新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻達物學授課教師姓名及職稱：教授

一、授課題目實險一佃雷的笥單染色*革里氏累色

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、學習微生物涂片、染色的操作技術；

三、實驗教學目2、掌握細菌單染色和革蘭氏染色的方法；

標與課時分3、初步掌握無菌操作技術；

配4、掌握革蘭氏染色反應原理、操作步驟和意義。

3課時

1、微生物涂片、染色的基本技術；

四、授課重點

2、無菌操作技術

1、微生物涂片、染色的基本技術；

五、授課難點

2、無菌操作技術

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高等教育出

文獻版社。

1.你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環

節是什么？

九、思考題

2.當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操

作正確，結果可靠？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負責人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：獻士揚等任課教師：

教學手段和教學

基本內容

組織

細菌的簡單染色和革蘭氏染色

一、實驗目的強調實驗課的要求和

1、學習微生物涂片、染色的操作技術；

規則

2、掌握細菌單染色和革蘭氏染色的方法；

簡單復習理論知識過

3、初步掌握無菌操作技術；

渡到本實驗目的

4、掌握革蘭氏染色反應原理、操作步驟和意義。

二、實驗內容和原理

結合理論知識講解實

細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。細菌個

驗原理

體微小，且較透明，必須借助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明

的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。此法操作簡便，適用于菌體一

般形狀和細菌排列的觀察。

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三

大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細

菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時

常帶負電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍、結晶紫、感性復紅

或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷

的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶

正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。

中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青

等。

根據實驗目的不同，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染

色法等，本實驗主要做前面兩種。

(-)簡單染色法原理：

這是最基本的染色法,由于細菌在中性環境下一般帶負電荷，

所以通常采用一種堿性染料如美藍、堿性復紅、結晶紫進行染色。

簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不

能辨別細菌細胞的構造。

(二)革蘭氏染色法原理

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革

蘭氏染色法是細菌學上最常用的鑒別染色法，因為通過此法染色，

可將細菌鑒別為革蘭氏陽性菌(GD和革蘭氏陰性菌(G1兩大類。

革蘭氏染色過程所用四種不同溶液和作用：

1、堿性染料：這在簡單染色中已討論過，此處用結晶紫。

2、媒染劑：其作用是增強染料與細菌的親和力，更好地加強

染料與細胞的結合。常用的媒染劑是碘液。

3、脫色劑：幫助染料從被染色的細胞中脫色。利用細菌對染

料脫色的難易程度不同，而將細菌加以區分。革蘭氏陽性細菌不易

被脫色劑脫色，而革蘭氏陰性細菌則易被脫色。常用的脫色劑是丙

酮或乙醇，這里所用的是95%的乙醇。

4、復染液：也是一種堿性染料，目的是使脫色的細菌重新染

上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。這里用的是蕃紅花紅溶

液。

近年來由于對細菌細胞壁的結構有了較深入的了解，對革蘭氏

染色的機制提出不同的看法。一般認為革蘭氏陽性細菌的肽聚糖層

較厚，經乙醇處理后使之發生脫水作用而使孔徑縮小，結晶紫與碘

的復合物保留在細胞內而不被脫色；而革蘭氏陰性細菌的肽聚糖層

很薄，脂肪含量高，經乙醉處理后部份細胞壁可能被溶解并改變其

組織狀態，細胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結晶紫與碘

的復合物洗去而被脫色。雖然如此，革蘭氏染色的差異并不能完全

認為是化學的差別，也有物理結構不同的結果，因為酵母菌細胞壁

的成份完全和細菌不同，但具有革蘭氏染色陽性反應。

三、實驗器材

1、活材料：培養12-16h的枯草桿菌(Bacillussubtilis)，培養

24小時的大腸桿菌(Escherichiacoli)簡單介紹本次實驗所

2、染色液和試劑：草酸較結晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒用器材

精、著紅染液、復紅、乙醛酒精溶液、香柏油、無菌水

3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、

顯微鏡等。

四、實驗方法

1、簡單染色：

（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴

重點介紹制片方法，強

無菌水，按無菌操作法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，

調無菌操作

并涂成薄膜，涂布面積約1?1.5cn?,左邊涂枯草桿菌，右邊涂大

腸桿菌。注意取菌不要太多，圖片要均勻。

（2）干燥：讓涂片自然晾干。邊講解邊演示，并強調

（3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固實驗注意事項

定。在火上固定時，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片

在火上烤，否則細菌形態毀壞。（染色前必須固定細菌。其目的有

二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親

和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原

有的形態。）

（4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加草酸

錢結晶紫染液

（5）水洗：傾去染色液，斜置載片，用自來水的細水流由載

片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無

染色液的顏色為止。

（6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，

將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細

調焦觀察細菌的形態。

2、革蘭氏染色：

（1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。通過提出問題加強學

（晾干：與簡單染色法相同。

2）生對實驗原理的理解

（3）固定：與簡單染色法相同。

（4）結晶紫染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以

蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1分鐘。

（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。

（6）媒染：滴加盧哥天碘液，媒染lmin°

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20-25s至流

出液無色，立即水洗。

（9）復染：滴加蕃紅復染2min。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。

（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用波鏡觀察，

并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。

（13）實驗完畢后的處理：

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡

頭上的油擦去；b.用擦鏡紙沾少許乙酸酒精溶液將鏡頭擦2-3次；

c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦強調實驗后處理的重

拭。

要性

②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。

五、注意事項

1.載玻片要潔凈無油跡，否則菌液涂不開。涂片時，滴水不要

過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。

2.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽通過正反兩方面再次

性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也強調實驗注意事項

會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量

多少等因素的影響，難以嚴格規定。

3.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的

殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

4.選用幼齡的細菌。G，菌培養12h-16h,〃培養24h。若菌

齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。

六、實驗作業

（一）繪圖

繪出B37/〃ss2而如和〃革蘭氏染色視野圖。

（二）問題和思考

布置本次實驗報告和

1.你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最

思考題

關鍵的環節是什么？

2.當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染

色技術操作正確，結果可靠？

新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻士物學授課教師姓名及職稱：教授

一、授課題目宴徐二鈿雷的身也和美旗累邑

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、繼續學習微生物標本的制作方法；

三、實驗教學目2、掌握芽抱、莢膜染色的基石原理及方法；

標與課時分

3、鞏固無菌操作技術。

酉己

3課時

1、微生物標本的制作方法；

四、授課重點

2、芽胞、英膜染色的方法及注意事項

1、微生物標本的制作方法：

五、授課難點

2、芽胞、莢膜染色的方法及注意事項

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高

文獻等教育出版社。

1.若涂片中觀察到的只是大量游離芽也，很少看到芽泡囊及

營養細胞，你認為這是什么原因？

九、思考題

2.組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什

么？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負責人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：獻士物等授課教師姓名及職稱：教授

教學手段和

基本內容

教學組織

細菌的芽抱和莢膜染色法

一、實驗目的

先點評上次實

1、繼續學習微生物標本的制作方法；

驗作業

2、掌握芽泡、莢膜染色的基本原理及方法；

3、鞏固無菌操作技術。

二、實驗內容和原理

芽抱、莢膜染色法都是利用細菌各部位（分）的構造不同，它們對染料

結合理論知識

的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細菌細胞的不同構

講解實驗原理

造能在顯微鏡下顯示出來，便于觀察和區別。

（一）芽抱染色法：

芽胞乂稱內生抱子（endospore）,是某些細菌（革蘭氏染色陽性桿菌）

生長到一定時間（對數期后期），在細胞內形成一個圓彩、橢圓形或圓柱形

的結構。

芽也有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽m的大小，位置，在分

類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽胞細菌生活史的一個環節，它還是檢驗

培養基滅菌徹底不徹底的依據。

芽抱壁厚、透性低，著色和脫色均較困難，當用弱堿性染料（孔雀綠）

在加熱的情況下進行染色時，使染料不僅進入菌體也可進入芽胞內，進入菌

體的染料經水洗后被脫色，當用對比度大的復染色劑（落紅液）染色后，芽

胞仍保留初染劑的顏色，是芽泡和菌體更易區分。菌體呈紅色而芽抱呈綠色。

（二）莢膜染色法

莢膜是包圍在細菌細胞外的一層粘液狀或膠狀物質，其成分為多糖、糖

蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易

在用水沖洗時被除去。

莢膜雖不是細胞的主要結構，但它是細胞外碳源和能源性貯藏物質，并

能保護細胞免受干燥的影響，同時能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御

宿主吞噬細胞的吞噬。

由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖

洗時被除去。通常用負染色法染色，使細菌和背景著色，背景與菌體之間形

成一透明區即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不

用加熱固定。

三、實驗器材

1、菌種：蠟樣芽抱桿菌約2d營養瓊脂斜面培養物；褐球固氮菌簡單介紹本次

（Azotobacterchmococczs）約2d無氮營養基瓊脂斜面培養物。實驗所月器材

2、染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、

生理鹽水等

3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、乙酸酒

精、擦鏡紙等。

四、實驗方法

1、芽抱染色：

（1）制片；按常規涂片、干燥、固定；

（2）染色：用試管夾夾住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀綠3-4滴，再次介紹制片

維持5min；方法，強調無菌

水洗：待玻片冷卻、用細水流沖洗至流出的水為無色；

（3）操作

（4）復染：蕃紅溶液復染2?3min,水洗;

（5）鏡檢：干后，先低倍鏡觀察，再高倍鏡觀察，并找出適當的視野后，

邊講解邊演示,

將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察。

并強調‘文驗注

2、莢膜染色（濕墨水法）：

（1）制備菌和墨水混合液：加一滴墨水于潔凈的載玻片上，然后挑取少意事項

量褐球固氮菌與之充分混合均勻；

（2）加蓋玻片：將一潔凈蓋波片蓋在混合液上，然后在蓋波片上放一張

濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液；

（3）鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察。

再次強調實驗

五、注意事項

注意事項

1、供芽抱染色用的菌種應控制菌齡，使大部分芽胞仍保留在菌體上為宜。

2、染色加熱過程要及時補充染液，切勿讓涂片干涸。

3、莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。

4、涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形。

六、實驗作業布置本次實驗

（一）繪圖

報告和思考題

I.繪出表示芽胞桿菌的形態特征，注意芽抱的形狀、著生位置及芽抱囊

的形態特征。

2.繪圖說明你所觀察到的細菌的菌體和莢膜的形態。

（二）問題和思考

1.若涂片中觀察到的只是大量游離芽花，很少看到芽覺囊及營養細胞，

你認為這是什么原因？

2.組成莢膜的成分是什么？涂片一般用什么同定方法，為什么？

新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻金物名授課教師姓名及職稱：郭偉表講師

一、授課題目宴歌三數鐵雷的形態觀察

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、學習并掌握觀察放線菌形態的基本方法；

三、實臉教學目

標與課時分2、初步了解放線菌帶形態特征。

配3課時

四、授課重點1、放線菌的制片方法及其注意事項

五、授課難點1、放線菌的制片方法及其注意事項

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高

文獻等教育出版社。

L試比較二種培養和觀察放線菌方法的優缺點.

九、思考題

2.鏡檢時，你如何區分放線茵的基內菌絲和氣生菌絲？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負責人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：微生物學實驗授課教師姓名及職稱：郭偉云講師

基本內容教學手段和

教學組織

一、實驗目的

先點評上次實

1、學習并掌握觀察放線菌形態的基本方法；

2、初步了解放線菌帶形態特征。驗作業

二、實驗內容和原理

放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體帶一類革蘭氏陽性細菌。結合理論知識

常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養基表面或深入培養基內生長帶叫基和圖片講解實

內菌絲（簡稱“基絲”），基絲生長到一定階段還能向空華中生長出氣生菌絲（簡驗原理

稱“氣絲”），并進一步分化產生抱子絲及抱子。

放線菌的抱子絲形狀和電子排列情況是放線菌分類的重要依據，為了不打亂

抱子的排列情況，常用印片染色法和膠帶紙粘菌染色法進行制片觀察。

為了觀察放線菌的形態特征，人們設計了各種培養和觀察方法，這些方法的

主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長條件下的形態特征，本實驗介紹其中

幾種常用的方法。

（1）桿片法

將放線菌接種在瓊脂立板上，桿上滅菌蓋玻片后培養，使放線菌絲沿著培養

基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上，觀察時，輕輕取出蓋玻片，置于

載玻片上直接鏡檢。這種方法可以觀察到放線菌自然生長狀態下的特征，而且便

于不同生長期的形態。

（2）玻璃紙法

玻璃紙是一種透明的當透膜，將滅菌的玻璃紙覆蓋在瓊脂平板表面，然后將

放線菌接種于玻璃紙上，經培養，放線菌在玻璃紙上生長形成菌苔。觀察時，揭

下玻璃紙，固定在載玻片上直接鏡檢。這種方法既能保持放線菌的自然生長，也

便于觀察不同生長期的形態特征。

（3）印片法

將要觀察帶放線菌帶菌落或菌苔，先印在載玻片上，經染色后觀察。這種方

法主要用于觀察抱子絲帶形態、抱子帶排列及其形狀等。該方法簡便、但形態特

征可能有所改變。

我們本次實驗主要采用印片法來觀察放線菌的基本形態。

三、實驗器材簡單介紹本次

1.菌種：細黃鏈霉菌4M乂稱5406或青色鏈霉菌（S.

實驗所用器材

glaucus'）,弗氏鏈霉菌（S.fradiae'）；

2.染色液：石炭酸復紅染色液；

3.器材：載玻片，玻璃紙，小刀，接種環，吸水紙，擦鏡紙，酒精燈，香柏

油，乙醛-乙醇混合液，顯微鏡。

四、實驗方法

（1）印片：用解剖刀取放線菌培養體一塊，將菌面朝上放在一載玻片上，

另取一潔凈載玻片置于火后上微熱后，蓋在菌苔上，輕輕按壓，使培養物（氣絲、

邊講解邊演示

電子絲或抱子）粘附（“印”）在后一塊載玻片的中央，有印跡的一面朝上，通過

印片方法，并強

火焰2-3次固定；

調實驗注意事

（2）染色：用碳酸復紅覆蓋印跡，染色約Imin后水洗；

項

（3）鏡檢：干后先用低倍鏡后用高倍鏡，最后用油鏡觀察抱子絲、抱子的

形態及抱子排列情況。

五、注意事項

1、鏟菌苔時注意不要將瓊脂鏟得太厚.以免影響壓片：再次強調實驗

、玻片不要太熱，以免瓊脂融化，干擾放線菌的附著；

2注意事項

3、制片過程中切不可涂片，以免破壞菌絲形態；

4、印片完畢后注意將印有放線菌的一面朝上進行固定，印片不要用力過大

壓壞瓊脂培養基，也不要挪動，以免改變放線菌的自然形態；

5、觀察時宜采用略暗的光線。

六、實驗作業

（一）繪圖布置本次實驗

繪出說明你所觀察到的放線菌的主要形態特征。報告和思考題

（二）問題和思考

1.試比較三種培養和觀察放線菌方法的優缺點。

2.鏡檢時，你如何區分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲？

新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻士物學授課教師姓名及職稱：郭偉衣講師

一、授課題目宴歌四酵號雷的形態觀察及無活福蹌的泰助

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、觀察酵母菌的細胞形態及巴芽生殖方式；

三、實驗教學目2、學習掌握區分酵母菌死、活細胞的染色方法；

標與課時分

3、掌握酵母菌的一般形態特征及其與細菌的區別。

酉己

3課時

1、酵母菌的形態特征

四、授課重點

2、酵母菌死活細胞鑒別的原理

1、酵母菌的形態特征

五、授課難點

2、酵母菌死活細胞鑒別的原理

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高

文獻等教育出版社。

1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對醉母菌死細

九、思考題胞數量有何影響？試分析其原因。

2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區別于一般細菌？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負責人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：微生物學實驗授課教師姓名及職稱：郭偉云講師

基本內容教學手段和

教學組織

一、實驗目的

先點評上次實

1、觀察酵母菌的細胞形態及出芽生殖方式；

2、學習掌握區分酵母菌死、活細胞的染色方法；驗作業

3、掌握酵母菌的一般形態特征及其與細菌的區別。

二、實驗內容和原理

酵母菌是多形的、不運動的單細胞微生物，細胞核與細胞質已有明顯的分化，結合理論知識

菌體比細菌大。繁殖方式乜較復雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是和圖片講解實

以分裂方式繁殖：有性繁燃是通過接合產生于囊胞子。驗原理

本實驗通過用美藍染色浸片來觀察生活的酵母形態和出芽生殖方式。

美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來

對酵母的活細胞進行染色。

由于細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍

色的氧化型變為無色的還原型，所以酵母的活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩

慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍

色。因此，用美藍水浸片大僅可觀察酵母的形態，還可以區分死、活細胞。

三、實驗器材

1、菌種：釀酒酵母（SaccharomycescereWshe）培養約2d的麥芽汁斜面培

簡單介紹本次

養物；

實驗所用器材

2、染色液和試劑：0.05%和0.1%呂氏堿性美藍染液：

3、器材：廢液缸、載玻片、蓋玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。

四、實驗方法

（1）在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染色液，用接種環挑取少量醉邊講解邊演示

母菌苔放入上述液滴里，混合均勻；實驗方法，并強

（2）用鎰子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下調實驗注意事

使其蓋在菌液上：

項

（3）將制片放置約3min,先低倍鏡后高倍鏡觀察醉母形態和出芽情況，并

根據顏色區別死活細胞。

（4）染色30min后再次觀察，注意死活細胞數量的變化：

（5）用0.05%的呂氏堿性美藍染色液重復上述操作。

五、注意事項

再次強調實驗

1、加染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液會溢出或出現大

量氣泡而影響觀察；注意事項

2、蓋玻片不宜平著放下，以免產生氣泡影響觀察。

六、實驗作業

（一）繪圖布置本次實驗

繪圖說明你所觀察到的酵母菌的細胞結構及出芽生殖方式。

報告和思考題

（二澗題和思考

1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對醉母菌死細胞數量有何影

響？試分析其原因。

2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區別于一般細菌？

新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻金物學授課教師姓名及職稱：知偏語副秋裁

一、授課題目案徐，，拷泉泉的制備與天雷

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、明確培養基的配制原則；

三、實險教學目2、掌握配制培養基的一般方法和步驟；

3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；

標與課時分

4、掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用滅菌方法。

配

6課時

1、掌握配制培養基的一般方法和步驟；

四、授課重點

2、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；

五、授課難點掌握配制培養基的一般方法和步驟

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高

文獻等教育出版社。

九、思考題為什么微生物培養需要不同的培養基？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負費人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：獻金物名宴般授課教師姓名及職稱：對徜濤副赦裁

基洋的客教學手段和

教學組織

一、實球目的

先點評上次實

1、明確培養基的配制原則；驗作業

2、掌握配制培養基的一般方法和步驟；

3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；

4、掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用滅菌方法。

二、賣險原理

結合理論知識

培養基是按照微生物生長繁殖或積累代謝產物所需的各種營養物質，用人工講解實驗原理

方法配制而成的一種基質。它包括碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水六

類營養要素。由于不同微生物細胞組成不同，因而所需營養基質不同，為了分離、

培養和鑒定不同的微生物，必須根據其需要，配制合適的培養基。

培養基的種類繁多，根據培養基的成分、物理性狀不同，可分為天然培養基、

合成培養基、半合成培養基、固體培養基、半固體培養基和液體培養基。

滅菌是指應用物理或化學的方法，殺滅物體表面和內部一切微生物營養體、

芽泡和狗子。滅菌方法很多，可分為加熱、過濾、照射和化學藥品法等。

常用加熱滅菌法：

1、干熱滅菌：

這種滅菌法是利用熱空氣使物體升溫，而導致物體上所帶的微生物由于干

熱脫水而死亡。常用于空玻璃器皿、金屬用具等的滅菌，對于帶膠皮的物品、液

體及固體培養基等不能使月此法滅菌。

2、高壓蒸汽滅菌法

此種滅菌方法的原理是在一密閉容器中，煮沸時形成的蒸汽不能擴散到容器

外面去，而堆積在密閉的容器內，使蒸汽壓力升高；隨著水的煮沸，溫度也就相

應增高。利用過熱的蒸汽及使細菌及其耐熱芽泡蛋白質凝固變性，以致失去生命

力，從而達到徹底滅菌的效果。

高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2）,

12L30C保持15—30分鐘進行滅菌,就可殺死一切微牛物細胞及其芽狗或抱子。

進行高壓蒸汽滅菌的儀器叫高壓蒸汽滅菌鍋。滅菌對象是培養基、玻璃器皿和各

種不因高溫處理而變質的物品材料。但對一些不耐高溫、高壓的溶液或培養基不

宜用此種方法。

簡單介紹本次

三.畀材和用晶

實驗所用器材

1.1000ml刻度分裝搪瓷缸、200ml燒杯、角匙、天平、稱量紙或小燒杯、

pH試紙、500ml三角瓶，I8mmx180mm試管、紗布、棉花、10ml移液管等。

2.牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10%NaOH溶液、10%鹽酸溶液。邊講解邊演示,

0、方依和步藤并強調實驗注

1.培養基配方：牛肉膏5.0g,蛋白陳10.0g,NaCI5.0g,瓊脂20.0g,蒸儲水意事項

KX）0ml,pH7.0o

2.操作步驟

（1）用稱量紙分別稱取牛肉膏5.0g、蛋白陳10.0g,把牛肉膏連同稱量紙與

蛋白陳一起放入200ml的燒杯中，然后加入100ml水，置電爐上加熱攪拌至其完

全溶解。用玻璃棒把稱量紙挑出沖凈（用洗瓶洗，沖洗液流入燒杯）。

（2）將溶解的混合液倒入1000ml搪瓷缸中，稱取5.0gNaCl加入，洗滌燒

杯2?3次，洗液倒入缸中，補足自來水到1000ml（液體培養基制成，即可分裝）,

攪拌加熱煮沸。

（3）稱取20g瓊脂，放入煮沸的溶解液中，繼續加熱至瓊脂完全溶解，加

熱過程中要不斷攪拌以防瓊脂沉淀糊底或溢出杯外。

（4）待瓊脂完全融化后，再補足自來水，趁熱用玻璃棒蘸少許液體點在pH

試紙上測定酸堿度并用NaOH或HCI溶液調整pH值至7.2?7.4。

（5）趁熱分裝入15mmX150mm試管中，每管5m1（斜面用）。18mmX180mm

試管，每管分裝15ml（平板用）。

（6）將余下的分裝在500ml三角瓶中（每瓶約300ml）。

（7）將上述分裝在各種容器中的培養基，塞好棉塞，捆孔好。

（8）O.IMPa高壓蒸汽滅菌30分鐘。

強調注意事

（9）擺斜面滅菌后，需做斜面的試管，應待培養基冷卻至50?60C（溫度

不能過高，以防斜面上冷凝水太多）后，擺成斜面。斜面的斜度要適當，斜面的項

長度不超過試管長度的二分之一。擺放時注意不要使培養基沾污棉塞，冷凝過程

中不要移動試管，待斜面完全凝固后，再收起使用或貯藏。

上，整盤串項

1、稱取藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；

2、蛋白陳極易吸濕，稱取時動作要迅速；

3、配制固體培養基時，先將其他藥品加熱溶解到快沸時，再將稱好的瓊脂

加入，繼續加熱至瓊脂完全熔化，此過程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火

力，防止沸騰外溢；

4、分裝量根據試管大小和實際需要而定，固體培養基裝量約為管高的1/5,

液體培養基的裝量約為管高的1/4,三角瓶的裝量不超過瓶體的1/2；

5、分裝過程中注意不要將培養基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起

污染。

新鄉醫學院實驗課教案首頁

課程名稱：獻士物學授課教師姓名及職稱：方啟禹講師

一、授課題目

二、授課對象2005級生物技術專業本科生

1、了解微生物分離和純化的原理

三、實險教學目2、掌握倒平板的方法和兒種常用的分離純化接種培養的基本

標與課時分操作技術，掌握微生物的無菌操作技術。

西己

6課時

四、授課重點微生物分離和純化的基本原理

五、授課難點微生物分離和純化的基本原理

六、授課形式實驗課講授

七、授課方法與授課方法：啟發式教學，討論式教學；

課前準備課前準備：做預實驗，準備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學實驗（第三版）》，高

文獻等教育出版社。

1.在你所實驗的三種培養基平板上長出的菌落屬于哪個類

群？簡述它們的菌落形態特征。

2.稀釋分離時，為什么要將已融化的瓊脂培養基冷卻到45?

九、思考題50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養皿內？

3.劃線分離時，為什么每次都要將接種環上多余的菌體燒

掉？劃線為何不能重疊？

教研室主任（簽字）課程負責人（簽字）

十、教研室主任

及課程負費人簽

年月日年月日

字

新鄉醫學院實驗課教案

課程名稱：微生物學實驗授課教師姓名及職稱：高啟禹講師

基漳向客教學手段和

教學組織

一、實球目的

先點評上次實

1、了解微生物分離和純化的原理驗作業

2、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養的基本操作技術，掌

握微生物的無菌操作技術。

二、宴般煮理結合理論知識

在自然界中，不同種類的微生物絕大多數都是混雜生活在一起的，為了生產講解實驗原理

和科學研究的需要，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類

群中分離出它，以得到只含有這一種微生物的純培養物，這種獲得純培養物的方

法稱為微生物的分離與純化。為了獲得純種的微生物，一般根據該微生物營養或

培養特點，或對某種抑制劑的耐受性不同，或對某種環境條件要求不同，從而制

作或設置一些選擇性培養基，或選擇性培養條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混

合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。

土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物數量和種類都極其豐富，

因此，土壤是我們開發利月微生物資源的重要來源，可以從其中分離純化到許多

有用的菌株。簡單介紹本次

三、看初雜用晶實驗所用器材

1.樣品土樣

2.培養基牛肉膏蛋白腺瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、豆芽汁

培養基。

3.其它盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、無

菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環、無菌培養皿。

邊講解邊演示，

四.方依痛步跋

并強調實驗注

（一）、稀釋混合平板法

1.細菌的分離意事項

（1）土壤稀釋液的制備①稱取土樣10g,放入盛90ml無菌水三角瓶中，

振蕩15?20分鐘，使微生物細胞分散，靜置約20?30秒，即成1（尸的土壤懸液。

②另取裝有9ml無菌水的試管,編號為10410-3、10＜、10\IO-及io”,用

無菌吸管吸取IO」土壤懸液1mL加入編號IO2的無菌試管中，吹吸三次，使之

混合均勻，即成ICTz的土壤稀釋液。再用另一支吸管吸取IO。試管中的土壤稀稀

液1ml,加入編號104的無菌試管中，輕輕搖動，使之混合均勻，即成IO-的土

壤稀釋液，一定要每次更換一支無菌吸管（連續稀釋）。同法依次分別稀釋成10±

10-5和10-6等一系列稀釋度菌懸液（見圖1）。

（2）平板制作將無菌培養皿編上10-4、10-5、］0心號碼，每一.號碼設三個重

復，用1ml無菌吸管按無菌操作要求吸10-6稀釋液各11rL分別放入編號1（）4的

三個培養皿中。同法吸取IO。稀釋液各iml,分別放入編號IO。的三個培養皿中。

再吸取1（尸稀釋液各1ml,分別放入編號1（尸的三個培養皿中。然后在9個培養

皿中分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉育蛋白陳瓊脂培養基，加

蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，

整個操作過程應嚴格按照元菌操作（見實驗1）。

圖1從土城中分離微生物操作過程

（3）培養與移植待平板完全冷凝后，將平板倒置37c恒溫箱中培養24?

48小時，檢查分離結果。將培養后長出的單個菌落分別挑取接種到牛肉育蛋白陳

培養基的斜面上，然后置于37c恒溫箱中培養，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單

純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其它雜曲混雜，就可

再一次進行分離、純化，直至獲得純培養。

2.放線菌的分離由于放線菌在培養基上蔓延生長不如真菌快，其繁殖速

度又比細菌慢，故分離這類微生物時要特別注意防止細菌和霉菌的蔓延，以免妨

礙放線菌的生長。為了保證放線菌的優勢生長，可對樣品做如下處理：（I）為了

除去部分細菌，可先將土壤進行風干。因為細菌營養體遇干燥環境容易死亡，而

放線菌比細菌的抗干燥能力強。風干的土壤與少量CaCO?混合，于28c培養數

天，更能進一步減少細菌和增加放線菌的數量。（2）選用的土壤稀釋度要根據放

線菌的多少來決定，可用1（尸、10-4或其它稀釋度。在所選用的稀釋液中加入l（）0g/L

酚10滴，充分混勻，可進一步減少細菌和霉菌的生長。

一般放線菌生長的適宜溫度為25?28C,培養5?7天，培養基為高氏一號

培養基。具體操作過程見“細菌的分離工

3.霉菌的分離大多數霉菌為好氧微生物，必須有充足的氧氣才能很好地

生長。霉菌能耐受較酸性環境，所以一般分離霉菌時取偏酸性、含有機質較豐富

的接近表層的土壤，特別是森林土壤中含有較多霉菌。如果用特定的材料為培養

基分離霉菌，經培養后，長出的菌種可能較為單一。比如用新鮮的桔皮保溫培養,

容易長出青霉。

分離方法具體操作過程見“細菌分離”，只是將稀釋度向前移2位數。采

用馬丁氏（Martin）瓊脂培養基，在培養基中加1/3000的孟加拉紅水溶液,使用

時每10ml培養基再加0.03%鏈霉素溶液1ml（含鏈霉素30ug/mD,用28?30℃

下培養

3?5天，待菌落長出后，卷查結果。

（二）稀釋涂布平板法

此法與稀釋混合平板法基本相同，無菌操

作也一樣，所不同的是先將牛肉育蛋白陳培養

基，高氏一號培養基，馬丁氏培養基融化，在

火焰旁注入培養皿，搖勻后制成平板，然后用

三支1ml無菌吸管分別由10”、10\10《三管

土壤稀釋液中各吸取0.2W對號放入已寫好稀

釋度的平板中，用無菌玻謫涂棒在培養基表面

輕輕地涂布均勻，然后分別倒置于28℃和37℃

溫箱中培養后，再挑取單個菌落，直至獲得純

培養。

（三）平板劃線分離法圖2平板劃線操作圖

1.將各種固體培養基融化后制成平板，并

用記號筆標明培齊基名稱。

2.劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10”的土壤

稀釋液一環在平板上劃線（如圖2）,劃線方法很多，但無論哪種方法劃線，其目

的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用劃線方法有下

列三種：

（1）交又劃線法用接種環以無菌操作挑取土壤懸液一環，先在平板培養

基的一邊作第一次平行劃線3?4條，再轉動培養皿約70。角，并將接種環上的

殘菌燒抻，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二

次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃

線（如圖3）,劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫箱培養。

（2）連續劃線法用接種環挑取樣品在平板培養基上作連續劃線（如圖

14-3b）,劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫箱培養。