ICS07.080

CCSC04

團體標準

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人自然殺傷細胞制劑制備及放行檢驗規范

Specificationforpreparationandreleaseinspectionofhumannaturalkillercell

preparations

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

中國國際經濟技術合作促進會發布

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人自然殺傷細胞制劑制備及放行檢驗規范

1范圍

本文件規定了人自然殺傷細胞的術語和定義、基本要求、制備過程、記錄、放行檢驗以及質量評價。

本文件適用于人自然殺傷細胞的制備與放行檢驗。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環境空氣質量標準

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T37864生物樣本庫質量和能力通用要求

GB50073潔凈廠房設計規范

GB50346生物安全實驗室建筑技術規范

GB50591潔凈室施工及驗收規范

3術語和定義、縮略語

術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1.1

人自然殺傷細胞humannaturalkillercells

人體組織分離的或干細胞分化或轉分化獲得的，具有非特異性殺傷、抗體依賴性細胞毒性、免疫調

節功能的固有淋巴細胞。

3.1.2

供者donor

提供用于細胞產品生產用細胞的個體。

3.1.3

樣本specimen

在特定時間從受試者或捐獻者中采集的器官、組織等標本。

3.1.4

細胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細胞占全部細胞的百分比。

3.1.5

臺盼藍trypanblue

細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性，檢測細胞是否存活。

注：活細胞因細胞膜結構完整會排斥臺盼藍，而喪失活性或者細胞膜結構不完整的細胞則會被臺盼藍染成淡藍色。

3.1.6

放行檢驗releasetesting

在細胞已完成質量檢驗的基礎上，對每種類型的每批次細胞，在凍存入庫及出庫前所進行的相對快

速和簡化的檢驗。

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縮略語

下列縮略語適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

HTLV：人類嗜T細胞病毒(HumanThymicLeukemiaVirus)

EBV：人類皰疹病毒（Epstein-barrVirus）

CMV：巨細胞病毒（cytomegalovirus）

4基本要求

場地與設施

4.1.1人自然殺傷細胞制備機構場地應符合《藥品生產質量管理規范》要求，空氣質量標準應符合GB

3095標準分級二級標準。

4.1.2人自然殺傷細胞制備機構實驗室或廠房應由具有潔凈實驗室設計建設資質的工程公司設計與建

造，并應符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規定。建設完成后，各功能區域的潔凈級

別應由專業機構進行檢測并出具合格證明。

4.1.3細胞制備功能區應按人自然殺傷細胞制備工藝進行各區域設計，符合《藥品生產質量管理規范》

和《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》要求。制備機構應配備獨立質量檢測實驗室，并符合

GB19489和GB50346的規定。

設備和耗材

4.2.1人自然殺傷細胞的制備機構應優先選用符合《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控

制及臨床前研究指導原則》的要求，并獲得國家資質認證的設備、儀器、耗材和試劑。

4.2.2人自然殺傷細胞的制備機構應對設備、儀器、耗材和試劑供應商進行資質審核認證，要求供應

商提供產品質量報告和批次檢驗報告，并對耗材及試劑進行質量抽檢，避免采購質量不合格的產品。

4.2.3人自然殺傷細胞的制備機構設備和儀器正式使用前應做安裝確認(IQ)、運行確認（OQ）和性能

確認(PQ)，并定期進行第三方校準，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細胞制品。

4.2.4人自然殺傷細胞的制備機構應對設備與儀器進行編號建檔，并建立標準操作流程(SOP)，確保使

用、運行、保養、維修記錄完整可追溯，對于關鍵工藝相關設備參數應進行實時監測，及時對狀態異常

的設備進行校對和維修。

人員管理

4.3.1人自然殺傷細胞制備機構應分別設立細胞制備負責人、質量管理負責人和質量授權人崗位。由

法人授權任命，任職資質應符合《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導

原則》要求，定期接受崗位專業培訓，制備技術負責人與質量管理負責人、質量授權人不得相互兼任。

4.3.2人自然殺傷細胞制備和質控技術人員應具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗體檢

測應為陰性，并且(矯正)視力正常，無色盲、色弱。

4.3.3人自然殺傷細胞制備和質控技術人員應半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發熱等疾病狀態下

不得進入潔凈操作區，需完全康復后方可恢復崗位操作。

4.3.4人自然殺傷細胞制備和質控技術人員上崗前應經過專業培訓，內容包括但不限于干細胞理論與

實踐、生命倫理、干細胞法律法規、GMP管理、GCP資質、制劑基本知識、細胞培養基礎、生物安全、

儀器設備使用與維護方法、物料管理與清潔衛生、崗位職責、操作規范等內容。

5制備過程

樣本采集

5.1.1基本原則

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5.1.1.1樣本采集與處理應符合GB/T37864的要求。

5.1.1.2采集和處理程序可供樣本采集人員使用。

5.1.1.3應具備相關的資質和設施環境。

5.1.1.4應通過倫理審查批準并履行知情同意程序。

5.1.1.5應建立適當的質量管理體系確保符合用戶需求并持續改進。

5.1.2供者健康

5.1.2.1樣本采集制備方應對供者的基本信息與健康信息進行詳細采集與記錄，同時做好對供者的隱

私保護，相關記錄入檔保留至少30年。

5.1.2.2供者應無血液系統疾病、內分泌系統疾病、惡性腫瘤史、性傳播疾病及高危人群史、吸毒史，

不應具有包括但不限于以下疾病或健康狀況：

a)一般傳染性疾病或其他遺傳疾病：HIV、HBV、HCV、梅毒、HTLV、EBV與CMV抗體與核酸檢測

應為陰性；

b)傳染性皮膚病(未治愈的)；

c)大面積皮膚損傷(未治愈的)；

d)鼻/咽喉傳染病(未治愈的)。

e)采集前12個小時內用過酒精，鎮靜藥等。

5.1.3采集場所及人員

采集場所應達到Ⅲ級潔凈手術室要求。采集人員應具有醫師職業證，且經過相應的技術培訓。

5.1.4采集過程

由醫師抽取人自然殺傷細胞組織，置于無菌采集瓶中，密封保存，并粘貼條形碼作為唯一標識。

樣本運輸

5.2.1運輸人員應是經過專業培訓合格的人員，對樣本運輸應制定規范及應急預案，并對樣本運輸全

程做記錄，包括但不限于運輸的方式、條件、路徑、時間、人員、地址及樣本信息，相關記錄入檔保留

至少30年。

5.2.2樣本運輸應采用平穩、安全、快速的運輸途徑，宜采用冷藏運輸車或專用標本冷藏運輸箱運輸。

5.2.3運輸過程中應防滲漏、防輻射、抗震動、耐壓、耐熱等，樣本包裝應貼上條形碼作為唯一標識。

5.2.4樣本運輸溫度應維持在2℃～8℃，運輸時間不超過12小時。

樣本接收

5.3.1樣本接收人員應是經過專業培訓合格的人，應遵從安全與準確的原則對樣本接收制定規范及應

急預案，并對樣本接收過程進行記錄，相關記錄入檔保留至少30年。

5.3.2樣本接收時，接收人員應做好自我防護工作，接觸樣本之前應佩戴手套與口罩，并對接收場所

進行消毒。

5.3.3接收樣本后應先觀察樣本容器外包裝的外觀，檢查有無破損。

5.3.4檢查外觀后，工作人員應檢查樣本采集信息記錄表是否齊全，同時確認記錄表上信息是否填寫

完整，檢查信息記錄表信息是否與樣本信息一一對應，樣本及記錄表上應貼有一致對應的條形碼，做到

樣本與供者信息相對應，確認無誤后進行接收。

5.3.5樣本接收后，使用75%醫用酒精消毒清理容器外表面，如不能及時對樣本進行處理，需把樣本

保存在2℃～8℃條件下，最長時間不超過12小時。

5.3.6樣本量應能夠滿足制備和檢測的最低要求。

5.3.7樣本接收后應及時將信息反饋給樣本發送方。

5.3.8細胞制備方應制定樣本拒收標準，按照樣本拒收標準處理樣本，并及時通知有關部門或負責人，

同時做好相應記錄。

分離與培養

5.4.1人自然殺傷細胞分離與培養應符合《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨慶

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前研究指導原則》要求的車間內進行。

5.4.2所有操作應事先制定標準規范，由經專業培訓的技術人員嚴格遵照執行，并進行記錄登記，相

關記錄入檔保留至少30年。

5.4.3分離與培養過程中應標識干細胞的名稱、代次、批次、操作日期、培養條件、操作人員姓名等

信息。

5.4.4所使用試劑應采用符合《藥品生產質量管理規范》、《中華人民共和國藥典》和《干細胞制劑

質量控制及臨床前研究指導原則》要求的藥品輔料或已獲批的藥品，應出具產品質檢合格報告，并對各

批次試劑進行質量抽檢。

5.4.5應避免人源或動物源性血清及蛋白，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動物血清，

應確保其無特定動物源性病毒污染。嚴禁使用海綿體狀腦病流行區來源的牛血清。

細胞換液

5.5.1人自然殺傷細胞換液操作應嚴格遵照《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨

床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染，相關操作均進行記錄并入檔保存至少30年。

5.5.2換液時間及頻次應根據人自然殺傷細胞生長情況及培養基狀態進行判斷，以保障細胞生長所需

營養物質水平，并消除代謝物毒害作用。

5.5.3換液操作時吸棄培養瓶中原有的部分或全部培養液，再加入新鮮培養液。首次換液需要在鏡下

觀察到原代細胞完全貼壁和延展后方可進行。

5.5.4培養基成分應符合人自然殺傷細胞分離與培養基本要求，盡量采用已獲國家批準的臨床級產品

或藥品輔料。

細胞傳代

5.6.1人自然殺傷細胞傳代操作應嚴格遵照《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨

床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染，相關操作均進行記錄并入檔保存至少30年。

5.6.2人自然殺傷細胞一般情況在達到80%～90%融合度可講行傳代操作，傳代操作應密度適宜、及時，

迅速。

5.6.3傳代所使用消化酶應符合人自然殺傷細胞分離與培養的基本要求，盡量采用國家已批準的臨床

級產品。如必須使用動物源性消化酶，應確保其無特定動物源性病毒污染。

細胞凍存

5.7.1人自然殺傷細胞凍存操作應嚴格遵照《藥品生產質量管理規范》和《干細胞制劑質量控制及臨

床前研究指導原則》要求，保證無外源微生物污染，相關操作均進行記錄并入檔保存至少30年。

5.7.2經制備數量達到凍存要求的人自然殺傷細胞系可進行凍存操作，凍存細胞應加入適當的凍存保

護液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進行保存。

5.7.3凍存液成分應符合人自然殺傷細胞分離與培養的基本要求，盡量采用國家已批準的臨床級產品

或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過10%，如必須使用動物源性血清，應確保其無特定動物源性病

毒污染，嚴禁使用海綿狀腦病流行區來源的牛血清。

5.7.4凍存細胞應標明干細胞名稱、培養條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯

一標識。

5.7.5液氮凍存應使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負責，保證液氮充足，溫度恒定。

穩定性考察

5.8.1細胞庫應依據儲存的干細胞產品的特性，制定年度的儲存細胞質量穩定性考察方案和計劃，并

制定穩定性考察的相關質量標準。

5.8.2穩定性考察的相關質量標準包括但不限于以下內容：

a)凍存容器完整性和密閉性；

b)細胞活率；

c)微生物培養；

d)細胞凍存復蘇回收率；

e)細胞表面標記物表達；

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f)細胞生物學效力。

5.8.3人自然殺傷細胞干細胞在凍存后1周復蘇存活率不應低于80%，1年復蘇存活率不應低于60%。

5.8.4常規每年至少執行一次穩定性考察計劃，如遇特殊情況（例如液相液氮罐故障）可臨時性增加

穩定性考察計劃。

5.8.5應對年度性的穩定性考察結果進行趨勢分析，便于監測細胞儲存的連續穩定性并改進細胞儲存

工藝。

6記錄

原始記錄應確保其可追溯細胞分離、處理和儲存操作所有環節，記錄內容包含但不限于以下信息：

a)供者身份號碼；

b)產品描述碼、采集類型和分類碼；

c)產品名稱和組分；

d)供者唯一身份辨識符，如果適用；

e)采集日期和時間；

f)生產制備機構的名稱和地址；

g)制備、保存、凍存中關鍵步驟的細節及結果；

h)關鍵步驟的日期和時間，如果適用；

i)每一步驟的操作人員姓名；

j)在分離、處理、凍存、儲存過程中使用的關鍵物料的名稱、生產商、批號、有效期限；

k)使用試劑的數量；

l)使用設備編碼。

記錄的審核：應對記錄的準確性和完整性以及標準、法律法規的符合性進行審核。

記錄的保存：記錄應歸檔于受控區域進行保存，確保整個保存期間記錄的清晰和完整性，并應避

免意外或非授權的調閱、丟失、損壞、破壞、混淆或篡改。

記錄的修改：機構應建立并保持合適的記錄修改程序。記錄修改人的簽名及日期應記錄下來；修

改前的記錄內容應清晰可辨認。

隱私保護：應建立保密機制，確保供者、員工信息的保密性。

記錄保存期限：文件記錄是要保存至細胞應用或處理后20年。

7放行檢驗

一般要求

每一批次人自然殺傷細胞制劑在臨床使用前應在完成例行質量檢驗的基礎上，由臨床研究機構質

檢平臺進行快速和簡化的質量檢測，應包括但不限于活率、細胞表型、細菌、病毒、支原體和內毒素含

量等，確認細胞合格后方可申請臨床放行使用。相關記錄報告應入檔保存至少30年。

檢驗內容

7.2.1人自然殺傷細胞安全性

7.2.1.1無菌檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1101無菌檢測法執行，對人自然殺傷細胞樣本采集、

運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液等）

檢測。細菌和真菌檢測結果都應為陰性。

7.2.1.2支原體檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3301支原體檢測法執行，對人自然殺傷細胞樣本采

集、運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液

等）檢測。支原體檢測結果都應為陰性。

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7.2.1.3細胞內外源致病因子檢測

采用血清ELISA檢測法或核酸檢測法，對人自然殺傷細胞樣本采集、運輸、分離、培養、凍存、復

蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍存液、細胞等）檢測。HIV抗體、HBsAg、

HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測應為陰性；HCV、HBV、HIV病

毒核酸檢測應為陰性。

7.2.1.4內毒素檢測

參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1143細菌內毒素檢測法執行，對人自然殺傷細胞樣

本采集、運輸、分離、培養、凍存、復蘇等生產制備環節進行留樣（保存液、清洗液、培養基上清、凍

存液等）檢測。各類樣本中的內毒素檢測值應≤0.5EU/mL。

7.2.1.5異常免疫學反應檢測

采用流式細胞術以及ELISA技術測定人自然殺傷細胞對于活化的人總淋巴細胞的增殖和對不同淋

巴細胞亞群增殖能力的影響，以及對淋巴細胞相關細胞因子分泌的影響。淋巴細胞亞群應無異常增殖，

細胞因子表達水平應無異常增加。

7.2.1.6致瘤性檢測

采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠），通過局部或靜脈方式接種人自然殺傷細胞，評價人自然殺傷

細胞致瘤性。體內致瘤試驗嚴格遵照動物倫理要求執行，單只小鼠接種人自然殺傷細胞數量≥106細胞

/kg，觀察期≥12周。人自然殺傷細胞應無致瘤性。

7.2.2人自然殺傷細胞穩定性

7.2.2.1細胞數量和活率檢測

選用血球細胞計數板或細胞計數儀進行細胞計數，將待檢測細胞使用臺盼藍或A0/PI熒光染料染

色，讀取細胞數并計算活率。各代數及批次人自然殺傷細胞活細胞比例≥90%。

7.2.2.2生長活性檢測

通過檢測細胞倍增時間、細胞周期、克隆形成率以及端粒酶活性對人自然殺傷細胞生長活性進行測

定，各代數及批次人自然殺傷細胞應處于指數生長期，GO期細胞數≤10%，具有端粒酶活性。

7.2.2.3細胞純度和均一性檢測

采用人自然殺傷細胞標志物流式檢測以及人基因組DNA短片段重復序列(STR)測序進行檢定。各代

數及批次人自然殺傷細胞表面標志物表達應符合流式檢測比例要求，單一細胞系的人自然殺傷細胞各

代次及批次細胞STR檢測結果應保持一致。

7.2.3人自然殺傷細胞生物學特征

7.2.3.1細胞形態檢測

體外二維懸浮培養條件中，靜息狀態下呈不規則形懸浮生長；激活后形態變大變長，用倒置顯微鏡

進行觀察。

7.2.3.2細胞標志物檢測

采用《中華人民共和國藥典(2020年版)》通則3429中流式細胞術進行測定。

7.2.3.3染色體核型檢測

按照《中華人民共和國藥典(2020年版)》檢驗。

8質量評價

質量評價內容

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8.1.1供者健康篩查結果應符合合格供者要求并簽署了知情同意書。

8.1.2人自然殺傷細胞及檢測標本的采集和運輸符合標準要求。

8.1.3人自然殺傷細胞及檢測標本的接收、標識以及暫存符合標準要求。

8.1.4細胞分離、處理、檢測區域應滿足操作要求，有潔凈要求的操作環境應滿足相應級別環境要求，

應有定期環境監控；細胞分離、處理各工序完畢后均應及時清場；現場應無污染及交叉污染，如有傳染

病原體或污染物，應得到有效隔離或清除。

8.1.5細胞在分離、處理及檢測等過程中所涉及的人員均已通過考核合格后上崗。

8.1.6細胞分離、處理、檢測等所使用的設備應符合設備管理要求（標識清晰正確，在合格計量校驗

期內定期維護保養等）；與細胞接觸的器械應經消毒滅菌并在有效期內。

8.1.7細胞制備、檢測所用物料應經確認來自合格供應商，關鍵物料均應經抽樣檢測并確認其質量合

格。試劑及耗材的有效期應在規定期限內，批號應按照要求記錄下來以便具有可追溯