常規體外受精中國專家共識（2024年）前言常規體外受精（conventionalinvitrofertilization，c-IVF）是人類輔助生殖技術（assistedreproductivetechnology，ART）中被廣泛應用的授精方式之一，其主要是針對女性因素（如輸卵管性不孕、子宮內膜異位癥、排卵異常及宮頸因素等）、部分男性因素（如輕、中度少弱畸形精子癥）及不明原因不孕不育（卵巢功能評估、輸卵管通暢度評估及男性精液分析均正常）患者所采取的治療方案。相較于卵胞質內單精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）技術而言，c-IVF的精卵結合方式更接近人類生理狀態，實驗室操作也相對簡單。前言然而在精液參數正常的情況下，c-IVF仍然有20%左右的取卵周期發生受精率低下（lowfertilizationrate，LFR，<25%）及5%~15%的取卵周期發生完全受精失敗（totalfertilizationfailure，TFF）。目前尚缺乏c-IVF的操作標準或共識，尤其對于精液參數處于臨界值的病例，授精方式的選擇多根據臨床醫生和胚胎實驗室人員的經驗并結合患者病史決定，雖然做到了個性化處理，但由于缺乏有力數據的支持，無法避免發生LFR和TFF的風險。部分中心為了避免受精失敗的發生，則會選擇對全部或部分卵母細胞行ICSI技術授精，無形中導致了ICSI技術的過度應用。前言本共識根據國內外發表的文獻，并結合長期實踐經驗，經過專家討論制定而成。通過對c-IVF選擇標準、精液的優化處理、授精操作、授精時機的選擇、短時受精及早期受精判斷、受精失敗的補救措施、受精觀察、其在胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantationgenetictesting，PGT）與無創胚胎染色體篩查（non-invasivechromosomescreening，NICS）的應用、質量控制及胚胎實驗室新員工培訓與考核等多方面進行詳細闡述，并提出相應推薦意見，以期為輔助生殖臨床醫生和胚胎實驗室人員提供實際可行的建議和指導。c-IVF的精液標準《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊（第六版）》（WHO手冊第六版）提出的正常男性精液質量下限參考標準（第五百分位值）：精子總量為39×106、精子濃度為16×106/mL、前向運動精子率為30%、正常形態精子率為4%，但該下限標準對ART治療中是否可以選擇c-IVF缺乏指導意義。因此，仍需制定一個可以選擇c-IVF授精方式的精液質量下限標準。對于少、弱精子癥患者（精子濃度<20×106/mL和/或精子活動率<40%，WHO手冊第四版）授精方式選擇的一項隨機對照試驗研究中，將106個取卵周期的1518枚卵母細胞進行隨機分配，行c-IVF（669枚）或ICSI（849枚），結果表明ICSI組受精率（50%）高于c-IVF組（41%），且c-IVF組發生TFF的風險要明顯高于ICSI組；c-IVF的精液標準另一項隨機對照試驗研究分別對少精子癥組[精子濃度（5~20）×106/mL，WHO手冊第四版]與少弱精子癥組[精子濃度（5~20）×106/mL且前向運動精子10%~32%，WHO手冊第四版]的卵母細胞行c-IVF或ICSI，結果表明兩組不同授精方式間的受精率差異沒有統計學意義。但目前尚缺乏基于最新版WHO手冊少弱精子癥診斷標準的相關研究。鑒于ART治療所使用的精子通常是經密度梯度離心或上游后所獲得的活力較高的精子，因此將處理后的精子參數作為受精結果的預測指標更為合適。c-IVF的精液標準一項回顧性研究顯示，當處理后前向運動精子總數（totalprogressivelymotilespermcellcount，TPMC）<1.1×106時發生TFF的風險>25%。另一項對112個同時行c-IVF和ICSI周期的回顧性研究顯示，ICSI受精而c-IVF未受精周期的處理后活動精子總數[（1.06±0.9）×106]顯著低于c-IVF與ICSI均受精周期的處理后活動精子總數[（4.4±3.4）×106]，表明優化處理后的活動精子總數為較好的預測受精失敗的指標；該研究將處理后活動精子總數<1.5×106作為臨界指標，結果顯示其對c-IVF受精失敗的預測靈敏度為80%。聶玉林等的一項回顧性研究表明，上游后前向運動精子回收率≤5%和TPMC<1.0×106，是影響受精率的高危因素。c-IVF的精液標準針對畸形精子癥的最佳授精方式選擇同樣存在爭議。一項薈萃分析表明：雖然單純畸形精子癥行c-IVF可能影響受精率，但與其行ICSI或與正常精子形態行c-IVF的妊娠結局相比，差異均無統計學意義。近期的一項回顧性研究對畸形精子癥做了進一步區分，結果表明，當96%<精子畸形率≤98%時，c-IVF組與ICSI組的受精率、卵裂率、人絨毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin，hCG）陽性率、臨床妊娠率和活產率差異均無統計學意義；當精子畸形率>98%時，c-IVF組卵裂率、hCG陽性率、臨床妊娠率和活產率顯著低于ICSI組。但對于特殊類型的畸形精子癥，如圓頭精子癥、無頭精子癥、大頭精子癥、精子鞭毛多發形態異常等，采用c-IVF不能實現正常受精。該類精子畸形可能具有遺傳性，需根據精子缺陷類型選擇個體化的ART助孕。c-IVF的精液標準推薦意見1：①對于精子濃度、活力均正常的樣本可以采用短時或過夜c-IVF的方式。②對于精子濃度、活力處于臨界值的樣本，尤其精液優化處理后TPMC<1.5×106，建議采用短時受精結合早期脫顆粒的方式。③當精液優化處理后TPMC<1.0×106，尤其獲卵數較多時，可在簽署知情同意的情況下對部分或全部卵母細胞行ICSI技術以保障正常受精。④目前尚無有力證據表明單純畸形精子癥對c-IVF的受精率及妊娠結局產生不利影響，但對于特殊類型的畸形精子癥患者（如圓頭精子癥、無頭精子癥、大頭精子癥、精子鞭毛多發形態異常等），則需要根據精子缺陷的種類及其致病基因，選擇ICSI或供精治療。精液質量參數與推薦授精方式詳見表1。c-IVF的精液標準精液優化處理ART治療中精液優化處理的主要目的是最大限度地提高優質精子濃度，減少非前向運動精子、不動精子、形態異常精子、未成熟的生精細胞和白細胞，以及去除精漿中抑制精子獲能的因子、細胞碎片和其他可能產生負面影響的有害物質（如活性氧、微生物或導致子宮收縮的化合物等），但目前尚無一種方法可以滿足上述所有要求，因此可以根據不同精液質量，選擇合適的精液優化處理方法。臨床上常用的精子制備技術有上游法（swim-up，SU）和密度梯度離心法（densitygradientcentrifugation，DGC）。精液優化處理關于兩種方法進行精液優化處理的效果比較，多數是通過處理后的精子濃度、前向運動、正常形態、精子DNA碎片比例、線粒體膜電位及活性氧水平等方面進行對比，但兩種處理方法的優劣尚無一致的結論。多項研究表明，DGC法較SU法具有更高的精子回收率（分別為>20%和<20%），而SU法可以獲得更高的前向運動精子比例。一項回顧性研究分析了719個經DGC處理和719個經SU處理的c-IVF/ICSI周期治療結局，結果顯示累積活產率、每移植周期活產率以及其他臨床和胚胎實驗室結果差異均無統計學意義。精液優化處理也有學者認為，DGC聯合SU應用效果較優，與單獨SU相比，聯合應用可提高正常形態精子獲得率；與單獨DGC相比，聯合應用可有效減少超微結構異常精子比例、降低精子DNA碎片率和核不成熟比例。另外，值得注意的是DGC相對SU更容易做到標準化，相對便于胚胎實驗室精液處理的質量控制。近些年，微流控技術也開始應用于ART的精液優化處理，其模擬精子在女性生殖道中經過生理性篩選的過程，具有分選高效、操作簡便快捷、對精子DNA損傷少等優勢。與傳統精液優化處理方法相比較，微流控技術是否能改善生殖結局，仍需更多的臨床數據證實。精液優化處理推薦意見2：①鑒于目前尚無充分證據證實DGC和SU對c-IVF治療結局有差異，因此單獨使用或者兩種方法聯合使用均可作為c-IVF精液優化處理的常用技術。②對于精液參數正常的樣本，可優先使用SU法。③而對精子濃度較低的樣本，或精子濃度較高但活力較低、供精、精液內伴有大量圓形細胞、精子凝集程度較高的樣本，或男方存在感染因素的樣本，建議使用DGC法或DGC聯合SU法進行精液的優化處理。授精操作及調整授精濃度每個ART胚胎實驗室均有符合本實驗室操作規范的授精操作方式及授精器皿，目前尚無統一的要求或規范。常用受精皿包括：圓形皿（微滴法）、中央孔皿（雙井皿）、四孔板等。不同受精皿對應的受精液體積也有所不同，中央孔皿或四孔板通常為0.5~1.0mL，微滴法通常為30~100μL。加精的方式常見以下3種：①將精子調整至合適濃度，通過計算吸取合適體積的精子懸液，加入含有卵丘-卵母細胞復合物（cumulus-oocytecomplexes，COCs）的培養液中，此法適用于使用中央孔皿或四孔板受精；②根據受精液體積，加入適當濃度精子，然后再加入COCs，此法多用于微滴法受精；③用預平衡的受精液將精子稀釋至合適濃度，然后制成微滴或加入中央孔皿或四孔板中，再加入COCs。為防止培養液pH值和溫度發生改變，建議平衡時間至少1h。授精操作及調整授精濃度盡管受精過程中精子的濃度范圍較寬，但所獲得的總受精率卻相近。而有研究顯示，隨著精子濃度的增加，多精受精的比例逐漸上升，臨床妊娠率逐漸下降。因此，在保障穩定受精率的前提下，精子濃度應盡量控制在較低的范圍。推薦意見3：①目前尚無有力證據表明不同的受精皿、受精液體積及加精方式對c-IVF結局有影響，因此各中心可根據操作習慣和工作流程進行選擇。授精操作及調整授精濃度②本共識建議授精濃度為30~50μL的液滴內加前向運動精子5000~10000條，或1mL的培養液內加前向運動精子10萬~30萬條。③是否對COCs卵丘細胞進行切割目前尚無統一規范，但建議盡量將血塊切割去除，避免將紅細胞帶入卵母細胞孵育液或受精液中。④胚胎實驗室宜結合自身條件與特點進行具體方法改良，比如可進一步根據精子在鏡下的活力情況、卵母細胞數量、卵丘成熟度、過夜受精或短時受精方式，靈活調整精子添加濃度，形成符合自身條件的標準操作流程。授精時機促排卵周期中卵母細胞會存在細胞核與細胞質發育不同步的情況，因此理論上對卵母細胞進行短時間的體外孵育有利于細胞質的進一步成熟，從而提高受精率和臨床妊娠率。幾十年來關于卵母細胞授精前孵育時間的相關研究較多，但最佳孵育時間卻較為寬泛且觀點并不一致，詳見表2。近期一項納入了9575個周期的大型回顧性研究顯示，不同的孵育時間對c-IVF卵母細胞受精能力的影響不同（<1.5h受精率顯著降低，而受精率提高可能增加累積妊娠率），而胚胎發育及妊娠結局卻無明顯差異。因此該研究認為，體外孵育時間對卵母細胞的發育潛能無顯著影響，可根據胚胎實驗室的工作流程在一定時間范圍內（孵育1.5~6.5h）安排授精時機。授精時機授精時機另外，適當延長扳機至取卵的間隔時間（36~38h）同樣有助于卵母細胞胞質的進一步成熟（體內成熟），從而改善臨床結局，因此授精時機的選擇應結合扳機時間來決定。也有學者在授精前將COCs置于體外成熟培養液中孵育，發現可以促進胞質的成熟并提高囊胚形成率。推薦意見4：鑒于各中心促排卵方案、扳機時間、取卵時機及患者個體間的差異，導致成熟卵母細胞（MⅡ）比例有所不同或卵母細胞間胞質成熟度不一致，因此授精時機的選擇應綜合考量后合理安排時間節點。本共識建議根據取卵后COCs的狀態選擇個體化的孵育時間，正常情況下建議在扳機后38~40h內完成授精。短時受精短時受精是將精卵共孵育的時間由過夜受精的16~24h縮短至1~6h的一種c-IVF衍生技術。有研究顯示，精子產生的活性氧可促進卵丘細胞的凋亡，且卵母細胞長期暴露在高濃度的精子中可能會對早期胚胎發育產生負面影響。另外Li等的研究顯示，過夜受精組受精液中的銨離子濃度顯著高于短時受精組，縮短受精時間可以顯著降低早產率。早期的薈萃分析顯示，縮短精卵共孵育的時間會增加臨床妊娠率、持續妊娠率及種植率。但也有研究提示，盡管短時受精比過夜受精在提高優質胚胎率、種植率和持續妊娠率方面具有優勢，但受精率有所降低，且活產率和臨床妊娠率并未提高。短時受精短時受精分兩種：①將COCs從受精液移至新的培養液中繼續培養；②將COCs移出受精液后對其進行脫顆粒，去除卵丘細胞及放射冠，使卵母細胞透明帶完全或大部分暴露，該方法可以同時觀察第二極體的排出情況，有助于盡早預測受精失敗從而避免LFR或TFF的發生。短時受精現有研究尚不能證實短時受精可顯著改善ART治療結局。對于LFR或TFF高風險病例（如精液參數處于臨界值、不明原因不孕、不孕年限較長、多次人工授精失敗等），可選擇脫顆粒后進行早期受精預判。但需注意的是，受精早期顆粒細胞較為致密，脫顆粒過程中的機械應力可能對受精卵產生不利影響；另外，早期脫顆粒或與多精受精相關。對于繼發不孕且精液質量較好或既往c-IVF受精正常的病例，可采用過夜受精或不進行脫顆粒操作的短時受精。短時受精推薦意見5：①鑒于尚無更充分的證據表明過夜受精與短時受精在活產率方面存在差異，因此兩者均可作為c-IVF的常規授精方式。②對于不明原因不孕、多次人工授精（≥3次）失敗、原發性不孕、繼發不孕年限≥5年且無其他明顯器質性疾病（如雙側輸卵管阻塞、宮腔粘連等）和/或精液質量處于臨界值的周期可以采用短時受精結合早期脫顆粒方式，通過觀察第二極體排出情況，對受精情況進行早期預判。③對于繼發不孕<5年且精液質量較好的周期，若采用短時受精，也可考慮不進行早期卵母細胞脫顆粒或部分脫顆粒。④對于獲卵數≤3枚的周期，為避免誤判可考慮采用過夜受精或短時受精而不進行脫顆粒觀察。如果有條件，也可早期脫顆粒后利用紡錘體觀測儀輔助判斷受精與否。c-IVF受精失敗的補救ICSI在行c-IVF周期中，當第1天（授精后18~24h）發生TFF時，可以對未出現原核的卵母細胞（僅明確見第一極體）進行ICSI，即晚期補救ICSI（laterescueICSI，L-RICSI）。雖然通過L-RICSI可以對部分病例進行挽救，但效果并不理想。2003年早期補救ICSI（earlyrescueICSI，E-RICSI）被首次提出，即通過觀察授精后6h的卵母細胞是否排出第二極體來判斷受精情況，并對明確未受精的卵母細胞（未見第二極體排出）實施補救ICSI。E-RICSI相較于L-RICSI，可以減少卵子老化對胚胎發育的影響，并且胚胎發育與子宮內膜生長的同步性也更好。事實證明，E-RICSI可以獲得比較滿意的治療結局。目前尚無證據表明L-RICSI/E-RICSI（相較于c-IVF/ICSI）會對子代安全產生負面影響，但相關研究有限，亟需更多的長期隨訪數據進行評估。c-IVF受精失敗的補救ICSI多數情況下，典型的第二極體較容易判斷，但若極體碎裂或因第二極體排出推遲，則容易造成誤判進而出現醫源性多精受精。尤其部分卵母細胞受精失敗的周期，行早期補救ICSI會增加多精受精的風險。對于獲卵數≤3枚的早期受精觀察，誤判的風險也會增高，同時也給胚胎實驗室人員帶來壓力。因此早期受精觀察的時機和準確的判斷尤為重要。另外，對于ACROSIN基因突變導致的c-IVF受精失敗，通過E-RICSI可以實現正常受精；但對于PLCζ、ACTL7A、ACTL9、IQCN等基因突變導致的受精失敗則需要利用ICSI結合人工卵母細胞激活才可能實現正常受精。因此，對于E-RICSI依然受精失敗的患者，條件允許的情況下可以進行受精失敗相關基因的遺傳學檢查，以明確病因指導后續ART治療。c-IVF受精失敗的補救ICSI推薦意見6：①E-RICSI的效果明顯優于L-RICSI，對于已實施L-RICSI的周期，可以考慮將胚胎培養至囊胚階段，再行復蘇周期移植。②目前仍然以第二極體的排出作為早期受精判斷的依據，也可結合紡錘體觀察進行輔助判斷。③建議短時受精時精卵共孵育4~5h后再行脫顆粒，當含有第二極體的卵母細胞比例<30%~50%時（分母為成熟卵母細胞），應延遲至授精后6h再行觀察，若含有第二極體的卵母細胞比例仍<50%，可行補救ICSI；鑒于臨床結局與補救推遲的時間呈負相關，建議授精后7h之內完成補救ICSI。對于透明帶異常卵母細胞（如蠟樣透明帶），發現無第二極體排出時即直接行補救ICSI操作。受精觀察c-IVF的原核觀察時間點通常為授精后（17±1）h，即出現2個原核（twopronuclei，2PN）及2個極體為正常受精；出現1個原核（monopronuclear，1PN）或>2個原核為異常受精；未見原核（nonpronuclear，0PN）多數情況為未受精，也有少部分是原核出現的時間不在觀察時間點內。因此，結合相關的新技術避免誤判對于胚胎實驗室正確觀察和處理卵母細胞非常重要。受精觀察推薦意見7：①不建議將c-IVF的1PN或0PN來源的胚胎直接丟棄，尤其對于高齡或卵巢儲備低下的患者。由于囊胚培養有利于篩選正常胚胎，故建議對0PN或1PN來源的卵裂期胚胎進行囊胚培養，若形成可利用囊胚，經充分知情同意后再行冷凍保存或移植。如果對這部分胚胎進行遺傳學篩查，在篩選整倍體胚胎的同時還需進一步排除單親二倍體及多倍體胚胎。由于安全性尚需進一步的研究和評估，故臨床移植0PN或1PN來源的胚胎仍需謹慎。②對于有條件的中心，也可以考慮將短時受精并脫顆粒后的卵母細胞放入時差成像系統進行培養和觀察，以避免原核早消失造成的誤判。c-IVF在PGT與NICS周期的應用2020年歐洲人類生殖與胚胎學會發布的PGT指南依然推薦將ICSI作為PGT周期的首選授精方式。選擇ICSI的主要目的是避免精子攜帶的父源性遺傳物質的干擾及顆粒細胞引起的母源性污染。但近幾年的相關研究顯示，PGT周期中應用c-IVF同樣可以獲得與ICSI相似的胚胎發育結局和遺傳診斷結果。因此，對于非男性因素不育行PGT的病例，ICSI是否仍然作為首選授精方式產生了爭議。2020年美國生殖醫學學會和輔助生殖技術學會發布的非男性因素ICSI適應證委員會意見中指出，在非男性因素行PGT周期的情況下，ICSI僅限在精子DNA可能對檢測結果準確性造成影響的情況下應用。c-IVF在PGT與NICS周期的應用這歸因于部分擴增技術（如MALBAC、PicoPLEX）較難擴增出精子DNA，父源性污染的發生率可忽略不計。但多重置換擴增技術（multipledisplacementamplification，MDA）中使用的堿裂解法對細胞裂解效力更強，可以實現精子DNA的擴增，因此基于MDA的PGT周期不能選擇c-IVF作為授精方式。2023年國際生殖遺傳學學會發布的PGT指南認為，使用囊胚滋養層細胞活檢結合第二代測序（next-generationsequencing，NGS）技術的PGT周期，可以采用c-IVF作為授精方式，但應盡量避免附著在胚胎上的精子或顆粒細胞的污染。同樣，也有研究表明在NICS周期中，利用c-IVF與ICSI來源的囊胚培養液進行NICS檢測的結果相似，并且檢測結果的準確性與滋養層細胞活檢相比無差異。c-IVF在PGT與NICS周期的應用推薦意見8：①本共識建議ICSI作為PGT周期的首選授精方式。對于胚胎植入前非整倍性檢測（preimplantationgenetictestingforaneuploidies，PGT-A）周期也可考慮選擇c-IVF作為授精方式，但應嚴格限制使用條件并簽署知情同意書。②基于MDA的PGT周期仍需選擇ICSI授精。③應用NICS技術進行胚胎優選，可考慮選擇c-IVF授精。c-IVF的質量控制及胚胎實驗室新員工培訓與考核c-IVF的質量控制指標及參考標準：根據2017年維也納共識及《胚胎實驗室關鍵指標質控專家共識》中的指導意見，將c-IVF實驗室質控指標的計算方式及參考標準歸納如下，詳見表3。c-IVF的質量控制及胚胎實驗室新員工培訓與考核2.輔助生殖實驗室新員工培訓與考核：c-IVF的技術操作相對簡單，應從精子動靜態分析、精液的優化處理、撿卵、顆粒細胞去除以及早期受精的判斷（短時受精）等方面進行重點培訓。并且培訓完成后需通過相應的考核方能上崗，當考核指標和同期同條件下的質控指標與帶教老師偏差較大時，應積極幫助新員工尋找原因并及時給予糾正。c-IVF的質量控制及胚胎實驗室新員工培訓與考核推薦意見9：①輔助生殖實驗室新員工在進行崗前培訓期間，要求充分掌握《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊（第六版）》中ART相關理論及操作技能，充分了解精子動靜態分析技術及相關指標臨床意義，并能夠熟練掌握精子濃度、形態及活動率計數。②對不同質量精液進行優化處理時，當處理后TPMC和前向運動精子百分率與帶教老師差異小于10%后（n=10），方可開始嘗試進行臨床操作。c-IVF的質量控制及胚胎實驗室新員工培訓與考核③新員工須在經驗豐富的帶教老師指導下完成至少50例撿卵操作并有能力對COCs進行初步評價。④卵母細胞脫顆粒的前期培訓包括巴氏吸管或剝卵針口徑的選擇、剝卵時吹吸力度、幅度、頻率及體外操作時間的控制等。操作熟練后，可在帶教老師指導下對1~2枚卵母細胞（應選擇獲卵數>15枚的病例）進行脫顆粒操作，建議累計操作至少100枚卵母細胞，且后續胚胎發育指標達到中心同期質控要求。⑤當對早期受精進行判斷時，在嚴格控制體外觀察時限的情況下判斷結果與帶教老師差異小于10%后（n=100），方可開始嘗試進行臨床操作。相關操作參考方法1.精液優化處理參考方法（1）DGC法：①在15mL離心管中制備非連續密度梯度離心液，分別取40%~45%上層梯度液和等體積的80%~90%下層梯度液1.0~2.0mL；②將液化后的精液樣本（≤2mL）緩慢沿管壁注入低濃度的梯度離心液上方，（300~500）×g離心15~20min；③棄去上清液或直接吸取精子沉淀，將精子沉淀重懸于1.5~2mL培養液中，（200~300）×g離心5~10min，此步驟可進行1~2次。最后棄去上清液，依據沉淀量將精子重懸于0.5~1.0mL培養基（受精液）中備用，以上方法僅作為參考。相關操作參考方法（2）SU法：①首先將精液（≤2mL）置于圓底試管中（建議使用容量較大的試管），隨后將1.5~2.0mL培養基輕輕鋪在精液上方，或者將精液（≤2mL）緩慢加入1.5~2.0mL培養基底部。注意保持精液與培養基界面分明。②將試管傾斜45°置于通氣培養箱內上游30~60min。③將孵育后的上清液（中上層呈云霧狀液體部分）轉移至新的無菌離心管，（200~300）×g離心5~10min。棄去上清液，將精子沉淀重懸于1.5~2.0mL培養基中，（200~300）×g離心5~10min。最后棄去上清液，依據沉淀量將精子重懸于0.5~1.0mL培養基（受精液）中備用。相關操作參考方法（3）DGC聯合SU法：①首先進行DGC法（同上），最終保留0.5~1.0mL的精子沉淀懸液；②將精子懸液移入新的離心管底部，再將1~1.5mL培養基輕輕置于精子沉淀懸液上層，或將精子沉淀懸液輕輕加入含1~1.5mL新培養基的試管底部；③將試管傾斜45°置于培養箱中上游5~30min，隨后吸取上清液備用。（4）其他新方法：除了上述經典方法外，胚胎實驗室宜結合自身條件與特點進行具體方法改良，也可以參照其他相關新方法進行嘗試（如微流控技術），經過實驗室質控穩定后形成標準操作程序。相關操作參考方法（5）特殊情況處理：①精液不液化或液化不良的樣本，建議在離心前用巴氏吸管反復吹打混勻，或加等體積的培養液反復吹打（盡量避免產生大量氣泡），促其液化后再離心處理；②精液黏稠度較大的樣本，可以添加適當培養液進行稀釋，再行優化處理；③精液里有團塊或者膠凍樣物，可將精液轉移到15mL尖底離心管內，待團塊或者膠凍樣物自然沉淀后棄去，再對樣本進行密度梯度離心；④若精液存在絮狀漂浮物，待液化后可采用瞬時離心方法去除，如將液化后的精液利用Eppendorf的ShortSpin功能瞬時離心3~5s。相關操作參考方法2.前向運動精子濃度的調節方法：吸取制備后的精子混懸液10μL，滴入Makler計數板，雙人分別計數橫豎各10個小方格后取平均值，計數所得前向運動精子個數×106/mL即為前向運動精子濃度。例如：計數