細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告掃描電子顯微鏡生物樣品制備與觀察姓名：學(xué)號：班級：專業(yè)：同組成員：【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鈷呙桦婄R的基本結(jié)構(gòu)與工作原理了解掃描電鏡的基本使用方法了解臨界點(diǎn)干燥儀的工作原理了解掃描電鏡生物樣品制備的基本過程【實(shí)驗(yàn)原理】掃描電鏡主要用于觀察樣品表面幾何形貌。一般掃描電鏡生物樣品制備過程包括取材、固定、脫水、干燥以及導(dǎo)電處理等步驟。取材時應(yīng)盡量保護(hù)待觀察的樣品表面（如細(xì)胞表面、組織或器官的上皮表面等），并且避免樣品表面在清洗過程中的人為損傷。一般生物樣品需經(jīng)干燥后才能在掃描電鏡下觀察。由于表面張力的作用，含水量大的生物樣品在自然干燥過程中，其表面形貌將發(fā)生嚴(yán)重變形。為了觀察生物樣品真實(shí)的表面形貌，通常采用臨界點(diǎn)干燥法對樣品進(jìn)行干燥處理。當(dāng)氣液兩相處于臨界點(diǎn)時，氣體、液體密度相等，表面張力為零。因此，對生物樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，可以較好地保護(hù)其表面形貌。水的臨界溫度和壓力分別為374.1℃和218.3大氣壓，顯然，此條件下生物樣品將受到嚴(yán)重?fù)p壞。由于CO2的臨界溫度和壓力較低，為31.4℃和72.9大氣壓，故通常選擇CO2作為生物樣品臨界點(diǎn)干燥的工作介質(zhì)。固定、脫水后的樣品需經(jīng)過乙酸異戊酯處理，然后利用臨界點(diǎn)干燥儀對樣品進(jìn)行干燥。由于生物樣品導(dǎo)電性低，未經(jīng)過導(dǎo)電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產(chǎn)生荷電現(xiàn)象，從而影響觀察和照相記錄。為了減少荷電效應(yīng)，對生物樣品表面要進(jìn)行導(dǎo)電處理，通常使用離子濺射儀在樣品表面噴鍍金屬導(dǎo)電薄層。噴鍍的金屬包括：金（Au），鉑（Pt）及其合金等，噴鍍導(dǎo)電薄層厚度在10nm左右為宜。對于花粉粒等含水量較少的生物樣品，可以經(jīng)過自然干燥后在掃描電鏡下觀察。入射電子術(shù)與固體樣品原子之間的相互作用1、入射電子術(shù)與固體樣品原子之間的相互作用。具有一定的能量的電子入射固體厚樣品后收到樣品原子的散射，產(chǎn)生二次電子、背散射電子以及特征x射線等。二次電子是從樣品表面約10nm深度范圍內(nèi)被入射電子激發(fā)的低能電子，其能量約為0~50eV。一部分入射電子在樣品內(nèi)部經(jīng)多次散射后從樣品表面射出，這些電子被稱為背散射電子。樣品中不同元素的原子在受到入射電子電離激發(fā)時可以發(fā)射特征X射線。掃描電鏡主要是利用二次電子像觀察厚樣品表面形貌。在觀察樣品微區(qū)表面形貌的同時，利用X射線顯微分析技術(shù)可以對樣品中的元素進(jìn)行定性和定量分析。圖二百合花粉粒掃描電子顯微鏡像【討論】思考題1、二次電子像的襯度與樣品的何種特征有關(guān)？二次電子的產(chǎn)率η定義為二次電子數(shù)與入射電子數(shù)之間的比值，并且η∝1／cosθ，θ為入射電子束與樣品表面法線之間的夾角。由于樣品表面不是平整的，各點(diǎn)的θ值與η值不同，即樣品表面各點(diǎn)的二次電子信號強(qiáng)度不同。因此二次電子像的襯度反應(yīng)樣品表面幾何形貌。此外，由于入射電子束孔徑角很小，二次電子像還具有景深大，立體感強(qiáng)的特點(diǎn)。2、為什么臨界點(diǎn)干燥可以避免自然干燥對生物樣品表面形貌的損傷？臨界點(diǎn)干燥的原理是：在一定的溫度和壓力下，物質(zhì)的液態(tài)和氣態(tài)界面將會消失，液態(tài)瞬間轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，形成非液非固的狀態(tài)，即達(dá)到臨界點(diǎn)（C.P）狀態(tài)。在臨界點(diǎn)時，表面張力消失，分子間的內(nèi)聚力等于零，而在顯微尺度上，表面張力對生物材料形態(tài)的影響十分強(qiáng)大。表面張力是存在于固-液、液-氣界面上的主要物理力之一。液-氣界面上表面張力的作用是造成生物樣品收縮的主要原因。因此，利用臨界點(diǎn)狀態(tài)對材料進(jìn)行干燥，材料理論上不會產(chǎn)生收縮和形變，對于質(zhì)地較軟的材料這種方法是最好的干燥方法。3、生物樣品在掃描電鏡觀察前為什么要進(jìn)行金屬噴漆處理？由于生物樣品導(dǎo)電性低，未經(jīng)過導(dǎo)電處理的樣品在掃描電鏡下觀察時會產(chǎn)生荷電現(xiàn)象，從而影響觀察和照相記錄。為了減少荷電效應(yīng)，對生物樣品表面要進(jìn)行導(dǎo)電處理，通常使用離子濺射儀在樣品表面噴鍍金屬導(dǎo)