平板劃線法

接種獲得微生物純培養物（單菌落）的方法：稀釋涂布平板法操作簡單，不可以計數。操作較麻煩，可以計數。1.2.2微生物的選擇培養與計數目標：1.闡明微生物選擇培養的原理。2.進行土壤中分解尿素的細菌的分離和計數。農作物能直接吸收尿素嗎？不能，將有機物尿素分解成無機物氨，才能被植物利用CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3如何才能把尿素細菌從土壤中篩選出來？探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數碳源氮源能。只有產生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生存。選擇培養基：在微生物學中，將允許______________________，同時_________________________生長的培養基。特定種類的微生物生長抑制或阻止其他種類微生物（一）篩選菌株一、研究思路

此配方能否篩選出產生脲酶的細菌？為什么？以尿素為唯一氮源無機鹽

1、PCR技術（體外DNA復制技術）需要耐高溫（930C）的DNA聚合酶。如何篩選出能產生耐高溫的DNA聚合酶的細菌？1973年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發現了耐熱的Taq細菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。舉一反三：如何篩選菌株？美國黃石國家公園的一個熱泉到菌種相應的生存環境中去尋找

2、如何篩選自養型的微生物？

3、如何篩選抗青霉素的微生物？

4、如何篩選能分解石油的微生物？

篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。

通常1g土壤中有幾億到幾百億個土壤微生物，其中，細菌的數量最多，能分解尿素的細菌是其中的一部分。

由于土壤細菌的數量龐大，要想得到特定微生物的純培養物，僅有選擇培養基是不夠的，還需要對土壤進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養基上。稀釋涂布平板法探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數二、實驗流程：土壤取樣探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數制備培養基梯度稀釋涂布平板培養觀察微生物計數（1）土壤取樣:從酸堿度接近中性、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。☆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要

。滅菌二、實驗流程：土壤取樣探究·實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數制備培養基梯度稀釋涂布平板培養觀察微生物計數以尿素為唯一氮源的選擇培養基、制備牛肉膏蛋白胨培養基。（2）制備培養基：作為對照，檢驗選擇培養基是否具有選擇作用。10g1×101mL90mL無菌水移液管（3）梯度稀釋：1mL1×1071×1061×1051×1041×1031×1029mL無菌水1mL1mL1mL1mL稀釋倍數注意：移液管需要經過滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。(5)將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，培養用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。（4）涂布平板：培養基表面的菌液過多會導致菌體堆積，影響分離效果。（4）涂布平板：每個稀釋度下涂布

個選擇培養基和

個蛋白胨培養基，另外，兩種培養基各留1個空白平板做

.細菌：一般選用104

、105

、106倍的稀釋液放線菌：一般選用103

、104

、105倍的稀釋液真菌：一般選用102

、103

、104倍的稀釋液不同微生物在土壤中含量不同，最適稀釋度不同31空白對照目的：獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。在培養皿底作好標記。注明培養基類型組別、培養日期、稀釋度、培養物等。（5）微生物的培養與觀察：細菌：30～370C的溫度下培養1～2d選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。培養不同微生物需要不同的培養溫度及時間在菌落計數時，每隔24h統計一次菌落數目不同微生物會表現出不同的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等，這是區別不同微生物的關鍵。二、實驗流程：土壤取樣制備培養基梯度稀釋涂布平板培養觀察微生物計數稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍稀釋涂布平板法：聚集的微生物單個細胞梯度稀釋菌液單菌落涂布平板生長繁殖（1）計數原理：當樣品的稀釋度足夠___時，培養基表面生長的一個____，來源于樣品稀釋液中的一個____；通過計數平板上的____數，就能推測出樣品中大約含有多少_____；高活菌菌落活菌菌落（6）微生物計數：例2.某同學在三種稀釋度下取0.1mL的菌液涂布平板，統計菌落數，得到了以下的數據，試計算1g樣品的活菌數。平板稀釋度平板1平板2平板310432036035610521223428710621231830～300范圍內，計算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244。1g樣品中活菌數為(244÷0.1)×105＝2.44×108(個)。（2）計數原則①選擇菌落數為_______的平板計數30-300②同一稀釋度下，應至少對__個平板進行重復計數，求出______3平均值樣品的______將直接影響平板上的菌落數目；稀釋度每克樣品中的菌落數＝(平均數÷0.1)×稀釋倍數【例1】用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是（）A.涂布了一個平板，統計的菌落數是230B.涂布了兩個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238C.涂布了三個平板，統計的菌落數分別是21、212和256，取平均值163D.涂布了三個平板，統計的菌落數分別是210、240和250，取平均值233D第一組結果誤差過大，不應用于計算平均值（操作有誤，需要重新實驗）。沒有重復實驗（至少涂布3個平板）。例2：下圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析，每克土壤中的菌株數約為多少？約為(170÷0.1)×106個。每克樣品中的菌落數＝(平均數÷0.1)×稀釋倍數=1.70×109個。2、顯微鏡直接計數：利用細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。誤差：計總數（6）微生物計數：1、

稀釋涂布平板法（間接計數）計活菌數統計的菌落數往往比活菌數目低（原因？）因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。誤差：計數結果偏大（不能區分死菌與活菌）(1)土樣不同(2)培養基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)你能說出結果差異大的兩個可能的因素嗎？在做分解尿素的細菌的篩選與統計菌落數目的實驗時，A同學從對應的106

倍稀釋的培養基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度只選擇出大約50個菌落。分析其原因。?三、結果分析與評價1.培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出菌落

通過對照實驗，若培養物有雜菌污染，空白對照的培養基出現菌落；若培牛肉膏蛋白胨培養基的菌落數遠大于選擇培養基的數目，說明選擇培養基已篩選出一些菌落。2.樣品的稀釋操作是否成功及重復組的結果是否一致如果得到了2個或2個以上菌落數目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數。3.重復組實驗結果是否一致如果學生選取的是同一種土樣，統計的結果應該接近。如果結果相差太遠，則可能操作有誤，需要重做試驗。結果分析四、操作提示（一）無菌操作（二）做好標記平板：皿底注明培養基種類、日期、樣品的稀釋度、微生物種類等試管：按稀釋梯度做好標記。（三）規劃時間〖注意〗在研究未知微生物時務必規范操作，以防被____________感染，實驗后一定要洗手消毒。致病微生物在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→酚紅變紅→脲酶陽性.進一步探究在上述實驗選擇培養基上生長的微生物，一定是尿素分解菌嗎？脲酶陰性脲酶陽性五、對所篩選菌種的鑒定不一定，固氮菌也能在該培養基上生長如何鑒定尿素分解菌鑒定方法【拓展】測定飲水中大腸桿菌數量的方法-濾膜法。是將一定體積的水過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養基上培養，大腸桿菌菌落呈現深紫色有金屬光澤，通過計數得出水樣中大腸桿菌的數量。土壤中分解尿素的細菌的分離與計數課堂小結以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑土壤取樣→稀釋涂布→培養與觀察→計數稀釋涂布平板法使用以尿素為唯一氮源的選擇培養基菌種鑒定分離方法實驗流程菌種篩選二、拓展應用

2.地球上的植物每年產生的纖維素超過70億噸，其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產生纖維素酶。對這些微生物的研究與應用，使人們能夠利用精桿等生產酒精，用纖維索酶處理服裝面料等。已知剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物；而當纖維索被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養基中會出現以這些菌為中心的透明圈(如下圖所示)。請回答下列問題。練習與應用（P20）

纖維素分解菌的篩選方案土壤取樣選擇培養梯度稀釋涂布樣品到鑒別培養基挑選菌落選擇富含__________的環境，目的菌的含量相對較高。纖維素例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。例：人工設置纖維素分解菌生存的適宜環境：濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，一般將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。

纖維素分解菌的篩選土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養基挑選菌落目的：增加纖維素分解菌的濃度該培養基從物理性質上看屬于：選擇機制：以纖維素粉為唯一碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。液體培養基土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養基挑選菌落1.鑒別的方法：2.原理：剛果紅染色法剛果紅+纖維素→紅色復合物纖維素酶纖維二糖或葡萄糖→不產生紅色復合物菌落特征：具有透明圈

纖維素分解菌的篩選4.在篩選纖維素分解菌的培養基中加入剛果紅染料，研究者觀察到幾個有透明圈的菌落。據圖分析正確的是(

)C.圖中菌落可能是細菌也可能是真菌A.透明圈內的剛果紅染料已被分解B.菌落②中的菌株降解纖維素能力最強D.圖中培養基可用牛肉膏、蛋白胨配制小本一、概念檢測

1.研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。（1）這種培養基是一種選擇培養基。（

）（2）利用這種石油降解菌可以降解石油。修復土壤。（

）（3）相對于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（

）√√√練習與應用（P20）一、概念檢測

2.用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數,原因是()A.菌落中的細菌數目是固定的B.平板上的一個菌落就是一個細菌C.通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同D.平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌D練習與應用（P20）二、拓展應用

1.反芻動物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。提示：反芻動物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養基，還應該參照厭氧菌的培養方法進行實驗設計。練習與應用（P20）二、拓展應用（1）現在要從土壤中分離纖堆素分解菌,請你給出詳細的實驗方案。（2）你打算到什么環境中去尋找纖維素分解菌？為什么？（3）有同學說,可以把濾紙埋在土壤中,經過一段時間后,再從已腐爛的濾紙上篩選纖維素分解菌。請你評價這一做法。（1）可以參考本節“探究·實踐”中的設計思路進行設計。

以纖維素為唯一碳源的選擇培養基練習與應用（P20）（2）纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環境中，采集土樣時，可以選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。（3）這是人工設置適合纖維素分解菌生存的環境,腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。1、選擇培養基：允許

種類的微生物生長，同時

或

其他種類微生物生長的培養基。原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括

、

和

），同時

或

其他微生物的生長。用途：培養、、

出目標微生物2、微生物選擇培養獲取純培養物的方法：

3、稀釋涂布平板法計數原理：當樣品的稀釋度足夠___時，培養基表面生長的一個____，來源于__________中的一個____；通過計數平板上的____數，就能推測出樣品中大約含有多少_____

。

計數原則：選擇菌落數為_______的平板計數

統計的菌落數往往比活菌的實際數目____；原因：

__________________________________________

計算公式：

4、顯微鏡直接計數

優點：

缺點：統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和，不能區分

與

。

計算公式：

5、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數實驗原理：絕大多數微生物都能利用

，但是只有能合成

的微生物才能分解

，利用以

作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。1、選擇培養基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養、溫度、和pH），同時抑制或阻止其他微生物的生長。用途：培養、分離、計數出目標微生物2、微生物選擇培養獲取純培養物的方法：稀釋涂布平板法3、稀釋涂布平板法計數原理：當樣品的稀釋度足夠___時，培養基表面生長的一個____，來源于__________中的一個____；通過計數平板上的____數，就能推測出樣品中大約含有多少_____

。

計數原則：選擇菌落數為_______的平板計數

統計的菌落