第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具第3章基因工程【本節(jié)聚焦】1、重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具是什么?它們的作用分別是什么?2、基因工程載體需要具備什么條件?

我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國，但棉花種植中易受蟲害，其中以棉鈴蟲最為主，可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，甚至絕收。抗蟲基因轉(zhuǎn)基因基因工程情境導(dǎo)入雜交育種？同種生物之間進(jìn)行誘變育種？在原有基因上發(fā)生基因突變，產(chǎn)生新基因——等位基因不定向

蘇云金桿菌中存在一種毒蛋白基因（Bt基因），編碼出的毒蛋白能殺死害蟲。蘇云金桿菌思考：如何培育出自身就能抵抗蟲害的棉花呢?

若使用農(nóng)藥不僅會提高生產(chǎn)成本，還會造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染。基因工程基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。基因（DNA）;分子水平;基因重組（廣義上）;創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品;定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙；操作對象結(jié)

果操作水平原

理意

義水母的綠色熒光蛋白基因一、基因工程的理論基礎(chǔ)【問題1】為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？①基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。③生物界共用一套遺傳密碼。一、基因工程的理論基礎(chǔ)【問題2】為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？①DNA分子的基本組成單位相同，都是4種脫氧核苷酸；②空間結(jié)構(gòu)相同，都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。③都遵循堿基互補配對原則DNA平面結(jié)構(gòu)一、基因工程的理論基礎(chǔ)思考：DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。蘇云金桿菌普通棉花(無抗蟲特性)抗蟲基因與載體DNA拼接，再導(dǎo)入提取怎么做？“分子運輸車”抗蟲棉：如何獲得抗蟲棉?需要什么工具?含Bt抗蟲蛋白將體外重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞準(zhǔn)確切割DNA分子“分子縫合針”將DNA片段連接起來通過轉(zhuǎn)基因來轉(zhuǎn)性狀1、病毒入侵真核生物會被免疫系統(tǒng)攻擊，細(xì)菌面對噬菌體時如何自保？噬菌體侵染細(xì)菌的電子顯微鏡圖片細(xì)菌能產(chǎn)生限制性內(nèi)切核酸酶，切割外源DNA,從而達(dá)到保護自身的目的（防御機制）2、如何理解限制性內(nèi)切核酸酶命名的由來？限制外源DNA的擴散“內(nèi)切”表明酶在DNA鏈內(nèi)部切割（而非從末端開始）作用于核酸，限制酶特指切割DNA的酶。二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）3、為什么限制性內(nèi)切核酸酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）（1）來源：主要是原核生物，可人工合成（2）化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)（3）種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）（4）命名：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:____________________________。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的（p72）。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI。練習(xí)：粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）中分離的第一種限制酶即_______；SmaⅠ二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）（5）作用特點：能夠識別

的特定脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的

斷開。雙鏈DNA分子磷酸二酯鍵酶的專一性二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）1’2’3’4’5’

C1’2’3’4’5’

G磷酸二酯鍵TGCCGTAA5'3'5'3'（6）限制酶的識別序列：中軸線四種限制酶識別的特定序列有何特點？①大多數(shù)限制酶的識別序列由

組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。6個核苷酸②都可以找到一條中心軸線；③中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的，稱為回文序列。1.下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）A．GAATTCB．GGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGC．CTGCAGD．CTAAATCGACGTCGATTTAGD二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）（1）實例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端（2）實例2——SmaⅠ限制酶切割

*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端6.切割結(jié)果:二、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對，這樣的切口叫黏性末端。切口處是平整的，這樣的切口叫平末端。BamHⅠ

EcoRⅠ__________________________HindⅢ

BglⅡ_________________________-G-CCTAG-G-CTTAA-A-TTCGA-A-TCTAGorGATCC-G-orAATTC-G-orAGCTT-A-orGATCT-A-1、不同來源DNA用同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？2、不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？相同。可能相同酶具有專一性，識別的序列相同（比如BamHⅠ、BglⅡ）同尾酶：識別的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同1.寫出下列限制酶切割形成的末端序列2.請判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。3可斷開2個磷酸二酯鍵；產(chǎn)生2個游離的磷酸基團；產(chǎn)生2個黏性末端；消耗2分子水。3、請結(jié)合圖示，推斷限制酶切割一次可斷開幾個磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少個游離的磷酸基團？產(chǎn)生幾個黏性末端？消耗幾分子水？T

T

A

AGCT

T

A

ACGA

A

T

TGC限制酶的識別位點沿中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的，稱為回文序列。--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---Bt蛋白基因3’5’5’3’EcoRⅠ識別5'-GAATTC-3'序列，并在G與A之間切割。蘇云金芽孢桿菌DNA片段中的部分基因2.作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。5′3′TACGTACTGAAT5′3′5′3′CGCGCG5′3′CGCGCG切口切口切口CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG將兩個雙鏈DNA片段“連接”起來的酶1.概念：注意：1、DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA!2、DNA連接酶作用沒有特異性。三、DNA連接酶5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′5′5′5′5′T4DNA連接酶T4DNA連接酶和E.coliDNA連接酶E.coliDNA連接酶3.種類：兩種連接酶都可連接互補黏性末端與平末端，但E.coliDNA連接酶連接平末端效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶三、DNA連接酶▲

DNA復(fù)制中DNA聚合酶發(fā)揮作用AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶作用示意圖：旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈DNA復(fù)制、基因工程DNA復(fù)制、基因工程在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶vsDNA聚合酶1.根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵④2、怎樣才能將Bt蛋白基因送入棉花細(xì)胞呢？1、能否直接將游離的Bt蛋白基因送入棉花細(xì)胞？游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。通常是利用載體，將基因送入細(xì)胞。四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體質(zhì)粒、噬菌體:將外源基因送入受體細(xì)胞,在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。1.作用：植物病毒:動物病毒:2.種類：將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞動物病毒噬菌體質(zhì)粒：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我

能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。復(fù)制四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？問題2：要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問題3：我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？條件①：具有一個或多個限制酶切割位點；

條件②：能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；條件③：具有標(biāo)記基因條件④：對受體細(xì)胞無害。【探究】分析歸納載體需要具備的條件供外源基因插入其中便于重組DNA分子的篩選。使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制，以擴增外源基因的數(shù)量四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。不能被酶切破壞便于重組DNA篩選與鑒定DNA復(fù)制的起始位點，并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點（酶切位點）4、最常用的載體——質(zhì)粒：真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過

改造的。人工終止子:轉(zhuǎn)錄的終點，在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用。啟動子:轉(zhuǎn)錄的起點，在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用。四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體5、標(biāo)記基因的篩選原理導(dǎo)入受體細(xì)胞培養(yǎng)加入氨芐青霉素①導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞存活并繁殖②導(dǎo)入普通載體的體細(xì)胞存活并繁殖含有氨芐青霉素抗性基因載體（如質(zhì)粒）重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低目的基因一定成功重組到質(zhì)粒上了嗎？四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體如何提高篩選的準(zhǔn)確性?思考提示：當(dāng)質(zhì)粒(載體)上有兩個標(biāo)記基因時，可將目的基因插入其中一個標(biāo)記基因中，也就是重組質(zhì)粒上含有

標(biāo)記基因，普通質(zhì)粒上含有

標(biāo)記基因。則

的受體細(xì)胞不具有標(biāo)記基因控制的性狀，

的受體細(xì)胞具有兩個標(biāo)記基因控制的性狀，

的受體細(xì)胞只具有一個標(biāo)記基因控制的性狀。這樣可根據(jù)標(biāo)記基因控制的性狀準(zhǔn)確篩選出含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。未導(dǎo)入導(dǎo)入導(dǎo)入一個兩個沒有導(dǎo)入質(zhì)粒導(dǎo)入普通質(zhì)粒導(dǎo)入重組質(zhì)粒四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體抗蟲棉Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌取出轉(zhuǎn)移思考：通過本節(jié)的學(xué)習(xí)，現(xiàn)在你能描述如何使用這三種工具來獲得抗蟲棉嗎？“分子手術(shù)刀”限制酶準(zhǔn)確切割下Bt抗蟲蛋白基因“分子縫合針”“分子運輸車”用DNA連接酶將抗蟲蛋白基因和載體連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞限制酶DNA連接酶載體①能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上②有一個至多個限制酶切割位點③有特殊的標(biāo)記基因④對受體細(xì)胞無害質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）課堂小結(jié)實驗：DNA的粗提取與鑒定1、實驗原理

DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下（沸水浴），DNA被二苯胺試劑染成藍(lán)色初步分離DNA和蛋白質(zhì)溶解DNA鑒定DNADNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菜花和豬肝等。

能否選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞？(1)選材：(2)試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用2、材料用具不能，因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）實驗：DNA的粗提取與鑒定稱取洋蔥，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。破碎細(xì)胞目的：裂解細(xì)胞，釋放DNA過濾在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取上清液。問題1:過濾能否用濾紙代替紗布？

不可以

因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。問題2:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細(xì)胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等。3、實驗步驟實驗：DNA的粗提取與鑒定破碎細(xì)胞過濾DNA析出在上清液中加入體積相等的預(yù)冷的酒精溶液,靜置2~3