第三章第2節(jié)基因工程的基本操作程序復習回顧限制酶DNA連接酶載體基因工程的基本工具磷酸二酯鍵特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作為載體的條件種類：①有一個至多個限制酶切割位點；②有特殊的標記基因；③能自我復制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、病毒任務(wù)一：說出基因工程的操作水平、操作對象。操作水平：分子水平操作對象：

基因（DNA）結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例回答以下問題：（1）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因是：（2）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的受體細胞是：抗蟲基因—蘇云金桿菌的Bt基因棉花植株細胞1.目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。（P76第2段）主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因。第2節(jié)

基因工程的基本操作程序結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例回答以下問題：（3）結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉案例概括“基因工程的操作程序”：抗蟲棉

（有抗蟲特性）

普通棉花（無抗蟲特性）棉花細胞導入與載體(質(zhì)粒)拼接重組DNA分子一、目的基因的篩選與獲取二、基因表達載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細胞四、目的基因的檢測與鑒定獲得抗蟲基因Bt基因（核心）第2節(jié)

基因工程的基本操作程序二2、目的基因的篩選：

思考1：自然界中抗蟲基因種類多如：Bt基因、蛋白酶抑制基因、凝集素基因等，如何選擇合適的基因？（1）從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選掌握了Bt基因的序列信息用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑，廣泛用于防治棉花蟲害已有多年歷史。Bt基因的表達產(chǎn)物--Bt抗蟲蛋白破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)。(P77相關(guān)信息欄）蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因第一步、目的基因的篩選與獲取DNA測序儀

明確了目的基因后，該怎么獲得它?序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）核苷酸序列比對氨基酸序列比對序列比對工具（如BLAST）(2)認識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：2、目的基因的篩選：二測序技術(shù)測定核酸和蛋白質(zhì)序列第一步、目的基因的篩選與獲取(1).通過化學方法直接人工合成目的基因獲取目的基因的方法DNA合成儀要求：①基因比較小

②核苷酸序列已知的基因(2).通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因基因文庫種類：①基因組文庫（包含一種生物的所有基因）

②部分基因文庫（只包含一種生物的部分基因，如cDNA文庫）第一步、目的基因的篩選與獲取拓展：基因文庫的構(gòu)建過程某生物體全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與載體連接、導入受體菌群體cDNA某生物體發(fā)育的某個時期的mRNA逆轉(zhuǎn)錄與載體連接、導入基因組文庫cDNA文庫第一步、目的基因的篩選與獲取PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)（3）利用PCR獲取和擴增目的基因3、目的基因的獲取PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學獎。

根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。二第一步、目的基因的篩選與獲取【重溫】DNA體內(nèi)復制的過程及條件合成子鏈解旋形成新DNA條件在DNA復制中的作用DNA模板鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸任務(wù)二：說出“DNA體內(nèi)復制”需要滿足的條件:二任務(wù)三：思考與探究—引物：1.為什么需要設(shè)計引物？引物設(shè)計時是否需要知道整個目的基因的堿基序列？2.要保證DNA的兩條鏈同時被擴增，至少現(xiàn)需要幾種引物？3.由于DNA的兩條鏈是反向平行的，新鏈合成的方向是5’端向3’端延伸，引物的結(jié)合位置是（）3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2①④③②②③DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈2種用于PCR的引物通常長度為20~30個核苷酸的DNA單鏈。體內(nèi)的DNA復制通常以RNA單鏈為引物。P77“相關(guān)信息欄”第一步、目的基因的篩選與獲取只需要知道目的基因兩側(cè)的核苷酸序列即可任務(wù)三：思考與探究：4.請你為Bt基因設(shè)計合適的引物。Bt基因CT???GGT-5’引物1引物25'-TCC???AA①②①②二第一步、目的基因的篩選與獲取小結(jié)：1.結(jié)合體內(nèi)DNA復制過程，思考PCR的進行需要哪些條件？體內(nèi)DNA復制在DNA復制中的作用PCR中參與的組分和條件打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸4種脫氧核苷酸引物（通常為小的單鏈RNA）DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)引物（通常為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如能量、緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備DNA聚合酶DNA模板鏈解旋酶二用高溫代替（90℃變性）耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）第一步、目的基因的篩選與獲取利用PCR獲取和擴增目的基因：過程模板DNA變性

復性延伸

方法：利用PCR獲取和擴增目的基因5’5’3’3’95℃3.目的基因的獲取【任務(wù)一】2.閱讀課本77頁第4-6段和表3-1及第二個相關(guān)信息，閱讀78和79頁，明確目的基因獲取的方法，并對這種方法的概念、條件和過程進行詳細分析第一步、目的基因的篩選與獲取過程95℃變性：加熱至超過90℃，雙鏈DNA間的氫鍵斷裂，解旋為單鏈。—利用PCR獲取和擴增目的基因5’3’5’3’使用耐高溫的Taq酶保證高溫條件下仍具有活性。一、目的基因的篩選與獲取3.目的基因的獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取50℃引物1引物2DNA引物復性：冷卻至50℃左右，兩條引物與單鏈DNA結(jié)合過程5’3’5’3’引物結(jié)合在模板DNA鏈的3’端，新合成的子鏈方向為5’到3’。3.目的基因的獲取—利用PCR獲取和擴增目的基因一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取過程引物1引物272℃Taq酶Taq酶3.延伸：加熱至72℃左右，以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈。5’3’5’3’3’5’5’3’—利用PCR獲取和擴增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取第1輪結(jié)束第2輪開始第一輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的2倍。過程5’3’5’3’3’5’3’5’—利用PCR獲取和擴增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸第一步、目的基因的篩選與獲取過程95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq—利用PCR獲取和擴增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取過程95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq—利用PCR獲取和擴增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取第2輪結(jié)束第二輪結(jié)束：此時目的基因的量是原始的22倍。過程—利用PCR獲取和擴增目的基因3.目的基因的獲取一、目的基因的篩選與獲取變性

復性延伸

第一步、目的基因的篩選與獲取TaqDNA聚合酶引物1原料模板DNA目的基因3＇5＇5＇3＇引物2955072℃PCR過程(三輪擴增)第一步、目的基因的篩選與獲取955072℃3＇5＇5＇3＇第一輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第一輪:低溫復性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第一輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:低溫復性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第二輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:高溫變性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:低溫復性第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取3＇5＇5＇3＇955072℃第三輪:中溫延伸第一步、目的基因的篩選與獲取獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細胞嗎？就算可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解不能原因那怎樣才能讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代呢？閱讀教材P80，思考以下問題：1.基因表達載體的構(gòu)建的目的？載體還需要哪些結(jié)構(gòu)？各個元件有什么作用？2.用文字和箭頭表示基因表達載體的構(gòu)建過程。3.目的基因插入什么位置？目的基因插入位點是隨意的嗎？4.使用一種DNA限制酶進行切割，是否只會得到一種重組DNA？如果不能，怎么改進？基因工程的核心第二步：基因表達載體的構(gòu)建第二步：基因表達載體的構(gòu)建1.目的：2.基因表達載體的構(gòu)建（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。第二步：基因表達載體的構(gòu)建2.基因表達載體的構(gòu)建目的基因：能控制表達所需要的特殊性狀啟動子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復制原點：DNA復制的起始位點終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。（啟動子=起始密碼?）第二步：基因表達載體的構(gòu)建啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰的堿基mRNA上三個相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）目的基因應(yīng)該插入什么位置？目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。第二步：基因表達載體的構(gòu)建啟動子和終止子之間的部位誘導型啟動子誘導物作用激活或抑制目的基因表達誘導型啟動子：載體≠表達載體。都有標記基因和復制原點，表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子。第二步：基因表達載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過程質(zhì)粒限制酶限制酶切割位點首先，用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個切口；01第二步：基因表達載體的構(gòu)建限制酶限制酶切割位點獲取目的基因目的基因然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段023.構(gòu)建的過程第二步：基因表達載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過程DNA連接酶重組DNA分子獲取目的基因質(zhì)粒利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子。03目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。第二步：基因表達載體的構(gòu)建3.構(gòu)建的過程質(zhì)粒限制酶限制酶DNA連接酶同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割重組DNA分子限制酶切割位點目的基因限制酶切割位點獲取目的基因使用一種DNA限制酶進行切割，會得到幾種重組DNA？有何缺點？怎么改進？第二步：基因表達載體的構(gòu)建使用一種DNA限制酶進行切割（單酶切），是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接111111111111選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割（雙酶切），防止目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。第二步：基因表達載體的構(gòu)建①不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。②保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，從而達到比1個標記基因更高的篩選成功率，防止只有1個標記基因時出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選)。限制酶的選擇原則第二步：基因表達載體的構(gòu)建限制酶的選擇原則(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。③善用“雙酶切”，注意方向性：其優(yōu)點和作用是：①防止目的基因環(huán)化；

②避免目的基因與載體反向連接，即DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常轉(zhuǎn)錄、表達。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。即時練習1.請結(jié)合下圖，回答問題：（1）構(gòu)建基因表達載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。即時練習（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達載體？如果能有何弊端？能①質(zhì)粒、目的基因發(fā)生自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因會發(fā)生反向連接。1.請結(jié)合下圖，回答問題：即時練習1.請結(jié)合下圖，回答問題：（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。即時練習1.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D.導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長√2.(2023·新課標，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接

B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接質(zhì)粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接。C酶3切割后得到的是平末端，常用T4DNA連接酶連接。質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此方案最合理且高效。若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選。即時練習3.(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（

）

A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用ScaⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落

D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同。若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因。SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因(TetR)中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落。若用ScaⅠ酶切，重組質(zhì)粒中不含氨芐青霉素抗性基因（Amp），但含有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落。即時練習目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)__________和_____的過程受體細胞維持穩(wěn)定表達（二）將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2+轉(zhuǎn)化法（我國科學家獨創(chuàng)）（一）轉(zhuǎn)化的概念（常用）（單子葉植物常用）第三步、將目的基因?qū)胧荏w細胞【任務(wù)三】1.閱讀課本80頁第4段和81頁，明確轉(zhuǎn)化的概念是什么？將目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞的方法有哪些？1.操作方法②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。2.實例我國“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”3.優(yōu)缺點簡便經(jīng)濟（優(yōu)點）要求花朵較大（缺點）花粉管通道法【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實例和優(yōu)缺點；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理第三步、將目的基因?qū)胧荏w細胞

能在自然條件下感染_______植物和_______植物，對大多數(shù)單子葉植物______________。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種__________植物也取得了成功。雙子葉裸子沒有感染能力單子葉2.轉(zhuǎn)化原理農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有________，當它侵染植物細胞時，Ti質(zhì)粒的_______可轉(zhuǎn)移至被侵染的細胞，并整合到該細胞的_____________。Ti質(zhì)粒T-DNA染色體DNA上[思考]構(gòu)建基因表達載體時，目的基因該插到Ti質(zhì)粒哪里？T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實例和優(yōu)缺點；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理。1.農(nóng)桿菌的特點：3.轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導入①兩次拼接第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。②兩次導入第一次導入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導入農(nóng)桿菌。第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞第三步、將目的基因?qū)胧荏w細胞將含目的基因的表達載體提純科學家用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)，如腺病毒載體等。【補充】病毒侵染法受精卵顯微注射含目的基因的受精卵具有新性狀的動物雌性動物輸卵管或子宮胚胎移植早期胚胎顯微注射法三、將目的基因?qū)胧荏w細胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實例和優(yōu)缺點；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理。Ca2+處理大腸桿菌細胞

感受態(tài)細胞

細胞吸收DNA分子基因表達載體與感受態(tài)細胞混合使細胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的生理狀態(tài)。【注意】原核生物作為受體細胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。（因為沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白質(zhì)進一步加工。）Ca2+轉(zhuǎn)化法三、將目的基因?qū)胧荏w細胞【任務(wù)三】2.試分析花粉管通道法的操作方法、實例和優(yōu)缺點；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的特點、轉(zhuǎn)化原理和轉(zhuǎn)化過程以及顯微注射法和Ca2+轉(zhuǎn)化法的原理。【小結(jié)】將目的基因?qū)胧荏w細胞核心方法比較種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法

受體細胞

轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞或受精卵受精卵原核細胞目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞→重組的基因表達載體導入細胞中第三步、將目的基因?qū)胧荏w細胞Bt基因mRNABt抗蟲蛋白害蟲死亡抗蟲棉只有一部分Bt基因能成功導入棉花細胞并表達Bt抗蟲蛋白,這需要檢測和鑒定才能知道,如何進行檢測和鑒定呢?請你回顧基因表達的過程,推測可以從哪些方面進行檢測與鑒定。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的最終目的就是要賦予棉花抗蟲特性,怎樣檢測棉花是否具有抗蟲特性呢?思考討論閱讀課本P82，思考如下問題：四、目的基因的檢測與鑒定(1)檢測目的基因是否導入如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因——通過PCR等技術(shù)檢測提取DNAPCR操作是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；電泳操作1.分子水平的檢測害蟲死亡抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA——通過PCR等技術(shù)檢測BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄1.分子水平的檢測提取mRNAPCR操作是否擴增出目的基因?qū)U增產(chǎn)物進行檢測害蟲死亡抗蟲棉逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA(3)檢測目的基因是否翻譯如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白——通過抗原-抗體雜交檢測蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交1.分子水平的檢測轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常抗性鑒定、活性鑒定等2.個體水平的鑒定目的基因的檢測與鑒定歸納類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.實驗原理（1）利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠______________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷____次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動調(diào)控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了_____________的原理。DNA半保留復制DNA片段的擴增及電泳鑒定DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些_______________會向著__________________的電極移動，這個過程就是________。可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過____________________來鑒定。③在凝膠中DNA分子的遷移速率與_________________、________________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的________下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象DNA片段的擴增及電泳鑒定2.材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）DNA片段的擴增及電泳鑒定PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置推動桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時，需要更換槍頭）DNA片段的擴增及電泳鑒定2.材料用具10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復融化導致活性降低甚至失活。DNA片段的擴增及電泳鑒定3.PCR實驗操作過程使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。3.方法步驟（1）DNA片段的擴增①移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進行反應(yīng)。預變性：DNA片段的擴增及電泳鑒定可根據(jù)目的片段長度適當調(diào)整延伸時間循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在