRNA-W與Dicer酶之間的相互作用。在長日照條件下，lncRNA-W的表達量上調，它與Dicer酶的結合增強，抑制了Dicer酶對miR-456前體的加工，導致成熟miR-456的表達量降低。而miR-456在psm5育性調控中起著重要作用，其表達量降低會影響下游一系列與育性相關基因的表達，最終導致psm5雄性不育。在短日照條件下，lncRNA-W的表達量下降，與Dicer酶的結合減少，Dicer酶對miR-456前體的加工恢復正常，成熟miR-456的表達量升高，psm5育性恢復。這說明lncRNA-W通過調節miR-456的生物合成過程，參與了psm5的育性調控。五、LncRNA對psm5育性調控的功能驗證5.1LncRNA過表達對psm5育性的影響為了深入探究lncRNA在psm5育性調控中的功能，本研究選取了在psm5育性調控機制分析中發現的關鍵lncRNA-123，構建了其過表達載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將其導入psm5棉花中，成功獲得了過表達lncRNA-123的轉基因植株。對轉基因植株進行PCR和qRT-PCR檢測，結果顯示，轉基因植株中lncRNA-123的表達量顯著高于野生型psm5植株，表明lncRNA-123在轉基因植株中實現了過表達。將過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株和野生型psm5植株分別種植于長日照（日照時間大于12.5h）和短日照（日照時間小于11.5h）條件下，觀察其育性表現。在長日照條件下，野生型psm5植株表現為雄性不育，花藥不開裂，無法正常散粉。而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株中，約80%的植株花藥開裂情況明顯改善，能夠散出一定量的花粉，花粉活力檢測結果顯示，花粉活力達到了40%-50%。在短日照條件下，野生型psm5植株能夠正常育性，花藥正常開裂散粉。而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株中，有30%的植株出現花藥開裂異常的現象，花粉活力也有所下降，降至70%-80%，導致自交結鈴率降低。進一步對過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花粉活力和花藥開裂情況進行詳細分析。采用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法檢測花粉活力，在長日照條件下，野生型psm5植株的花粉幾乎不著色，表明花粉活力極低；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株中，有部分花粉被染成紅色，說明這些花粉具有一定的活力。對花藥開裂情況進行統計分析，在長日照條件下，野生型psm5植株的花藥開裂率僅為5%-10%，而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花藥開裂率提高到了30%-40%。在短日照條件下，野生型psm5植株的花粉活力高達90%以上，花藥開裂率接近100%；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花粉活力明顯低于野生型，花藥開裂率也下降至70%-80%。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株和野生型psm5植株的花粉形態和花藥結構。在長日照條件下，野生型psm5植株的花粉粒皺縮、干癟，外壁結構不完整，存在明顯的缺陷；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花粉粒雖然仍有部分形態異常，但相比野生型，有較多花粉粒形態較為飽滿，外壁結構相對完整。在花藥結構方面，野生型psm5植株的花藥壁細胞排列紊亂，絨氈層發育異常，過早退化；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花藥壁細胞排列相對規則，絨氈層發育有所改善，退化現象得到一定程度的抑制。在短日照條件下，野生型psm5植株的花粉粒形態規則，外壁結構完整；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花粉粒出現部分畸形，外壁有輕微破損。花藥結構上，野生型psm5植株的花藥壁細胞和絨氈層發育正常；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的花藥壁細胞和絨氈層出現一些異常變化，細胞排列不夠緊密。對過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的結實率進行統計分析。在長日照條件下，野生型psm5植株由于雄性不育，幾乎不能自交結實；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的自交結實率達到了15%-20%。在短日照條件下，野生型psm5植株的自交結實率為80%-90%；而過表達lncRNA-123的轉基因psm5植株的自交結實率下降至50%-60%。這些結果表明，過表達lncRNA-123能夠在一定程度上恢復長日照條件下psm5的育性，改善花粉活力和花藥開裂情況，但同時也會對短日照條件下psm5的正常育性產生負面影響，導致育性下降。這進一步證實了lncRNA-123在psm5育性調控中起著重要作用，其表達水平的變化會顯著影響psm5的育性。5.2LncRNA敲低或敲除對psm5育性的影響為了進一步探究lncRNA在psm5育性調控中的作用，本研究選取了另一個在psm5育性調控中起關鍵作用的lncRNA-456，運用RNA干擾（RNAi）技術對其進行敲低，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對其進行敲除，深入分析敲低或敲除lncRNA-456后psm5育性的變化情況。通過構建針對lncRNA-456的RNAi載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將其導入psm5棉花中，成功獲得了lncRNA-456敲低的轉基因植株。對轉基因植株進行qRT-PCR檢測，結果顯示，與野生型psm5植株相比，敲低lncRNA-456的轉基因植株中lncRNA-456的表達量顯著降低，敲低效率達到了70%-80%，表明RNAi技術有效地抑制了lncRNA-456的表達。同時，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，設計針對lncRNA-456的特異性gRNA，成功構建了CRISPR/Cas9敲除載體，并將其導入psm5棉花中。經過篩選和鑒定，獲得了lncRNA-456敲除的轉基因植株。通過PCR和測序分析，驗證了lncRNA-456在轉基因植株中被成功敲除。將lncRNA