2.2動物細胞工程2.2動物細胞工程生產單克隆抗體常用技術手段動物細胞工程動物細胞培養動物細胞核移植動物細胞融合

動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎。動物細胞工程常用的技術手段：

從動物機體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。一、動物細胞培養1、動物細胞培養的概念動物細胞培養技術動物組織塊細胞懸液原代培養傳代培養胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞幼齡動物的器官組織；動物胚胎動物細胞培養過程細胞貼壁接觸抑制原代培養傳代培養加入培養液用胰蛋白酶等處理貼壁細胞適宜條件不死性細胞細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養傳代培養3.如何界定原代培養和傳代培養？隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖⑴原代培養:

將動物組織消化后的初次培養。⑵傳代培養:

對貼滿瓶壁的細胞用胰蛋白酶處理，然后再分瓶繼續培養。

無菌無毒環境、充足營養（血清或血漿）、適宜溫度、PH、氣體環境。4、體外培養動物細胞需要物質和環境條件⑴無菌、無毒的環境①對培養液、培養用具進行無菌處理；②在培養液中加抗生素；③定期更換培養液。⑵充足的營養葡萄糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素、血漿或血清為什么要加血清呢？⑶溫度和PH36.5±0.5℃；PH=7.2―7.4⑷氣體環境——O2和CO2

C02的主要作用是維持培養液的PH。含95%的空氣5%CO21、大規模的生產生物制品。2、培養的動物細胞作為基因工程的受體細胞。3、檢測判斷物質的毒性。4、培養正常或各種病變的細胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于

等，為

及其他疾病提供理論依據。5.動物細胞培養應用：篩選抗癌藥物治療和預防癌癥二.動物細胞核移植技術和克隆動物

將動物的一個細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成為一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發育為動物個體（克隆動物）。

分類胚胎細胞核移植：體細胞核移植：細胞分化程度低，恢復全能性容易；細胞分化程度高，恢復全能性不容易1.動物細胞核移植概念：（難度高）2、體細胞核移植的過程：思考：1.核移植的受體細胞是什么？處在什么時期？用此細胞作為受體細胞有什么好處？MⅡ中期卵母細胞卵母細胞體積大，便于操作；含有營養物質豐富，提供早期胚胎發育所需的營養；含有激活細胞核體現全能性的物質。電激處理使供體核進入受體卵母細胞構建重組胚胎卵母細胞采集、培養MⅡ期卵母細胞供體牛供體細胞注入去核卵母細胞代孕母牛克隆牛體細胞培養去核卵母細胞去核胚胎移植體細胞核移植過程

（體細胞克隆動物）１、在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？為使核移植動物的遺傳物質全部來自有利用價值的動物提供的細胞。２、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內的細胞，為什么？10代以內的細胞一般保持正常二倍體的核型，未發生突變思考題3、體細胞核移植方法生產的克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細胞思考題3.體細胞核移植技術的應用前景：1.加速家畜遺傳改良的進程2.保護瀕危物種3.生產醫用蛋白質及克隆動物組織、器官4.了解胚胎發育和衰老過程；5.追蹤研究疾病的發展過程和治療疾病4、體細胞核移植技術存在的問題P50（1）成功率非常低（2）克隆動物以表現早衰、生理缺陷等健康問題

A細胞B細胞人工誘導1.1動物細胞融合的概念雜交細胞動物細胞融合（也稱細胞雜交）：是指兩個或多個細胞融合形成一個單核細胞的過程。一、動物細胞融合細胞膜的流動性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細胞進行有絲分裂，形成完整的雜交細胞誘導的手段？融合后細胞的類型？AB雜種細胞遺傳物質有什么特點？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質1.2動物細胞融合過程原理？1.2動物細胞融合過程為什么滅活的病毒能作誘導劑？滅活喪失感染性保留融合活性1.3動物細胞融合技術的意義和應用突破有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能最主要用途：制造單克隆抗體比較項目細胞融合的原理細胞融合的方法誘導手段用途植物體細胞雜交細胞膜的流動性纖維素酶、果膠酶去除細胞壁后誘導原生質體融合離心、電刺激、振動、聚乙二醇克服遠源雜交不親和，獲得雜種植株動物細胞融合細胞膜的流動性用胰蛋白酶使細胞分散后誘導細胞融合除應用植物細胞雜交手段外，還有滅活病毒獲得雜種細胞、制備單克隆抗體1.4比較動、植物細胞雜交技術【例1】能使動物細胞融合的特有的誘導因子是（）A.離心B.滅活的病毒C.電刺激D.振動【例2】融合后的雜交細胞的遺傳物質有何特點（）具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息B.能無限增殖C.可形成新個體D.培養過程會貼壁【例3】動物細胞融合的作用中最重要的是（）A.克服遠源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產雜種細胞

BB初試牛刀A強調：效應B淋巴細胞是能夠產生抗體的B淋巴細胞，下文將其簡稱為B淋巴細胞抗體：能夠與抗原發生特異性結合的免疫球蛋白。能產生抗體的細胞是漿細胞（即效應B細胞）。溫故知新二、單克隆抗體B淋巴細胞效應B淋巴細胞記憶B淋巴細胞分化抗體的傳統生產方法抗原反復注射動物從動物的血清中分離抗體該法制備抗體的缺點：產量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。如何解決這個問題呢？單克隆抗體！讀下面一段資料，找出單克隆抗體的概念

人們發現，在動物發生免疫反應的過程中，體內的B細胞可以產生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細胞只分泌一種化學性質單一、特異性強的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個B細胞進行無性繁殖，即克隆。2.1單克隆抗體的概念單克隆抗體：單個B細胞克隆產生的化學性質單一、特異性強的抗體提示1：對B細胞進行細胞培養可行嗎？提示2：我們所學的哪種細胞是可以無限增殖的？問題：如何大量生產單克隆抗體？請嘗試設計一個方案。2.2單克隆抗體的制備

一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞能無限增殖雜交瘤細胞動物細胞培養技術設計方案：動物細胞融合技術單克隆抗體既能產生特異性抗體，又能大量增殖的細胞1975年英國科學家米爾斯坦和柯勒的實驗①為什么給小鼠注射特定的抗原蛋白？②會有幾種融合方式？③雜交瘤細胞是如何篩選出來的？有何特點？④是否所有的雜交瘤細胞都能產生專一性抗體？⑤如何大規模進行培養得到大量的單克隆抗體？BB

、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一選）選擇性培養基：只有雜交瘤細胞才能存活獲得產生相應抗體的B細胞（二選）：選能產生所需專一抗體的雜交瘤細胞√體外培養小鼠腹腔內培養雜交瘤細胞特點：既能產生特異性抗體，又能大量增殖。單抗制備過程分哪幾步？請用箭頭把以下代表單克隆抗體制備過程步驟的圖解的字母按正確順序連接起來。順序是？

你學會了嗎？2.3單克隆抗體的應用診斷試劑——最廣泛應用準確、高效、簡易、快速單克隆抗體最主要的優點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備。“生物導彈”＝單克隆抗體＋藥物單抗導向，藥物為彈頭治療疾病和運載藥物主要用于治療癌癥治療，單克隆抗體作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導彈”，準確殺傷癌變細胞。【例4】科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經培養可產生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是（）A.經過免疫的B淋巴細胞C.經過免疫的T淋巴細胞B.不經過免疫的T淋巴細胞D.不經過免疫的B淋巴細胞【例5】單克隆抗體是由下列哪種細胞產生的（）B淋巴細胞B．T淋巴細胞C．骨髓瘤細胞D．雜交瘤細胞A初試牛刀D【例6】用動物細胞工程技術獲取單克隆抗體，下列實驗步驟中錯誤的是（）A．將抗原注入小鼠體內，獲得能產生抗體的B淋巴細胞B．用纖維素酶處理B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞C．用聚乙二醇作誘導劑，促使能產生抗體的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合D．篩選雜交細胞，并從中選出能產生所需抗體的細胞群，培養后提取單克隆抗體B初試牛刀×兩個過程動物細胞培養過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導細胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細胞－－雜交瘤細胞一個優勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優勢本節小結重點謝謝(1)若A細胞是小鼠骨髓瘤細胞，則B細胞是取自小鼠體內的

細胞，從小鼠體內提取分離該細胞之前，應給小鼠注射_____________類物質。（2）d過程是一個_____________過程，該過程的進行常用_____________或_____________的誘導。(3)假設僅考慮某兩個細胞的融合，則可形成

種類型的C細胞，因此需用__________培養基篩選出D細胞用于培養，D細胞的名稱是

，其特點是_________________________________________。效應B

抗原

細胞融合

聚乙二醇滅活的病毒

選擇性3既能無限增殖又能產生特異性抗體

雜交瘤細胞(4)在培養時通過________分裂方式大量繁殖。D細胞體外培養需要注意的條件是（要求答5項）__________________________________。（5）單克隆抗體在疾病的診斷、治療和預防方面，與常規抗體相比，其特點是_________________。特異性強、靈敏度高

有絲無菌、無毒的環境；充足的營養；適宜的溫度和pH；適宜的氣體環境

15、（1）單克隆抗體是指

。（2）制備單克隆抗體的步驟：①將__________注入小鼠體內，從小鼠脾臟中獲得淋巴細胞，其中至少1個淋巴細胞帶有抗該抗原的抗體。②將步驟①獲得的B淋巴細胞與步驟②培養的骨髓瘤細胞在_________________的誘導下融合。③將誘導后產生的多種細胞，放在_______培養基的多孔培養板上培養，篩選。④這樣獲得的雜交瘤細胞既具有B淋巴細胞_____________的能力，又具有________________的本領。⑤檢測和分離帶有抗X抗體的陽性細胞，培養板中每孔放一個細胞進行培養。⑥將陽性細胞進行增殖，從而制備出大量抗該抗原的單克隆抗體。化學性質單一，特異性強的抗體

抗原

聚乙二醇選擇性

無限增殖

產生專一抗體（3）大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：①體外培養法，可獲得10μg/mL的抗體；②動物體內誘生法可獲得5~20mg/mL的抗體。你選擇的方法及原因是

。（4）用本法制備出的單克隆抗體仍具有局限性，因為它是用小鼠的_______細胞制備的，其化學本質是___________，應用于人體，會作為

產生

，解決這個問題的方法是_____________________________。大量生產選①，小規模生產選②效應B蛋白質異物免疫反應采用人的效應B細胞制備15、右圖為某同學根據雜交瘤技術的方法，設計的生產破傷風桿菌抗體的實驗方案。據圖回答：

（1）該方案能達到預期效果嗎？

。原因是

____________