mRNABt抗蟲蛋白抗蟲棉①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)④檢測是否具有抗蟲特性以及抗性程度等檢測水平：分子水平個體水平Bt基因結(jié)合Bt基因表達(dá)的過程，推測可以從哪些方面（或水平）進(jìn)行檢測與鑒定？檢測內(nèi)容：分子水平分子水平第2節(jié)

基因工程的基本操作程序（第3課時）轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(1)方法1：PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取DNA根據(jù)目的基因的序列設(shè)計PCR引物PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因電泳（常用）DNA測序技術(shù)；DNA分子雜交技術(shù)等M：marker；1：陽性質(zhì)粒2：原始品系3-9：轉(zhuǎn)Bt品系判斷標(biāo)準(zhǔn)：（一)分子水平檢測1檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體DNA上四目的基因的檢測與鑒定(2)方法2：DNA分子雜交技術(shù)探針目的基因帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補(bǔ)配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶，說明

了。探針是一段DNA片段（通常結(jié)合放射性同位素或熒光蛋白等），探針的序列應(yīng)與目的基因高度互補(bǔ)，避免與其他基因發(fā)生非特異性結(jié)合變性堿基互補(bǔ)配對原則目的基因整合到受體生物染色體DNA上2檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄（mRNA）轉(zhuǎn)基因生物PCR操作電泳檢測是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA提取RNAmRNA作為模板(2)方法2：分子雜交技術(shù)（1)方法1：PCR擴(kuò)增基因探針轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）變性堿基互補(bǔ)配對原則注射小鼠體內(nèi)蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物放射性檢測

（雜交帶）3檢測目的基因是否翻譯（蛋白質(zhì)）(1)方法：

抗原—抗體雜交抗原與抗體的特異性結(jié)合（2)原理：通過抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)鑒定生物是否具有抗性以及抗性的程度等例：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。如何檢測導(dǎo)入的Bt基因是否具有抗蟲特性？(二)個體水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物（如胰島素）飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能、活性比較功能、活性正常①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——“抗原—抗體雜交技術(shù)”2.個體生物學(xué)水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術(shù)或分

子雜交技術(shù)抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較——檢測是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等如：胰島素注射到糖尿病模型小鼠小結(jié)1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增人工合成構(gòu)建基因文庫2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態(tài)細(xì)胞（如加Ca2+）轉(zhuǎn)化法(微生物);4.目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。總結(jié)

基因工程的基本操作程序(1)PCR利用了

原理，通過調(diào)節(jié)

來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。(2)PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了

的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)。DNA的熱變性溫度DNA半保留復(fù)制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高溫變性中溫低溫復(fù)性延伸1次循環(huán)1實(shí)驗(yàn)原理探究

實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（一)利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增①PCR儀②微量離心管③微量移液器④一次性吸液槍頭2材料用具——自動控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增——實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所PCR儀微量離心管推動桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時，需要更換槍頭）10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（1pg～1μg）5～10μL總體積50μL⑤PCR反應(yīng)體系的配方注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活(P85)(1)加樣：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方，在微量離心管中依次加入各組分。(2)離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。——提高反應(yīng)速率3方法步驟(3)反應(yīng)：參照右表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，10min使DNA充分變性，雙鏈打開，以利于引物更好地和模板結(jié)合。問題1：預(yù)變性的目的是什么？問題2：為什么最后1次變性和延伸時間都延長了？Taq酶活性會隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降。在每一輪循環(huán)中，部分片段可能沒有完全延伸完，Taq酶就脫落了。最后1次變性、延伸時間延長，讓這些DNA打開，重新充分延伸。問題1：PCR的產(chǎn)物是什么？問題2：如何鑒定PCR的產(chǎn)物？DNA片段瓊脂糖凝膠電泳（二)利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物（1）電泳：DNA分子具有_______________，在一定的_______下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷________的電極移動，這個過程就是電泳。可解離的基團(tuán)pH相反1實(shí)驗(yàn)原理一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶

，在電場中DNA便向

泳動。負(fù)電荷正極磷酸電離形成的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電樣品點(diǎn)樣孔應(yīng)靠近

極。負(fù)（2)鑒定方法：①PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。瓊脂糖為一種多糖，90℃以上溶解，溫度下降到35-40℃時形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（孔徑），孔徑大小與瓊脂糖凝膠濃度有關(guān)，濃度越高，孔徑越

，能夠通過的核酸分子越

。瓊脂糖凝膠電泳②在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________、_________________和______等有關(guān)凝膠的濃度DNA分子的大小構(gòu)象小小瓊脂糖凝膠濃度越大，分離的DNA分子越小，遷移速率越快③DNA染色:凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長300nm的紫外燈下被檢測出來常用的核酸染色劑有EB（溴化乙錠）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）DNAMarker是

的片段，在實(shí)驗(yàn)時和樣本DNA同時進(jìn)行凝膠電泳，通過對比兩者的遷移速率，可以大致估計

。樣本DNA的大小已知的DNA分子大小瓊脂糖凝膠電泳裝置2材料用具電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液核酸染料制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。①熔化：②倒模:③凝固:3方法步驟制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（marker）。接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待

前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳①加液②加樣③電泳指示劑①有顏色，使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣。②分子量較小，指示樣品遷移的速率及方向。制備凝膠觀察鑒定進(jìn)行電泳取出凝膠置于

下觀察和照相。紫外燈一條條帶（目的基因片段）1.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是幾條條帶？2.如圖所示，該片段大小約為

。

750bp思考·討論0次12次12次30次30次Marker

根據(jù)條帶的

及

來評價擴(kuò)增的結(jié)果3.判斷成功擴(kuò)增出DNA片段的依據(jù)是什么？分布粗細(xì)程度估計DNA的大小估計DNA的數(shù)量4.如果電泳鑒定的結(jié)果沒有條帶或不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因？未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶可能的原因有：①引物出現(xiàn)質(zhì)量問題；②變性時溫度

，變性時間

，模板DNA鏈未打開。③Taq酶失活；④Mg2+濃度過

。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶可能的原因有：①引物特異性不強(qiáng)或容易聚合成二聚體②復(fù)性時的溫度過低，引物隨機(jī)連接到非目的基因片段③DNA聚合酶的濃度過高，即使引物與模板的結(jié)合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反應(yīng)，生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。④Mg2+濃度過高⑤模板DNA出現(xiàn)污染低低短注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行

處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在

儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上

。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須

。4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好

。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。高壓滅菌-20℃緩慢融化更換一次性手套1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（）√××一、概念檢測練習(xí)與應(yīng)用2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復(fù)性過程中引物與模板鏈的結(jié)合遵循堿基互補(bǔ)配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D脫氧核苷酸二、拓展應(yīng)用1.研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個問題作出解釋。外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入；插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。例如，科研人員在對轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。2.八氫番茄紅素合酶（其基因用psy表示）和胡蘿卜素脫飽和酶（其基因用crtl表示）參與β-胡蘿卜素的合成。pmi為磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因，它編碼的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基上生長