人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及促血管生成生物活性研究〔作者:___________單位:___________:___________〕

【摘要】目的：在大腸桿菌中克隆和表達人源胸腺肽〔thymosinβ4，TB4〕基因并進行別離純化及促血管生成生物活性鑒定。方法：人工設計TB4基因片段，其密碼子為大腸桿菌所偏愛，將合成的寡核苷酸片段經分子克隆拼接成TB4基因片段，與pET28a(+)載體連接成重組表達質粒pET28aTB4，將其轉化大腸桿菌BL21〔DE3〕，經IPTG誘導表達帶His6Tag的融合蛋白His6TB4，通過鎳柱親和層析純化，采用SDSPAGE分析鑒定，由CAM試驗進行重組蛋白活性的生物活性鑒定。結果：經DNA序列分析鑒定，重組質粒pET28aTB4構建成功，IPTG誘導后的融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中得到高效表達，并經一步鎳柱親和層析即獲得純化。CAM試驗證明其有促進毛細血管生成的活性。結論：獲得高效表達的、高純度的His6TB4融合蛋白，為TB4的進一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了根底。

【關鍵詞】人胸腺肽β4表達鎳柱純化雞胚尿囊膜實驗

胸腺肽β4〔thymosinβ4,TB4〕是從胸腺素組分5〔F5〕中別離得到的，是生物體內豐度最高且高度保守的一種βthymosin。它不僅存在于胸腺中，還存在機體眾多組織中，在參與調節免疫及細胞生理活動等一系列過程中呈現功能多樣性，因此引起了研究者的廣泛關注[12]。TB4是由43個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質量約5000，等電點5.1，以前多認為其定位于細胞漿中，目前有報道說它也有細胞核的定位[3]。最近報道說明，TB4可以促進毛細血管生成和創傷愈合，降低炎癥反響，抑制一些上皮細胞的凋亡，在醫學治療疾病中大有潛力[46]。本研究設計并合成TB4的編碼基因，在大腸桿菌中實現它的高效表達，進行別離純化，并進行其促毛細血管生成活性初步鑒定，旨在為今后對TB4蛋白功能的進一步研究和藥物開發打下根底。

1材料和方法

1.1試劑、質粒及菌株

pET28a(+)質粒、大腸桿菌Top10、BL21(DE3)由本實驗室保存；PCR試劑、限制性內切酶、Klenow酶、T4連接酶等酶類購自大連TaKaRa公司；IPTG購自華美生物工程公司；3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒購自上海申能博彩生物科技；MicroBCAKit購自PIERCEChemical公司；NiIDA填料由本實驗室提供。

1.2方法

1.2.1重組質粒的構建

1.2.1.1TB4目的基因片段的獲得TB4基因序列來源于NCBI數據庫，并根據大腸桿菌密碼子偏愛性，對其進行適當的修改。設計5個基因片段，由上海英駿〔Invitrogen〕公司合成。

1.2.1.2TB4基因的拼接將合成的基因片段1〔5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAG3′〕和基因片段2〔5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTTTTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′〕退火，利用Klenow酶延伸補平；相同的方法將基因片段3〔5′AACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′〕和基因片段4〔5′GGCGAGCTCTAGGATTCACCAGCCTG3′〕退火補平。兩次退火得到2個DNA大片段〔A和B〕，將DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。

1.2.1.3PCR擴增TB4基因以退火得到的TB4基因為模板，基因片段5〔5′GGAATTCCATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGACAAACCGGAC3′〕和基因片段4為引物，進行PCR擴增〔圖1〕。PCR循環參數為：95℃預變性5min；95℃變性40s，58℃復性40s，72℃延伸40s,循環28次；末次延伸為72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠純化試劑盒純化。

圖1TB4目的基因合成過程示意圖

1.2.1.4pET28aTB4重組質粒的構建與測序鑒定將純化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI雙酶切，用T4連接酶連接于已同樣酶切的pET28a(+)質粒中，再轉化大腸桿菌Top10，卡那霉素抗性板篩選陽性克隆，挑單菌落進行PCR鑒定為陽性的克隆送上海英駿〔Invitrogen〕公司測序鑒定。

1.2.2融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中的誘導表達和純化

將重組質粒pET28aTB4轉化BL21(DE3)大腸桿菌，挑單克隆于1L含卡那霉素的新鮮LB液體培養基中37℃搖菌培養，當其A600到達0.8時，參加終濃度為1mmol·L-1IPTG，誘導35h；離心收獲菌體，進行SDSPAGE分析。將表達菌體重懸于60mlBufferB〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.01mol·L-1imidazole,pH8.0〕，進行超聲破碎細菌，然后離心取上清，上樣由BufferB平衡過的NiIDA親和層析柱，再用BufferC〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.05mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗層析柱去除雜蛋白，最后通過BufferD〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.25mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。

1.2.3雞胚尿囊膜血管生成實驗〔choriollantoicmembraneassay，CAM實驗〕

我們用CAM模型檢測His6TB4對體內血管生成的作用[7８]。取材孵育7d的活受精雞胚，在蛋殼上開窗暴露尿囊膜，將滅菌圓形濾紙片〔約7mm2〕放置于尿囊膜毛細血管新生區，用微量加樣器將200μg·ml-1過濾除菌的融合蛋白溶液〔PBS配制〕和PBS緩沖液〔對照〕各50μl加于濾紙片上，用滅菌的濾紙和膠布封閉窗口，60h后揭開濾紙片觀察毛細血管生長的情況。

2結果

2.1TB4基因的克隆和重組

我們按照大腸桿菌偏愛的密碼子，人工合成了TB4基因片段，然后拼裝成TB4全基因。經電泳鑒定，成功拼裝獲得與預期長度大小一致的TB4基因片段,約135bp〔圖2〕。獲得的TB4基因片段經過NdeI和SacI雙酶切，將目的片段插入pET28a(+)質粒中，pET28aTB4質粒圖譜如圖3。重組質粒經PCR鑒定為陽性克隆，經DNA測序證明目的基因序列完全正確。設計的TB4基因全序列如下：5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAGAAGACTGAAACTCAGGAAAAAAACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′。

２．２融合蛋白His6TB4的誘導表達和別離純化

經SDSPAGE分析說明，重組蛋白在大腸桿菌中實現了高效表達，其中融合有His6Tag的TB4蛋白相對分子質量約為8000，與理論值相符。由于TB4蛋白N端融合有HisTag，融合蛋白可利用鎳柱親和層析一步純化獲得目的蛋白，純化過程簡單、高效。經SDSPAGE掃描分析，His6TB4重組蛋白的表達量約占菌體總蛋白的40%，一步親和層析純化后樣品的純度可到達93.5%左右，見圖4。

2.3CAM試驗檢測融合蛋白活性

與對照相比，TB4對毛細血管生成有促進作用，與文獻[9]報道吻合，如圖5所示。給藥部位較周邊的毛細血管生成有所促進，并且有所增粗，而對照組的濾紙片及其周邊的毛細血管生成根本沒有改變。

圖5重組TB4對雞胚尿囊膜的促血管生成作用

3討論

胸腺肽是一種應用較早的免疫藥物，由于近年來發現胸腺肽β家族成員的功能不僅限于與肌動蛋白結合，影響細胞的生長和遷移，而且在免疫、血管生成、神經再生、腫瘤浸潤、創傷愈合和炎癥反響等多方面均有作用，同時，也為一些疾病的診斷和治療提供了新的研究思路，從而越來越多地引起眾多研究者的注意[12，10]。采用基因工程方法生產重組TB4蛋白，可以防止從生物原材料中直接提取率低或直接化學合成本錢代價高等缺點。國內陳妍柯等[11]也曾報道過在大腸桿菌中克隆表達了TB4，其表達水平占菌體總蛋白的30%，但其純化步驟較為復雜，分別經過了硫酸銨鹽析、SourceRPC反相層析柱和QSepharoseHP陰離子交換柱來純化目的蛋白，他們主要側重于研究TB4的免疫學活性。本研究中，我們在大腸桿菌中高效表達了His6TB4，表達產物占菌體總蛋白的40%，表達產物經過一步鎳柱親和層析即可獲得別離純化，方法簡易、獲得的TB4重組蛋白純度為93.5%。CAM實驗說明，我們獲得的His6TB4具有很好的促血管生成的生物活性。我們建立了TB4大腸桿菌基因工程高效表達菌株，表達水平高，別離純化工藝簡便、本錢低，為以后的TB4作為促進血管生成藥物的開發和深入研究奠定了堅實的根底。

【參考文獻】

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