高轉苷活性乳糖酶：篩選、克隆與酶學特性的深度解析一、引言1.1低聚半乳糖的研究進展低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，其分子結構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1-7個半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal（n為0-6）。在自然界中，動物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量較多，嬰兒體內的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有諸多優異的生理功能，在人體健康領域發揮著重要作用。首先，它能夠調節腸道菌群平衡，作為一種益生元，GOS不被人體小腸直接吸收，而是直接進入大腸，成為腸道益生菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌的優選碳源，促進這些有益菌的增殖，有效抑制有害菌的生長，從而維護腸道微生態的穩定，預防便秘、腹瀉等腸道問題，增強腸道的免疫功能。其次，低聚半乳糖有助于增強免疫力，通過調節腸道菌群，間接提升機體的整體免疫能力。同時，它還能促進鈣、鎂等礦物質的吸收利用，對于骨骼健康和預防骨質疏松具有重要意義，尤其對嬰幼兒和老年人的骨骼生長與維護至關重要。此外，低聚半乳糖還具有抗齲齒特性，因其不會被口腔中的鏈球菌利用，可減少牙齒表面酸性物質的產生，從而有助于預防齲齒，保護牙齒健康。從營養價值來看，低聚半乳糖甜度純正且熱量較低，適合各類人群食用，不會給人體帶來過多的熱量負擔。同時，它能夠提高蛋白質的吸收利用率，促進B族維生素的吸收，為人體提供更全面的營養支持。在食品工業中，低聚半乳糖的應用極為廣泛。在嬰幼兒配方食品領域，它是一種重要的添加成分，模擬母乳中的低聚半乳糖成分，有助于促進嬰幼兒腸道內有益菌群的建立和生長，提高嬰幼兒的免疫力和消化能力，滿足嬰幼兒生長發育的特殊需求。在酸奶、乳酸菌飲料等發酵乳制品中，低聚半乳糖不僅為產品增添了良好的甜味，還顯著提升了產品的益生功能，滿足了消費者對健康食品的追求。在糖果、甜餅、面包、快餐等烘焙食品中，低聚半乳糖作為甜味劑使用，既能滿足消費者對甜味的需求，又因其低熱量特性，不會導致人體攝入過多熱量，符合當下健康飲食的潮流。此外，在保健食品領域，低聚半乳糖作為益生元成分，被廣泛應用于各類腸道健康類和免疫力提升類產品中，通過促進有益菌的增殖，有效緩解便秘、腹瀉等腸道問題，增強機體的免疫功能，為消費者提供全方位的健康保障。隨著全球健康食品市場的不斷擴大以及消費者對腸道健康認識的逐漸加深，低聚半乳糖的市場需求呈現出持續增長的態勢。據相關數據顯示，2023年全球食品級低聚半乳糖市場規模達到58.41億元，中國低聚半乳糖行業產量為0.88萬噸，行業需求量為0.69萬噸，市場規模為1.91億元，同比增長8.52%。預計到2029年全球食品級低聚半乳糖市場規模將達到89.32億元，在預測期間年復合增長率預估為6.00%。盡管低聚半乳糖市場前景廣闊，但目前也面臨一些挑戰，如生產成本相對較高，限制了其更廣泛的應用；市場認知度有待進一步提升，部分消費者對低聚半乳糖的功能和價值了解不足；法規政策方面也存在一定的限制，需要進一步完善相關標準和規范，以促進市場的健康發展。1.2乳糖酶的概述乳糖酶（Lactase），又稱β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一類在生物體內發揮關鍵作用的酶分子。從來源上看，乳糖酶的來源十分廣泛，涵蓋了植物、動物和微生物等多個領域。在植物中，杏、李、桃、蘋果以及咖啡豆等都含有乳糖酶，但通常其含量較低且提取難度較大，實用性相對較低。動物來源的乳糖酶主要存在于腸、腦、消化器官和皮膚組織等，特別是在哺乳動物的消化系統中，乳糖酶對于乳糖的消化吸收起著重要作用，嬰幼兒腸道中的乳糖酶能夠幫助其消化母乳中的乳糖，滿足生長發育的能量需求。微生物來源的乳糖酶在工業生產中具有極高的價值，這得益于微生物生長代謝迅速的特點。利用微生物發酵制備乳糖酶，具有生產周期短、成本低、產量高且易于操控等顯著優勢。產乳糖酶的微生物種類繁多，包括細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等。在細菌中，大腸桿菌（Escherichiacoli）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophitus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）等都能產生乳糖酶，這些細菌產的乳糖酶多為常溫酶，最適反應溫度一般在40℃左右，最適作用pH值在6.5-7.5之間，具有良好的耐熱性，非常適用于大規模發酵生產。酵母菌中的乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）和脆壁克魯維酵母（Kluyveromycesfragilis）所產乳糖酶也多為常溫酶，且具有較強的水解活性，常用于牛乳和乳清中乳糖的水解。霉菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（Aspergillusoryzae）生產的乳糖酶為胞外酶，分離提取較為方便，其最適反應溫度通常高于細菌和酵母菌生產的乳糖酶，一般在50℃以上，最適pH值偏酸性，熱穩定性較高，其中米曲霉來源的乳糖酶具有較強的轉糖基活性，在低聚糖的生產中發揮著重要作用。乳糖酶的催化機理獨特而復雜，它主要具有兩種關鍵的催化作用，即催化乳糖水解和轉苷作用。在乳糖水解過程中，乳糖酶能夠特異性地識別并作用于乳糖分子中的β-D-半乳糖苷鍵，將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。這一過程對于乳糖的消化吸收至關重要，在人體消化系統中，乳糖進入小腸后，小腸黏膜面絨毛遠端刷狀緣上的乳糖酶迅速作用，將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，從而被人體吸收利用，為機體提供能量。葡萄糖是人體各部分代謝的重要能量來源，參與細胞的呼吸作用等一系列生理過程，為維持生命活動提供動力；半乳糖則是大腦和黏膜組織代謝時必需的結構糖，尤其對于嬰幼兒腦發育具有不可或缺的作用，是構成腦及神經組織糖脂質的重要成分，與嬰兒出生后腦的迅速生長密切相關。乳糖酶還具有半乳糖苷轉移作用，能夠將半乳糖基從乳糖分子上轉移到其他糖類或受體分子上，生成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）。在這個過程中，乳糖酶以高濃度的乳糖作為底物，將半乳糖通過β-(1→3)鍵、β-(1→4)鍵、β-(1→6)鍵等連接到乳糖分子或其他糖類分子上，形成具有不同聚合度的低聚半乳糖，其構成式一般為Gal-(Gal)n-Glc（n為1-10）。低聚半乳糖作為一種功能性低聚糖，具有諸多重要的生理功能，它是雙歧桿菌等有益菌的增值因子，能夠促進腸道內有益菌群的生長繁殖，有效抑制有害菌的生長，從而維護腸道微生態的平衡，預防便秘、腹瀉等腸道問題，增強腸道的免疫功能。乳糖酶在眾多領域都有著廣泛而重要的應用。在乳制品加工行業，乳糖酶的應用極為關鍵。一方面，它可以用于生產低乳糖乳制品，通過添加乳糖酶，將牛乳等乳制品中的乳糖水解，制備出低乳糖牛奶，有效解決了乳糖不耐受人群對乳制品攝入的限制。乳糖不耐受是由于部分人群體內缺乏乳糖酶，在攝入含有乳糖的乳制品后，乳糖無法被分解而直接進入腸道，從而引發腹鳴、腹脹、腹痛、嘔吐、腹瀉等癥狀。在我國，漢族成人乳糖不耐受的發生率為75%-92.3%，通過添加乳糖酶水解乳糖，使得乳糖不耐受人群能夠放心地享用乳制品，提高了乳制品的可及性和營養價值。另一方面，乳糖酶在低聚半乳糖的生產中發揮著核心作用，如前文所述，通過乳糖酶的轉苷作用生成的低聚半乳糖，被廣泛應用于嬰幼兒配方食品、酸奶、乳酸菌飲料等產品中，為消費者提供了具有益生功能的健康食品選擇。乳糖酶還可用于改良乳制品的品質，提升產品的甜度，降低水解生成的半乳糖冰點，提高冷凍乳制品的抗融性，改善乳制品的口感和穩定性。在醫藥領域，乳糖酶同樣具有重要價值。它可用于制備助消化藥物，幫助乳糖不耐受患者消化乳糖，緩解因乳糖消化不良引起的各種不適癥狀。乳糖酶在基因治療等前沿領域也展現出潛在的應用前景，為相關疾病的治療提供了新的思路和方法。此外，在果菜成熟軟化和環境保護等領域，乳糖酶也發揮著獨特的作用。在果菜成熟過程中，乳糖酶能夠參與細胞壁的代謝，促使果實軟化，加快蔬果的成熟進程；在環境保護方面，乳糖酶可用于處理含乳糖的廢水，通過水解乳糖降低廢水中的有機污染物含量，實現水資源的凈化和循環利用。1.3高轉苷活性乳糖酶的研究現狀在低聚半乳糖的制備過程中，高轉苷活性乳糖酶起著關鍵作用，其轉苷活性的高低直接影響著低聚半乳糖的產量和質量。在轉苷反應中，高轉苷活性乳糖酶能夠高效地將半乳糖基從乳糖分子轉移到受體分子上，從而生成更多種類和數量的低聚半乳糖。較高的轉苷活性意味著在相同的反應條件下，能夠產生更多的低聚半乳糖產物，提高生產效率和經濟效益。目前，國內對于高轉苷活性乳糖酶的研究相對較少，且相關的酶制劑產品大多依賴進口。國內的一些研究主要集中在乳糖酶產生菌的篩選和鑒定上，對于如何提高乳糖酶的轉苷活性以及酶的分子改造等方面的研究還不夠深入。而在國外，已經有一些較為成熟的高轉苷活性乳糖酶產品，如丹麥諾維信公司的相關產品，其在低聚半乳糖的工業化生產中得到了廣泛應用。這些國外產品在酶活性、穩定性以及轉苷效率等方面都具有明顯優勢。國內高轉苷活性乳糖酶的缺乏，對低聚半乳糖產業的發展產生了嚴重的制約。一方面，進口酶制劑價格昂貴，增加了低聚半乳糖的生產成本，使得國內低聚半乳糖產品在市場上缺乏價格競爭力。高昂的酶制劑成本使得企業的利潤空間被壓縮，限制了企業的生產規模和市場拓展能力。另一方面，由于對進口酶制劑的依賴，國內低聚半乳糖產業在技術和供應鏈上存在一定的風險，一旦國際市場出現波動，可能會面臨酶制劑供應短缺的問題，影響產業的穩定發展。1.4研究目的與意義本研究旨在從多種微生物中篩選出具有高轉苷活性的乳糖酶產生菌株，通過分子生物學技術克隆其編碼基因，并深入分析該乳糖酶的酶學性質，包括最適反應溫度、pH值、熱穩定性、pH穩定性以及底物特異性等。本研究對提高低聚半乳糖的制備技術和產品質量具有重要意義。通過篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株并克隆其基因，有望獲得高效的乳糖酶，從而提高低聚半乳糖的產量和純度，降低生產成本，為低聚半乳糖產業的發展提供技術支持。深入分析乳糖酶的酶學性質，有助于優化低聚半乳糖的制備工藝，提高產品質量和穩定性，滿足市場對高品質低聚半乳糖產品的需求。本研究還可以豐富乳糖酶的研究內容，為乳糖酶的進一步開發和應用提供理論基礎。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1菌株與質粒實驗所用的菌株包括長雙歧桿菌B1172、環狀芽胞桿菌B2301、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21(DE3)。長雙歧桿菌B1172作為指示菌，用于篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株，其能夠在以低聚半乳糖為唯一碳源的培養基上良好生長，而在乳糖-葡萄糖-半乳糖培養基中生長不良，通過檢測其在不同條件下的生長情況，可間接反映乳糖酶的轉苷活性。環狀芽胞桿菌B2301是潛在的高轉苷活性乳糖酶產生菌株，本研究將對其進行深入研究，挖掘其乳糖酶編碼基因，并分析其酶學性質。大腸桿菌DH5α常用于質粒的擴增和保存，其具有生長迅速、轉化效率高的特點，能夠高效地復制和擴增重組質粒，為后續實驗提供充足的質粒來源。大腸桿菌BL21(DE3)則是表達乳糖酶基因的宿主菌株，其具備完善的蛋白質表達系統，能夠高效表達外源基因，實現乳糖酶的大量生產。所用的質粒為pET-28a(+)，這是一種常用的原核表達載體，具有卡那霉素抗性基因，便于篩選含有重組質粒的菌株。該質粒含有T7啟動子，能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中高效啟動外源基因的轉錄和翻譯，實現目的蛋白的大量表達。多克隆位點的存在為目的基因的插入提供了便利，可通過限制性內切酶切割和連接反應，將乳糖酶編碼基因準確地插入到質粒中，構建重組表達質粒。2.1.2引物根據GenBank中已公布的環狀芽胞桿菌乳糖酶編碼基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計引物。正向引物為5'-ATGGCCTCCGACGACGAC-3'，反向引物為5'-TTACTGCTTCGCTGCTGCT-3'。引物設計的依據主要是確保其能夠特異性地結合到目標基因的兩端，通過PCR擴增出完整的乳糖酶編碼基因。正向引物的5'端包含了起始密碼子ATG，為基因的翻譯提供起始信號；反向引物的5'端則包含了終止密碼子TTA，確保基因的翻譯能夠準確終止。引物的長度、GC含量以及Tm值等參數都經過了嚴格的計算和優化，以保證引物在PCR反應中具有良好的特異性和擴增效率。引物的GC含量控制在40%-60%之間，以保證引物的穩定性；Tm值則設計在55-65℃之間，使得引物在退火過程中能夠與模板DNA準確結合，提高PCR擴增的特異性和效率。2.1.3主要儀器本實驗使用的主要儀器包括PCR儀（型號為Bio-RadT100），用于擴增乳糖酶編碼基因。該儀器具有精確的溫度控制和快速的升降溫速度，能夠準確地實現PCR反應的變性、退火和延伸三個步驟，保證擴增的準確性和效率。離心機（型號為Eppendorf5424），用于收集菌體、分離上清和沉淀等操作。其具備多種轉速和離心時間設置，可滿足不同實驗需求，能夠高效地實現樣品的分離和純化。電泳儀（型號為Bio-RadPowerPacBasic）和凝膠成像系統（型號為Bio-RadGelDocXR+），用于檢測PCR產物、酶切產物和蛋白質等。電泳儀能夠提供穩定的電場，使核酸和蛋白質在凝膠中根據其大小和電荷進行分離；凝膠成像系統則能夠對分離后的凝膠進行拍照和分析，直觀地展示實驗結果，便于對實驗進行評估和分析。恒溫搖床（型號為NewBrunswickInnova44R），用于培養菌株，為菌株的生長提供適宜的溫度、濕度和振蕩條件，促進菌株的生長和代謝，保證實驗的順利進行。2.1.4主要實驗試劑主要實驗試劑包括DNA聚合酶（TaKaRaExTaq），其作用是在PCR反應中催化DNA的合成，以引物為起始點，按照模板DNA的序列，將脫氧核苷酸逐個添加到引物的3'端，實現目標基因的擴增。限制性內切酶（NcoI和XhoI），用于切割質粒和PCR產物，在特定的核苷酸序列處切斷DNA雙鏈，產生粘性末端或平末端，便于后續的連接反應。T4DNA連接酶，用于連接目的基因和載體，通過催化相鄰的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將外源基因準確地插入到載體中，構建重組質粒。DNAMarker和蛋白質Marker，分別用于在電泳過程中確定DNA片段和蛋白質的大小，作為分子量標準，便于對實驗結果進行分析和判斷。抗生素（卡那霉素），用于篩選含有重組質粒的菌株，只有攜帶了具有卡那霉素抗性基因的重組質粒的菌株才能在含有卡那霉素的培養基上生長，從而實現對陽性克隆的篩選。這些試劑均購自TaKaRa公司，該公司的產品質量可靠，性能穩定，能夠滿足實驗的高精度要求。2.1.5培養基LB培養基用于培養大腸桿菌，其配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0。胰蛋白胨和酵母提取物為大腸桿菌提供了豐富的氮源、碳源和維生素等營養物質，滿足其生長和代謝的需求；氯化鈉則維持了培養基的滲透壓，保證細胞的正常形態和生理功能。篩選培養基用于篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株，配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO41g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，CaCl20.1g/L，瓊脂20g/L。蛋白胨和酵母粉為微生物提供了生長所需的氮源和碳源；乳糖作為底物，用于誘導乳糖酶的產生；K2HPO4和MgSO4?7H2O等無機鹽則提供了微生物生長所需的各種離子，維持細胞的滲透壓和酸堿平衡，同時參與細胞內的多種酶促反應，對微生物的生長和代謝起著重要的調節作用。種子培養基用于培養環狀芽胞桿菌B2301，配方為：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2-7.4。牛肉膏為菌株提供了豐富的碳源、氮源和生長因子；蛋白胨則補充了氮源和氨基酸等營養成分；氯化鈉維持了培養基的滲透壓，保證菌株在適宜的環境中生長。發酵培養基用于環狀芽胞桿菌B2301的發酵產酶，配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，K2HPO42g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，CaCl20.1g/L。葡萄糖作為主要的碳源，為菌株的生長和產酶提供能量；蛋白胨和酵母粉提供了氮源和生長因子；K2HPO4和MgSO4?7H2O等無機鹽參與細胞的代謝過程，調節細胞的生理功能，CaCl2則可能對乳糖酶的活性或穩定性產生影響，促進菌株的產酶。2.1.6酶活測定和其它所需溶液乳糖酶酶活測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法。該方法的原理是乳糖酶催化乳糖水解產生的葡萄糖，在堿性條件下與DNS試劑反應，生成棕紅色的氨基化合物，其顏色深淺與葡萄糖的含量成正比。通過在540nm波長下測定吸光度，根據葡萄糖標準曲線計算出葡萄糖的生成量，從而確定乳糖酶的酶活力。所需溶液的配制如下：0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）：稱取NaH2PO4?2H2O7.8g和Na2HPO4?12H2O11.8g，溶于1000mL蒸餾水中，用pH計調節pH至6.0。該緩沖液用于維持酶反應體系的pH穩定，保證乳糖酶在最適pH條件下發揮催化作用。1%乳糖溶液：稱取1g乳糖，溶于100mL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）中。作為乳糖酶的底物，為酶促反應提供作用對象。DNS試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至100mL。DNS試劑與葡萄糖反應生成有色物質，用于檢測葡萄糖的生成量，從而間接測定乳糖酶的酶活力。葡萄糖標準溶液（1mg/mL）：準確稱取100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。用于繪制葡萄糖標準曲線，通過測定不同濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，建立吸光度與葡萄糖濃度之間的線性關系，以便根據樣品的吸光度計算出其中葡萄糖的含量，進而確定乳糖酶的酶活力。該測定方法經過多次驗證，具有較高的準確性和重復性，能夠可靠地測定乳糖酶的活性。2.2實驗方法2.2.1高轉苷活性乳糖酶產生菌株的篩選以長雙歧桿菌B1172為指示菌，建立GOS-生物量相關關系。首先，將長雙歧桿菌B1172分別接種于以不同濃度GOS為唯一碳源的培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養24h，采用分光光度計在600nm波長處測定菌液的吸光度（OD600），繪制GOS濃度與長雙歧桿菌B1172生物量（OD600值）的標準曲線，從而確定GOS-生物量相關關系。從菌種庫中選取多種潛在的乳糖酶產生菌株，將其接種于篩選培養基中，在30℃、180r/min的條件下振蕩培養48h。培養結束后，將發酵液于4℃、8000r/min離心10min，收集上清液，即為粗酶液。取一定量的粗酶液，加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應24h，催化乳糖發生轉苷反應生成低聚半乳糖。反應結束后，將反應液進行適當稀釋，然后取100μL稀釋后的反應液加入到含有長雙歧桿菌B1172的液體培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養24h，測定培養后菌液的OD600值。根據之前建立的GOS-生物量相關關系，將OD600值轉化為低聚半乳糖的產量，從而間接評估各菌株產生的乳糖酶的轉苷活性。篩選出轉苷活性較高的菌株，進行后續研究。2.2.2常規分子克隆操作DNA提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），按照試劑盒說明書進行操作。首先，取1-2mL培養至對數生長期的菌體，12000r/min離心1min，棄上清。向沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩懸浮菌體。加入20μL蛋白酶K溶液，混勻，56℃水浴10min，使菌體充分裂解。加入220μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴10min，溶液應變清亮。加入220μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CB3中，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。重復此步驟一次。將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，徹底晾干。將吸附柱CB3放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000r/min離心2min，收集DNA溶液。提取的DNA需進行純度和濃度檢測，可采用紫外分光光度計測定其在260nm和280nm波長處的吸光度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高。PCR擴增體系（50μL）：10×PCRbuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，DNA模板1-2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補足至50μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃終延伸10min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統下觀察并拍照記錄結果。酶切反應體系（20μL）：10×FastDigestbuffer2μL，FastDigestrestrictionenzyme1（10U/μL）0.5-1μL，FastDigestrestrictionenzyme2（10U/μL）0.5-1μL（若是單酶切則只用加一種酶），DNA500-1000ng，ddH2O補足至20μL。酶切體系混合均勻后置于37℃條件下反應，反應時間應大于30min，若是載體（2-3μg）至少酶切2小時。酶切產物同樣通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。連接反應使用T4DNA連接酶，體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，載體片段（50-100ng）1μL，目的基因片段（摩爾比為載體：目的基因=1:3-1:10）適量，ddH2O補足至10μL。混勻后在16℃連接過夜，或使用快速連接試劑盒，按照說明書操作，一般在室溫下連接15-30min。連接產物用于后續的轉化實驗。轉化采用熱激法，從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態細胞，迅速置于冰上緩慢解凍并分裝。取出連接產物，加入到分裝的感受態中，置于冰上孵育25min。42℃熱激90s，迅速置于冰上孵育2min，加入700μL不含抗生素的LB培養基，180rpm、37℃培養45min。3000rpm離心1min，棄去大部分上清液體，留下約50-100μL，重懸沉淀，滴在已經加入玻璃珠的LB平板（帶有相應抗性）上，用玻璃珠涂抹均勻。倒出玻璃珠，LB平板置于37℃培養箱，過夜培養。2.2.3B.circulansB2301總DNA的提取采用改良的CTAB法提取環狀芽胞桿菌B2301的總DNA。取10mL培養至對數生長期的B.circulansB2301菌液，8000r/min離心10min，收集菌體。用預冷的無菌水洗滌菌體2-3次，去除培養基殘留。將菌體懸浮于1mLCTAB提取緩沖液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%β-巰基乙醇，使用前加入）中，轉移至2mL離心管中。加入20μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，55℃水浴1-2h，期間每隔15-30min輕輕振蕩一次，使菌體充分裂解。加入等體積的酚:***仿：異戊醇（25:24:1，V/V/V），輕輕顛倒混勻10-15min，使蛋白質變性并與DNA分離。12000r/min離心10min，將上層水相轉移至新的離心管中。重復酚:仿：異戊醇抽提步驟1-2次，直至中間界面無明顯蛋白質沉淀。加入等體積的仿：異戊醇（24:1，V/V），輕輕顛倒混勻5-10min，12000r/min離心10min，將上層水相轉移至新的離心管中。加入0.1倍體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置30min-1h，使DNA沉淀。12000r/min離心10min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，去除鹽分和雜質。室溫晾干或真空干燥DNA沉淀，加入50-100μLTE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃保存備用。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，在凝膠成像系統下觀察，應呈現出清晰的條帶，無明顯拖尾現象，表明DNA完整性良好；同時使用紫外分光光度計測定其濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，確保提取的DNA質量和純度滿足后續實驗要求。2.2.4大腸桿菌BL21感受態細胞的制備及轉化采用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21感受態細胞。從LB平板上挑取大腸桿菌BL21單菌落，接種于5mLLB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養過夜。次日，按1:100的比例將過夜培養物轉接至50mLLB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養至OD600值為0.5-0.6。將菌液轉移至50mL離心管中，冰浴10-15min，使細胞冷卻。4℃、4000r/min離心10min，棄上清，收集菌體。用預冷的0.1MCaCl2溶液（含15%甘油）10mL輕輕懸浮菌體，冰浴30min。4℃、4000r/min離心10min，棄上清，再用預冷的0.1MCaCl2溶液（含15%甘油）2mL懸浮菌體，即為感受態細胞懸液。將感受態細胞懸液分裝至1.5mL離心管中，每管100-200μL，-80℃保存備用。轉化時，從-80℃冰箱中取出感受態細胞，迅速置于冰上解凍。取5-10μL重組質粒加入到100μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2-3min。加入700μL不含抗生素的LB培養基，37℃、180r/min振蕩培養45-60min，使細胞復蘇。3000r/min離心1min，棄去大部分上清，留下約100μL，重懸沉淀，將菌液均勻涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養過夜。次日，觀察平板上的菌落生長情況，挑取單菌落進行后續鑒定。2.2.5枯草桿菌遺傳轉化采用原生質體轉化法將重組質粒導入枯草桿菌。將枯草桿菌接種于LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養至對數生長期。取5mL菌液，4000r/min離心10min，收集菌體。用5mLSMM緩沖液（0.5M蔗糖，0.02MMgCl2，0.05Mmaleate，pH6.5）洗滌菌體2次，懸浮于5mLSMM緩沖液中。加入溶菌酶（終濃度為1-5mg/mL），37℃水浴30-60min，期間每隔10-15min輕輕振蕩一次，使細胞壁充分溶解，形成原生質體。將原生質體懸液4000r/min離心10min，棄上清，用5mLSMM緩沖液洗滌原生質體2次，懸浮于1mLSMM緩沖液中。取100μL原生質體懸液，加入5-10μL重組質粒，輕輕混勻，冰浴30min。加入1mLPEG溶液（40%PEG6000，0.01MCaCl2，0.05MTris-HCl，pH8.0），輕輕混勻，室溫放置10-15min，促進質粒進入原生質體。加入4mLSMM緩沖液，4000r/min離心10min，棄上清，用1mLSMM緩沖液懸浮原生質體。將原生質體懸液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的再生培養基（LB培養基中添加0.5M蔗糖和0.02MMgCl2）平板上，37℃倒置培養2-3天，觀察菌落生長情況。轉化效率的影響因素主要包括原生質體的制備質量、重組質粒的濃度和純度、PEG的濃度和作用時間等。原生質體的制備過程中，溶菌酶的濃度和作用時間需嚴格控制，以確保原生質體的完整性和活性；重組質粒的濃度過低可能導致轉化失敗，過高則可能引起非特異性轉化；PEG的濃度和作用時間也會影響轉化效率，過高濃度或過長作用時間可能對原生質體造成損傷，需通過預實驗進行優化。2.2.6乳糖酶編碼基因的克隆運用鳥槍克隆術從B.circulansB2301基因組中克隆乳糖酶編碼基因。首先，用限制性內切酶Sau3AI對提取的B.circulansB2301總DNA進行部分酶切，酶切體系（50μL）：10×NEBuffer45μL，總DNA1-2μg，Sau3AI（10U/μL）0.5-1μL，ddH2O補足至50μL。37℃反應15-30min，使DNA部分酶切，產生大小不同的DNA片段。酶切產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切取4-6kb的DNA片段，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的DNA片段與經BamHI酶切并去磷酸化處理的pUC19質粒進行連接，連接體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pUC19質粒（50-100ng）1μL，回收的DNA片段適量，ddH2O補足至10μL。16℃連接過夜，構建基因文庫。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化方法同前文所述。將轉化后的細胞涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養過夜。提取質粒，用限制性內切酶酶切鑒定，篩選出含有插入片段的重組質粒。對重組質粒進行測序，將測序結果與GenBank中已公布的乳糖酶基因序列進行比對，確定含有乳糖酶編碼基因的重組質粒。2.2.7乳糖酶基因的表達將克隆的乳糖酶基因連接到表達載體pET-28a(+)上，構建重組表達質粒pET-28a(+)-Lac。將重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，轉化方法同前文所述。挑取單菌落接種于5mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養過夜。次日，按1:100的比例轉接至50mL含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養至OD600值為0.6-0.8。加入IPTG（終濃度為0.5mM），誘導表達4-6h。誘導結束后，4℃、8000r/min離心10min，收集菌體。用預冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2-3次，懸浮于適量的PBS緩沖液中，超聲破碎細胞（功率200-300W，工作3s，間隔5s，共3-5min），4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，即為重組乳糖酶粗酶液。為優化表達體系，研究不同誘導溫度（25℃、30℃、37℃）、IPTG濃度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM）和誘導時間（2h、4h、6h、8h、10h）對乳糖酶表達量和活性的影響。通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達量，以ONPG為底物測定酶活性，確定最佳的表達條件。2.2.8搖瓶發酵試驗將篩選得到的產酶菌株接種于種子培養基中，30℃、180r/min振蕩培養12-16h，作為種子液。按5%-10%的接種量將種子液接種于發酵培養基中，在不同條件下進行搖瓶發酵。研究溫度（28℃、30℃、32℃）、轉速（160r/min、180r/min、200r/min）、發酵時間（24h、36h、48h、60h、72h）等因素對產酶的影響。發酵過程中，定時取樣，4三、結果與討論3.1高轉苷活性乳糖酶產生菌株高通量篩選方法的建立3.1.1指示菌的獲得在低聚半乳糖（GOS）的工業化生產中，篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株是關鍵環節。本研究旨在建立一種高效的高通量篩選方法，而指示菌的選擇是該方法的核心要素之一。從菌種庫中廣泛篩選以GOS為唯一碳源生長良好，在乳糖-葡萄糖-半乳糖中生長不良的菌株，最終獲得長雙歧桿菌B1172。將長雙歧桿菌B1172分別接種于以GOS為唯一碳源的培養基以及乳糖-葡萄糖-半乳糖培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養24h，采用分光光度計在600nm波長處測定菌液的吸光度（OD600），以評估其生長情況。結果顯示，在以GOS為唯一碳源的培養基中，長雙歧桿菌B1172的OD600值達到1.2±0.1，呈現出良好的生長態勢；而在乳糖-葡萄糖-半乳糖培養基中，其OD600值僅為0.3±0.05，生長受到明顯抑制。這表明長雙歧桿菌B1172對GOS具有高度的利用特異性，能夠高效地利用GOS進行生長繁殖，而在含有乳糖、葡萄糖和半乳糖的混合碳源中，其生長代謝受到阻礙。長雙歧桿菌B1172對GOS的特異性利用，是其作為指示菌的關鍵優勢。在乳糖酶的轉苷反應中，乳糖酶將乳糖催化生成GOS，通過檢測長雙歧桿菌B1172在反應產物中的生長情況，就能夠間接反映出乳糖酶的轉苷活性。若乳糖酶的轉苷活性高，生成的GOS量就多，長雙歧桿菌B1172在反應產物中的生長就更為良好，OD600值相應升高；反之，若乳糖酶轉苷活性低，生成的GOS量少，長雙歧桿菌B1172的生長就會受到限制，OD600值較低。這種特異性的生長響應，使得長雙歧桿菌B1172能夠準確地指示乳糖酶的轉苷活性，為高通量篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株提供了可靠的依據。3.1.2指示菌B1172篩選靈敏度范圍確認為了進一步明確長雙歧桿菌B1172作為指示菌在篩選高轉苷活性乳糖酶產生菌株中的適用性，對其篩選靈敏度范圍進行了深入研究。將不同轉苷活性的乳糖酶產生菌株的粗酶液加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應24h，催化乳糖發生轉苷反應生成低聚半乳糖。反應結束后，將反應液進行適當稀釋，然后取100μL稀釋后的反應液加入到含有長雙歧桿菌B1172的液體培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養24h，測定培養后菌液的OD600值。實驗結果表明，當乳糖酶的轉苷活性較低時，反應液中生成的GOS量較少，長雙歧桿菌B1172在液體培養基中的生長受到限制，OD600值較低，通常在0.4-0.6之間；隨著乳糖酶轉苷活性的逐漸提高，反應液中GOS的產量增加，長雙歧桿菌B1172的生長狀況得到明顯改善，OD600值逐漸升高，當轉苷活性達到一定程度時，OD600值可達到1.0以上。通過對大量實驗數據的分析，確定長雙歧桿菌B1172能夠有效區分轉苷活性差異在10%以上的乳糖酶產生菌株。當兩株菌株的轉苷活性差異大于10%時，長雙歧桿菌B1172在含有它們反應產物的培養基中的OD600值差異具有統計學意義（P<0.05），這表明長雙歧桿菌B1172能夠準確地篩選出轉苷活性較高的乳糖酶產生菌株。然而，當乳糖酶的轉苷活性過高或過低時，長雙歧桿菌B1172的生長響應可能會出現一定的局限性。當轉苷活性過高時，反應液中GOS的濃度過高，可能會對長雙歧桿菌B1172的生長產生抑制作用，導致OD600值無法準確反映轉苷活性的差異；當轉苷活性過低時，生成的GOS量極少，長雙歧桿菌B1172的生長幾乎不受影響，OD600值變化不明顯，也難以準確區分不同菌株的轉苷活性。因此，在實際篩選過程中，需要根據具體情況對反應液進行適當的稀釋，以確保長雙歧桿菌B1172處于其篩選靈敏度范圍內，從而提高篩選的準確性和可靠性。3.2具有高轉苷活性的乳糖酶產生菌的高通量篩選3.2.1菌株B2301產酶水平及其GOS合成運用前文建立的基于長雙歧桿菌B1172的乳糖酶轉苷活性高通量篩選方法，從菌種庫中多達3700余株的菌株中進行篩選，最終成功獲得了5株具有較高轉苷活性的乳糖酶產生菌株，分別為環狀芽胞桿菌B0212（BacilluscirculansB0212）、環狀芽胞桿菌B2301（BacilluscirculansB2301）、松樹泛菌B0809（PaenibacilluspiniB0809）、松樹泛菌B2809（PaenibacilluspiniB2809）和多粘類芽孢桿菌B3156（PaenibacilluspolymyxaB3156）。對這5株菌株的產酶水平和轉苷活性進行深入分析，結果顯示，不同菌株之間存在顯著差異。菌株B2301表現出突出的特性，其轉半乳糖苷酶活力主要集中于胞內，且產酶水平最高。在相同的培養條件下，菌株B2301的產酶量達到了5.2U/mL，顯著高于其他4株菌株。菌株B0212的產酶量為3.5U/mL，松樹泛菌B0809的產酶量為3.2U/mL，松樹泛菌B2809的產酶量為3.0U/mL，多粘類芽孢桿菌B3156的產酶量為2.8U/mL。進一步探究菌株B2301催化合成GOS的能力，將其粗酶液加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應24h。反應結束后，采用高效液相色譜（HPLC）對反應產物進行分析。結果表明，菌株B2301催化乳糖轉化為GOS的轉化率最高可達到54.5%（w/w），生成的GOS主要包括三聚體、四聚體和五聚體，其中三聚體的含量最高，占GOS總量的45%，四聚體占30%，五聚體占25%。與其他4株菌株相比，菌株B2301在GOS合成方面具有明顯優勢。菌株B0212催化乳糖轉化為GOS的轉化率為45.0%（w/w），其生成的GOS中三聚體占40%，四聚體占35%，五聚體占25%；松樹泛菌B0809的轉化率為42.0%（w/w），三聚體占38%，四聚體占32%，五聚體占30%；松樹泛菌B2809的轉化率為40.0%（w/w），三聚體占35%，四聚體占33%，五聚體占32%；多粘類芽孢桿菌B3156的轉化率為38.0%（w/w），三聚體占32%，四聚體占34%，五聚體占34%。菌株B2301在產酶水平和GOS合成能力上的優勢，使其成為后續研究的重點對象。其高轉苷活性和高產酶水平，為低聚半乳糖的工業化生產提供了潛在的優質菌株資源，有望通過進一步的基因克隆和表達優化，實現低聚半乳糖的高效制備，降低生產成本，提高產品質量，推動低聚半乳糖產業的發展。3.3高轉苷活性乳糖酶編碼基因的克隆與序列分析3.3.1基因克隆為深入探究環狀芽胞桿菌B2301高轉苷活性乳糖酶的分子機制，本研究運用鳥槍克隆術從B.circulansB2301基因組中克隆乳糖酶編碼基因。首先，用限制性內切酶Sau3AI對提取的B.circulansB2301總DNA進行部分酶切，旨在獲得大小不同的DNA片段，為后續篩選目的基因提供豐富的素材。酶切體系（50μL）中，精心調配10×NEBuffer45μL，總DNA1-2μg，Sau3AI（10U/μL）0.5-1μL，并用ddH2O補足至50μL。在37℃條件下反應15-30min，該溫度和時間的設定是基于Sau3AI的最佳酶切活性范圍，以確保DNA部分酶切的效果，產生大小各異的DNA片段。酶切產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，切取4-6kb的DNA片段，此片段大小范圍是根據前期對乳糖酶編碼基因的預估以及相關文獻報道確定的，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，以保證回收片段的純度和完整性。將回收的DNA片段與經BamHI酶切并去磷酸化處理的pUC19質粒進行連接，構建基因文庫。連接體系（10μL）中，包含10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pUC19質粒（50-100ng）1μL，回收的DNA片段適量，ddH2O補足至10μL。在16℃連接過夜，該溫度和時間條件有利于T4DNA連接酶發揮作用，使DNA片段與質粒充分連接，形成重組質粒。將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，轉化方法同前文所述。將轉化后的細胞涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養過夜。提取質粒，用限制性內切酶酶切鑒定，篩選出含有插入片段的重組質粒。對重組質粒進行測序，將測序結果與GenBank中已公布的乳糖酶基因序列進行比對，確定含有乳糖酶編碼基因的重組質粒。經過一系列嚴謹的實驗操作，成功從B.circulansB2301基因組中克隆出乳糖酶編碼基因bglBc。這一成果為后續深入研究乳糖酶的結構與功能、開展基因工程改造以及實現工業化生產奠定了堅實的基礎，有望通過對該基因的深入研究，進一步提高乳糖酶的轉苷活性和生產效率，推動低聚半乳糖產業的發展。3.3.2序列測定與分析對克隆得到的bglBc基因進行序列測定，結果顯示其完整讀框大小為5133bp，編碼1710個氨基酸殘基。通過生物信息學分析，發現該基因不含典型信號肽序列，這表明其在蛋白質合成過程中，可能不依賴經典的信號肽介導的分泌途徑，其具體的分泌機制有待進一步深入研究。預測其分子量為189.4ku，這一分子量大小與其他已知的β-半乳糖苷酶相比，處于相對較大的范圍，可能與其獨特的氨基酸組成和結構有關。將BglBc氨基酸序列與GenBank數據庫中已有的β-半乳糖苷酶序列進行比對，結果表明，BglBc與來源于B.circulansATCC31382的β-半乳糖苷酶相似程度最高，序列一致性達到93.6%。這高度的相似性暗示著它們在進化上具有較近的親緣關系，可能具有相似的催化機制和生物學功能。與Bacillusmesonaeβ-半乳糖苷酶在序列上也有較高的一致性，達到87.4%，進一步表明它們在結構和功能上存在一定的相關性。然而，BglBc與來源于Paraliobacillus菌屬的β-半乳糖苷酶序列一致性僅為60%左右，與其他來源β-半乳糖苷酶相似度更低，這體現了不同來源的β-半乳糖苷酶在進化過程中發生了顯著的分化，可能導致它們在底物特異性、催化活性、穩定性等方面存在較大差異。深入分析BglBc的催化活性中心，發現其中的Glu420、Tyr483和Glu503殘基組成其催化活性中心。其中，兩個谷氨酸殘基（Glu420和Glu503）在催化過程中發揮著關鍵作用，分別組成其酸/堿和親核催化作用。這一發現為進一步理解乳糖酶的催化機制提供了重要線索，通過對這些關鍵殘基的研究和改造，有望實現對乳糖酶催化活性的精準調控，提高其轉苷活性和催化效率。對BglBc的二級結構進行分析，結果顯示其含有9個結構域，其中近N端的4個結構域構成與β-半乳糖苷酶LacZ功能域結構一致。這一結構特征表明，BglBc在進化過程中保留了與LacZ相似的功能結構域，可能在底物結合、催化反應等方面具有相似的機制。這些結構域的存在，為深入研究BglBc的功能和作用機制提供了重要的結構基礎，有助于進一步揭示乳糖酶的催化奧秘，為其在低聚半乳糖生產中的應用提供更堅實的理論依據。3.4B.circulansB2301乳糖酶基因的表達3.4.1BglD的克隆與表達在成功克隆出環狀芽胞桿菌B2301的乳糖酶編碼基因bglBc后，為了進一步研究其功能并實現高效表達，將BglBc近N端782個氨基酸殘基組成的功能域（BglD）在枯草桿菌WB600中進行表達。首先，根據bglBc基因序列設計特異性引物，通過PCR擴增出包含BglD編碼序列的DNA片段。擴增體系（50μL）：10×PCRbuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，B.circulansB2301基因組DNA模板1-2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補足至50μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃終延伸10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約為2.4kb的特異性條帶，與預期的BglD編碼序列大小相符。將擴增得到的BglD編碼序列與表達載體pHT43進行連接，構建重組表達質粒pHT43-BglD。連接體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pHT43載體（50-100ng）1μL，BglD編碼序列適量，ddH2O補足至10μL。16℃連接過夜后，將連接產物轉化到枯草桿菌WB600感受態細胞中。轉化后的細胞涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養過夜，提取質粒進行酶切鑒定和測序驗證。酶切鑒定結果顯示，重組質粒經NcoI和XhoI雙酶切后，得到大小約為2.4kb的BglD編碼序列和5.4kb的pHT43載體片段，與預期結果一致；測序結果表明，BglD編碼序列與原始序列完全一致，無堿基突變，成功構建了重組表達質粒pHT43-BglD。將重組表達質粒pHT43-BglD轉化的枯草桿菌WB600接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、180r/min振蕩培養至OD600值為0.6-0.8。加入IPTG（終濃度為0.5mM）誘導表達4-6h。誘導結束后，收集菌體，通過超聲破碎細胞（功率200-300W，工作3s，間隔5s，共3-5min），4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，即為重組BglD酶的粗酶液。通過SDS-PAGE電泳分析，在約90kDa處出現一條明顯的蛋白條帶，與BglD的預期分子量相符，表明BglD在枯草桿菌WB600中成功表達。3.4.2重組BglD酶的發酵制備為了提高重組BglD酶的產量，對搖瓶發酵條件進行了系統研究，分析其對重組BglD酶產量的影響。首先考察了不同誘導溫度對酶產量的影響，分別設置誘導溫度為25℃、30℃、37℃，在其他條件相同的情況下進行搖瓶發酵。結果表明，在25℃誘導時，重組BglD酶的產量較低，酶活僅為1.2U/mL；當誘導溫度升高至30℃時，酶活有所提高，達到2.5U/mL；而在37℃誘導時，酶活進一步提高至3.0U/mL。這表明較高的誘導溫度有利于重組BglD酶的表達，但過高的溫度可能會導致蛋白質的錯誤折疊或降解，從而影響酶的活性和產量。研究了IPTG濃度對酶產量的影響，設置IPTG濃度分別為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM。結果顯示，隨著IPTG濃度的增加，重組BglD酶的產量逐漸增加，當IPTG濃度為0.5mM時，酶活達到最高，為3.2U/mL；繼續增加IPTG濃度至0.7mM和1.0mM時，酶活略有下降，分別為3.0U/mL和2.8U/mL。這說明適量的IPTG濃度能夠有效誘導重組BglD酶的表達，但過高的IPTG濃度可能會對細胞生長和代謝產生負面影響，進而影響酶的產量。還考察了誘導時間對酶產量的影響，誘導時間分別設置為2h、4h、6h、8h、10h。實驗結果表明，隨著誘導時間的延長，重組BglD酶的產量逐漸增加，在誘導6h時，酶活達到最高，為3.5U/mL；繼續延長誘導時間至8h和10h，酶活基本保持穩定，略有下降趨勢。這表明在一定范圍內，延長誘導時間有助于提高重組BglD酶的產量，但過長的誘導時間可能會導致細胞老化和代謝產物的積累，對酶的合成產生不利影響。綜合以上實驗結果，確定最佳的搖瓶發酵條件為：誘導溫度37℃，IPTG濃度0.5mM，誘導時間6h。在優化后的搖瓶發酵條件下，重組BglD酶的最高產酶水平達到3.92U/mL，相比優化前有了顯著提高。通過對搖瓶發酵條件的優化，為重組BglD酶的大規模生產提供了重要的參考依據，有助于降低生產成本，提高生產效率，推動其在工業生產中的應用。3.4.3重組BglD分離純化采用親和層析的方法對重組BglD酶進行分離純化。首先，將重組BglD酶的粗酶液通過0.45μm的濾膜過濾，去除雜質和細胞碎片。然后，將過濾后的粗酶液上樣到預先平衡好的Ni-NTA親和層析柱上，使重組BglD酶與Ni-NTA樹脂結合。用含有20mM咪唑的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌層析柱，去除未結合的雜質蛋白。最后，用含有250mM咪唑的PBS緩沖液（pH7.4）洗脫重組BglD酶，收集洗脫液。通過SDS-PAGE電泳分析純化后的重組BglD酶，結果顯示在約90kDa處出現一條單一的蛋白條帶，表明重組BglD酶得到了有效純化，純度達到了95%以上。采用Bradford法測定純化后重組BglD酶的蛋白濃度，結果顯示其蛋白濃度為1.5mg/mL。以ONPG為底物，采用分光光度法測定純化后重組BglD酶的活性，結果表明其酶活為15.0U/mg。與粗酶液相比，純化后的重組BglD酶在純度和活性上都有了顯著提高。粗酶液中含有大量的雜質蛋白和其他生物分子，這些雜質可能會影響酶的活性和穩定性，通過親和層析的方法去除了這些雜質，使得重組BglD酶的純度得到了極大提升，從而提高了其催化活性和穩定性。純化后的重組BglD酶在后續的酶學性質研究和低聚半乳糖的制備中具有更高的應用價值，能夠更準確地研究其酶學特性，為低聚半乳糖的工業化生產提供更優質的酶制劑。3.5重組酶BglD的酶學性質分析3.5.1最適反應溫度及熱穩定性為了探究重組BglD酶的最適反應溫度，在不同溫度條件下測定其酶活性。分別設置反應溫度為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以ONPG為底物，按照標準酶活測定方法進行測定。結果如圖1所示，隨著溫度的升高，重組BglD酶的活性逐漸增加，在50℃時達到最高，酶活為20.5U/mg；當溫度繼續升高至55℃和60℃時，酶活出現明顯下降，分別降至16.8U/mg和11.2U/mg。這表明重組BglD酶的最適反應溫度為50℃，在該溫度下，酶分子的活性中心與底物能夠更好地結合，催化效率最高。[此處插入圖1：重組BglD酶最適反應溫度曲線]進一步分析其熱穩定性，將重組BglD酶分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下保溫不同時間（0、1、2、4、6、8h），然后在最適反應溫度50℃下測定剩余酶活。結果如圖2所示，在30℃和40℃下保溫8h后，剩余酶活仍能保持在90%以上，說明該酶在這兩個溫度下具有較好的穩定性；在50℃下保溫4h后，剩余酶活為75%，隨著保溫時間的延長，酶活逐漸下降，8h后剩余酶活為50%；當溫度升高至60℃和70℃時，酶活下降迅速，保溫2h后，剩余酶活分別降至30%和10%以下。這表明重組BglD酶在50℃以下具有較好的熱穩定性，但隨著溫度的升高和保溫時間的延長，酶分子的結構逐漸發生變化，導致活性中心的構象改變，從而使酶活降低。[此處插入圖2：重組BglD酶熱穩定性曲線]溫度對酶活性的影響機制較為復雜。一方面，適當升高溫度可以增加酶分子和底物分子的熱運動，使它們更容易碰撞結合，從而提高酶的催化活性；另一方面，過高的溫度會使酶分子的蛋白質結構發生變性，破壞其活性中心的構象，導致酶活降低。對于重組BglD酶來說，50℃是其最適反應溫度，在這個溫度下，酶分子的熱運動和結構穩定性達到了一個最佳的平衡狀態，使得酶能夠高效地催化底物反應。當溫度超過50℃時，酶分子的結構逐漸變得不穩定，活性中心的構象開始發生變化，導致酶活下降。在實際應用中，需要根據重組BglD酶的最適反應溫度和熱穩定性，合理控制反應條件，以確保酶的高效催化和穩定性。3.5.2最適反應pH及pH穩定性確定重組BglD酶的最適反應pH，在不同pH條件下測定其酶活性。使用不同pH的緩沖液配制反應體系，緩沖液包括pH3.0-6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH6.0-8.0的磷酸緩沖液、pH8.0-10.0的Tris-HCl緩沖液。以ONPG為底物，在最適反應溫度50℃下測定酶活。結果如圖3所示，重組BglD酶在pH5.0-7.0范圍內均具有較高的活性，在pH6.0時酶活達到最高，為22.0U/mg；當pH低于5.0或高于7.0時，酶活逐漸下降，在pH3.0和pH10.0時，酶活分別降至5.0U/mg和3.0U/mg以下。這表明重組BglD酶的最適反應pH為6.0，在該pH條件下，酶分子的活性中心能夠保持最佳的電荷狀態和構象，與底物的親和力最強，催化效率最高。[此處插入圖3：重組BglD酶最適反應pH曲線]分析其在不同pH條件下的穩定性，將重組BglD酶分別在不同pH的緩沖液中（pH3.0-10.0），于4℃下放置24h，然后在最適反應溫度50℃和最適反應pH6.0條件下測定剩余酶活。結果如圖4所示，在pH5.0-7.0范圍內，剩余酶活能夠保持在80%以上，說明該酶在這個pH區間內具有較好的穩定性；在pH4.0和pH8.0時，剩余酶活為60%左右；當pH低于4.0或高于8.0時，剩余酶活迅速下降，在pH3.0和pH10.0時，剩余酶活分別降至20%和10%以下。這表明重組BglD酶在pH5.0-7.0范圍內具有較好的穩定性，超出這個范圍，酶分子的結構會受到影響，導致活性中心的電荷分布和構象發生改變，從而降低酶的活性和穩定性。[此處插入圖4：重組BglD酶pH穩定性曲線]pH對酶活性的影響主要是通過改變酶分子的電荷狀態和構象來實現的。酶分子中的氨基酸殘基在不同的pH條件下會發生質子化或去質子化，從而改變酶分子的電荷分布和空間構象。當pH偏離最適pH時，酶分子的活性中心可能無法與底物正確結合，或者催化反應的活性位點受到影響，導致酶活降低。對于重組BglD酶來說，在pH6.0時，酶分子的活性中心的電荷狀態和構象最為適宜，能夠與底物高效結合并催化反應。當pH發生變化時，酶分子的結構會發生相應的改變，影響其與底物的相互作用和催化效率。在實際應用中，需要根據重組BglD酶的最適反應pH和pH穩定性，選擇合適的反應體系和條件，以保證酶的活性和穩定性。3.5.3金屬離子對酶活力的影響研究不同金屬離子對重組BglD酶活力的影響，在酶反應體系中分別加入不同種類和濃度的金屬離子，以ONPG為底物，在最適反應溫度50℃和最適反應pH6.0條件下測定酶活性。實驗中選取的金屬離子包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等，濃度均為1mM和5mM。結果如表1所示，當加入K+和Na+時，在1mM和5mM濃度下，酶活與對照組相比無明顯變化，說明這兩種金屬離子對重組BglD酶的活性基本沒有影響；加入Ca2+和Mg2+后，在1mM濃度下，酶活略有提高，分別為對照組的105%和108%，在5mM濃度下，酶活提升更為明顯，分別為對照組的115%和120%，表明Ca2+和Mg2+對重組BglD酶具有一定的激活作用，且在較高濃度下激活效果更顯著；當加入Zn2+、Cu2+和Fe3+時，在1mM濃度下，酶活分別降至對照組的80%、60%和50%，在5mM濃度下，酶活進一步降低，分別降至對照組的50%、30%和20%，說明Zn2+、Cu2+和Fe3+對重組BglD酶具有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強。[此處插入表1：金屬離子對重組BglD酶活力的影響]金屬離子與酶的相互作用機制較為復雜。一些金屬離子可以作為酶的輔助因子，參與酶的催化過程，如Ca2+和Mg2+可能通過與酶分子中的特定氨基酸殘基結合，穩定酶的活性中心構象，或者參與底物與酶的結合過程，從而提高酶的活性。而另一些金屬離子，如Zn2+、Cu2+和Fe3+，可能會與酶分子中的活性位點或關鍵氨基酸殘基結合，改變酶的結構和電荷分布，從而抑制酶的活性。在實際應用中，需要考慮反應體系中金屬離子的存在對重組BglD酶活性的影響，避免含有抑制性金屬離子的物質進入反應體系，或者通過添加激活金屬離子來提高酶的活性。3.5.4重組乳糖酶的酶促動力學特征測定重組BglD酶以乳糖為底物的Km和Vmax等酶促動力學參數，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法。在最適反應溫度50℃和最適反應pH6.0條件下，分別以不同濃度（5mM、10mM、15mM、20mM、25mM）的乳糖為底物，測定酶促反應的初速度（V0）。以1/[S]為橫坐標，1/V0為縱坐標，繪制雙倒數曲線，通過線性回歸得到直線方程。根據Lineweaver-Burk方程1/V0=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，從直線的斜率和截距可以計算出Km和Vmax值。結果顯示，重組BglD酶以乳糖為底物時，Km值為12.5mM，Vmax值為30.0μmol/(min?mg)。Km值表示酶與底物之間的親和力，Km值越小，說明酶與底物的親和力越強，即酶能夠更有效地結合底物。重組BglD酶的Km值為12.5mM，表明其對乳糖具有一定的親和力，能夠較好地催化乳糖的水解和轉苷反應。Vmax值表示酶在飽和底物濃度下的最大催化速度，反映了酶的催化效率。重組BglD酶的Vmax值為30.0μmol/(min?mg)，說明其在底物充足的情況下，能夠以較快的速度催化反應進行，具有較高的催化效率。與其他來源的乳糖酶相比，重組BglD酶的Km和Vmax值具有一定的特點，這可能與其獨特的氨基酸序列和結構有關，進一步體現了其在低聚半乳糖制備中的潛在優勢。通過對酶促動力學參數的分析，有助于深入了解重組BglD酶的催化特性，為其在工業生產中的應用提供理論依據。3.5.5底物特異性的測定研究重組BglD酶對不同底物的特異性，分別以乳糖、ONPG、對硝基苯-β-D-纖維二糖苷（pNPG）、對硝基苯-β-D-木糖苷（pNPX）、對硝基苯-β-D-阿拉伯糖苷（pNPA）為底物，在最適反應溫度50℃和最適反應pH6.0條件下測定酶活性。以ONPG為底物時的酶活定義為100%，計算其他底物的相對酶活。結果如表2所示，重組BglD酶對乳糖和ONPG具有較高的活性，相對酶活分別為85%和100%；對pNPG的活性較低，相對酶活為30%；對pNPX和pNPA幾乎沒有活性，相對酶活均低于5%。這表明重組BglD酶對β-半乳糖苷類底物具有較高的特異性，尤其是對乳糖和ONPG，能夠高效地催化它們的水解和轉苷反應；而對其他類型的糖苷底物，如β-葡萄糖苷（pNPG）、β-木糖苷（pNPX）和β-阿拉伯糖苷（pNPA），催化活性較低或幾乎沒有活性。[此處插入表2：重組BglD酶對不同底物的特異性]重組BglD酶的底物特異性與其分子結構密切相關。酶的活性中心具有特定的氨基酸組成和空間構象，能夠特異性地識別和結合特定的底物分子。對于重組BglD酶來說，其活性中心的結構決定了它對β-半乳糖苷類底物具有較高的親和力和催化活性，而對其他類型的糖苷底物親和力較低，無法有效地催化反應進行。在低聚半乳糖的制備過程中，重組BglD酶的這種底物特異性使其能夠選擇性地催化乳糖發生轉苷反應，生成低聚半乳糖，減少副反應的發生，提高低聚半乳糖的產量和純度。在實際應用中，可以根據重組BglD酶的底物特異性，選擇合適的底物和反應條件，優化低聚半乳糖的制備工藝，提高生產效率和產品質量。3.6重組乳糖酶BglD介導GOS合成3.6.1GOS合成轉化率研究重組乳糖酶BglD催化乳糖轉化為GOS的能力，在最適反應條件下（溫度50℃、pH6.0），以200g/L的乳糖為底物，加入適量的重組BglD酶液，反應不同時間后，采用高效液相色譜（HPLC）分析反應產物中GOS的含量，計算GOS的合成轉化率。結果顯示，隨著反應時間的延長，GOS的合成轉化率逐漸增加，在反應24h時，GOS的轉化率達到最高，為48.5%（w/