第五章

體內藥物分析2024/7/192第五章

體內藥物分析常用體內樣品的制備與貯藏

1體內樣品分析的前處理2體內樣品分析方法與方法驗證32024/7/193第五章熟悉:

體內樣品的采集與制備方法 體內樣品分析方法驗證的技術要求了解:體內藥物分析的性質與意義掌握:

體內藥物分析的特點和應用 體內樣品分析的前處理 體內樣品分析方法驗證的內容2024/7/194體內藥物分析

學習要求體內藥物分析的特點和應用體內樣品分析的前處理體內樣品分析方法驗證內容體內藥物分析的性質與意義體內樣品的采集與制備方法體內樣品分析方法驗證的技術要求掌握

了解熟悉2024/7/195概述體內藥物分析方法建立與驗證凈化與濃集原形,代謝物體液或組織色譜;免疫分析;生物

全面驗證和部分驗證

原形藥物或其代謝物

綴合物,蛋白結合物

體內樣品存在形式樣品制備分析方法去蛋白;萃取;膜分離水解;化學衍生化血液是主要樣品尿液,唾液,頭發(fā)和臟器2024/7/196概述1.體內樣品的特點(1)采樣量少:ml~μl級;且不易重新獲得

(2)待測物濃度低:μg/ml~ng/ml級,甚至pg/ml(3)干擾物質多:尤其是血樣和組織中的蛋白質2.體內藥物分析的特點(1)樣品需經純化濃集,或化學衍生化處理(2)對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高

(3)分析工作量大,數(shù)據(jù)處理和結果闡明繁雜

體內藥物分析的特點主要來自于體內樣品的特點特點2024/7/197第一節(jié)

常用體內樣品的制備與貯藏

體內樣品的種類1體內樣品的采集與制備2體內樣品的貯藏與處理32024/7/198體液組織排泄物一、體內樣品的種類體內樣品血液;唾液腦脊液;胃液;膽汁;乳汁;精液;淚液尿液糞便;汗液胃;腸;肝;腎;肺,腦;肌肉;頭發(fā)2024/7/199常見體內樣品1.血樣的采集

靜脈,1-5ml≤1/10

2.血漿的制備

抗凝劑,1000

g離心5-10min淡黃色上清液

3.血清的制備

30min-1h

1000

g離心

5-10min上層淡黃色液體

4.全血的制備抗凝劑,不離心1.尿樣的特點

原形,代謝物及綴合物藥物濃度較高收集量大(1~5L)

2.尿樣的采集

自然排尿規(guī)定時間段(6-8h)(時間尿)

3.尿樣的貯藏

加入適當防腐劑TDM測定S代替P進行臨床監(jiān)測

1.唾液的組成腮腺,舌下腺和頜下腺

2.唾液的采集漱口15min,安靜狀態(tài),自然流出的唾液

物理或化學方法刺激3.樣品的制備3000r/min離心10min,上清液1.樣品的制備制成水性基質勻漿溶液

2.樣品的處理(1)沉淀蛋白法(2)酸/堿水解法(3)酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素血樣尿樣唾液組織二、體內樣品的采集與制備50-60％20-40％2024/7/1910三、體內樣品的貯存與處理(一)冷藏與冷凍短期保存:冰箱(4℃)冷藏長期保存:冷柜(-20℃/-70~-80℃)冷凍,小體積分裝1.血漿/血清:

分離(≯2h),硬質玻璃/聚乙烯管(EP),冷凍2.尿樣:

冷藏(24~36h)加防腐劑3.唾液:

冷凍保存時,解凍后充分攪勻后再用(二)去活性采樣后立即終止酶的活性常用方法:液氮速凍,微波照射,勻漿/沉淀,加酶活性阻斷劑(氟化鈉)或抗氧劑(VC),煮沸2024/7/1911第二節(jié)

體內樣品分析的前處理

體內樣品預處理的目的1常用體內樣品預處理方法2

前處理(分離,濃集,改性)為藥物的測定提供條件

前處理是體內藥物分析過程中重要且繁復的工作2024/7/1912儀器污染,劣化(去蛋白)提高測定靈敏度/選擇性化學改性(衍生化)

血漿蛋白結合物;綴合物使待測藥物/代謝物釋放測定藥物/代謝物總濃度

1.使待測組分游離

2.滿足測定方法的要求

3.改善分析環(huán)境

一、體內樣品前處理的目的樣品介質組成復雜:分離待測組分濃度低:濃集

前處理2024/7/1913二、體內樣品前處理的方法

去除蛋白質法分離與濃集法綴合物水解法

(一)(二)(三)化學衍生化法

(四)2024/7/1914(一)去除蛋白質法加入與水混溶的有機溶劑,蛋白析出→藥物釋放乙腈,甲醇,丙酮,四氫呋喃等血漿/血清與有機溶劑的體積比1∶(2-3)

飽和硫酸銨,硫酸鈉,硫酸鎂,氯化鈉等血清與飽和硫酸銨溶液的比1∶2

10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清與強酸的比1∶0.6上清液呈強酸性(pH≤4)酸性分解的藥物不宜用熱變性蛋白質沉淀通常90℃方法簡單只能除去熱變性蛋白待測物熱穩(wěn)定性好

1.溶劑沉淀法2.中性鹽析法3.強酸沉淀法4.熱凝固法2024/7/1915(二)分離與濃集法液相萃取法固相萃取法超濾法1.2.3.2024/7/19161.液相萃取法溶劑的選擇原則溶劑的用量水相的pH(1)(2)(3)提取操作(4)2024/7/1917(1)溶劑的選取原則①對藥物分子未電離形式可溶,對電離形式不溶；②沸點低,易揮發(fā);③與水不相混溶;④無毒,不易燃燒;⑤具有化學穩(wěn)定和惰性;⑥不影響紫外檢測

溶劑紫外截止波長(nm)沸點(℃)↓極性增加↓正己烷21069環(huán)己烷21081甲苯285111異丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷

24561甲基異丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含過氧化物；

:肝臟毒性,有致癌作用①輔助試劑的使用乙醚(1.2%水):氯化鈉②混合溶劑的使用

正己烷-異丙醇(95:5)2024/7/1918(2)溶劑的用量有機相與水相(樣品)體積比為1:1~5:1堿性藥物pH高于pKa1~2單位酸性藥物pH低于pKa1~2單位堿性下提取,可減少內源性物質(酸性)的干擾堿性下不穩(wěn)定,在中性用三氯甲烷和異丙醇提取(3)水相的pH提取1次若提取回收率較低(低于50%),提取2~3次脂溶性干擾物,可進行小體積水溶液反提取

(4)提取操作

2024/7/19192.固相萃取法固相萃取法的原理

固相萃取法操作步驟

注意事項

(1)(2)(3)固相萃取法的特點

(4)自動化固相萃取

(5)2024/7/1920(1)固相萃取法的原理 含藥物體內樣品通過小柱時,受到“吸附”,“分配”,“離子交換”或其它親和力作用,藥物及內源性物質同時被保留在固定相(填料)

洗脫方式有兩種:①沖洗溶劑洗去干擾物,再用對藥物親和力更強的溶劑洗脫藥物;②藥物直接被洗脫,干擾物保留2024/7/1921(2)固相萃取法操作步驟

第1步:甲醇潤濕小柱,活化填料;凈化填料

第2步:水/緩沖液沖洗小柱,去除甲醇;甲醇含量過低(低于5%)致C18鏈彎曲折疊,回收率降低

第3步:加樣,使樣品通過小柱,并棄去濾過液

第4步:水/緩沖液沖洗小柱,去除內源性及其它干擾物質第5步:洗脫溶劑洗脫待測物,收集洗脫液,平衡2024/7/1922(3)注意事項①樣品(血漿)通過萃取柱的流速在1-2ml/min;②沖洗液和洗脫劑的強度與用量適當,否則導致藥物損失/選擇性下降,通常選用可與水混溶的洗脫劑;③萃取堿性藥物時,洗脫劑中常加酸,有機胺,氨水,醋酸銨或離子對試劑2024/7/1923(4)固相萃取法的特點2024/7/1924(5)自動化固相萃取法對于單個樣品處理,SPE操作省時對于大量樣品的處理半自動SPE:萃取過程機械化全自動化儀器:通過柱切換技術實現(xiàn)固相萃取與HPLC聯(lián)用2024/7/1925柱切換:固相萃取-LC/MS/MS(5)自動化固相萃取法2024/7/19263.超濾法ultrafiltration是一種膜分離技術按照截留分子量,選擇半透膜,可分離30~1000kD的可溶性生物大分子無化學試劑,無相變化提取操作(4)簡便,游離藥物分析的首選方法;尤其適合TDM2024/7/1927(三)綴合物水解法簡便,快速

水解過程中發(fā)生藥物分解專一性較差葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶專屬性強時間較長可引入粘蛋白溶劑萃取過程中綴合物(尤其硫酸酯)直接分解測定尿藥總量,水解綴合物趨向于直接測定綴合物1.酸水解法2.酶水解法3.溶劑解法2024/7/1928(四)化學衍生化法1.在GC中的應用(1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)酰化:三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不對稱衍生化:(S)-N-三氟乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2.在HPLC中的應用(1)衍生化的分類

柱前/柱后;在線/離線(2)衍生化方法

(1)紫外衍生化

(2)熒光衍生化

(3)非對映體衍生化GC:①提高藥物的揮發(fā)性;②增加藥物的穩(wěn)定性;③生成非對映異構體

HPLC:①提高檢測靈敏度;②改善色譜分離容量分析法2024/7/1929第三節(jié)

體內樣品分析方法與方法驗證分析方法的建立一、分析方法的驗證二、2024/7/1930一、分析方法的建立分析方法的選擇分析方法建立的一般程序(一)(二)2024/7/1931(一)分析方法的選擇

HPLC,GCHPLC-MSn,GC-MS

RIA,EIA,FIA;適用于大分子TDM應用較多抗生素生物利用度,等效性,TDM應用較少常用的檢測方法: 色譜分析法,免疫分析法 和生物學方法免疫分析法色譜分析法生物學方法2024/7/1932(二)分析方法建立的一般程序

待測物,內標(必要時)的標準物質色譜柱(填料),流動相,溶劑,進樣量試劑/溶劑試驗;生物介質試驗質控樣品試驗代謝產物對待測物,內標物的干擾配伍用藥的干擾分析方法的建立和驗證過程系同步進行為便于討論,以色譜分析法為例分別敘述1.色譜條件的篩選2.色譜條件的優(yōu)化3.實際樣品的測試2024/7/1933二、分析方法的驗證特異性標準曲線與定量范圍定量下限

(一)(二)(三)精密度與準確度

(四)樣品穩(wěn)定性

(五)提取回收率

(六)方法樣品2024/7/1934二、分析方法的驗證分析過程的質量控制未知樣品濃度超限的處理藥用內源性物質的測定

(七)(八)(九)微生物/免疫學方法的驗證(十)名詞解釋(十一)分析其他2024/7/1935(一)特異性

比較標準物質與6個不同個體的空白生物介質和QC樣品軟電離質譜(LC-MS)介質效應比較QC樣品和至少6個不同個體用藥后的實際樣品必要時LC-DAD/MS確證峰的單一/同一

比較待測藥物,同服藥物,待測藥物的QC樣品和添加有同服藥物的干擾樣品特異性(specificity),又稱專屬性或專一性, 通常與選擇性(selectivity)互用1.內源性物質2.未知代謝物

3.伍用藥物4.參比方法參比方法橫坐標(x),擬定方法縱坐標(y),最小二乘y=a+bx

a恒定干擾b比例干擾(如,標記抗原不純,交叉免疫)2024/7/1936(二)標準曲線與定量范圍1.標準曲線的建立(二)少數(shù)方法(如,IA)外,通常為線性模式線性回歸:最小二乘法或加權最小二乘法自變量(x)為藥物濃度,因變量(y)為響應信號強度(1)系列標準溶液:

n≥6(不包括0點);等比系列(2~3); 通常為100~1000倍(2)內標溶液:

濃度相當于系列標準溶液的幾何平均濃度

(3)系列標準樣品:空白生物介質,加入系列標準溶液(4)標準曲線的繪制:藥物濃度,以單位體積(如血漿)或質量(如肝臟)的生物介質中加入標準物質的量表示2024/7/1937(二)標準曲線與定量范圍2.限度要求通常用至少6個濃度建立標準曲線非線性相關(如IA)可能需要更多濃度點定量范圍覆蓋全部待測樣品濃度范圍定量上限(ULOQ)高于用藥后的峰濃度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)標準曲線各濃度點的回歸計算值(x’)與標示值(x)之間的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范圍之內最低濃度點的偏差在±20%以內其余濃度點的偏差在±15%以內2024/7/1938(三)定量下限1.測定法取同一生物介質,制備至少5個獨立的標準樣品,其濃度應使信噪比(S/N)大于5,依法進行精密度與準確度驗證定量下限(LLOQ):標準曲線上的最低濃度點符合準確度和精密度要求2.限度要求準確度應在標示濃度的80%~120%范圍內,相對標準差(RSD)應小于20%2024/7/1939(四)精密度與準確度1.測定法高中低3個濃度的QC樣品,制備至少5個獨立的樣品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:幾何平均濃度同法獨立測定3天方法精密度除評價批內(日內)RSD外,同時還應評價批間(日間)RSD2.限度要求準確度:低,80%~120%; 中高,85%~115%RSD:低,20%; 中高,15%2024/7/1940(五)穩(wěn)定性1.測定法(高低濃度)室溫考察1個工作日(如1,2,4,8或24h)

冷藏(4℃)數(shù)個工作日(標準儲備液至整個分析完成)冷凍(-20℃/-80℃)至整個分析完成凍-融至少經歷3個循環(huán)短期穩(wěn)定性:在1個分析批內,樣品室溫等待處理;處理后溶液在特定(HPLC進室)溫度等待進樣期間穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性:在整個樣品分析期間,體內樣品的長期儲藏,凍融;以及標準儲備液的穩(wěn)定性2.期限要求短期:通常1工作日,不超過3工作日;長期:整個分析完成期限2024/7/1941(六)提取回收率1.測定法高中低3個濃度的QC樣品,制備至少5個獨立的樣品另取空白生物介質,照QC樣品同法處理,加入等量的標準溶液(必要時除去溶劑)同法處理高中低3個濃度的標準對照樣品(不含生物介質)樣品處理方法的評價重點在于結果的精密與重現(xiàn);而非待測物提取的完全與否2.限度要求RSD:低,20%; 中高,15%2024/7/1942(七)分析過程的質量控制每個未知樣品測定一次,必要時進行復測來自同一個體的體內樣品在同一分析批中測定每個分析批,建立批標準曲線;并隨行3濃度QC樣品

QC樣品每個濃度至少雙樣本,并均勻分布在未知樣品順序(低→高/高→低順序均勻穿插整個分析批)中一個分析批內未知樣品數(shù)目較多時,應同時增加各濃度QC樣品數(shù),使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%QC樣品測定結果的偏差不大于±15%,低濃度點偏差不大于±20%;允許1/3非同濃度QC樣品結果超限不符合上述要求,則該分析批樣品測試結果作廢2024/7/1943(八)未知樣品濃度超限的處理標準曲線不能外延,濃度超限的樣品處理后再測定濃度高于ULOQ部分樣品用空白生物介質稀釋至規(guī)定體積再測定同時制備濃度高于ULOQ的QC樣品,同法稀釋(濃度不低于LLOQ)后測定濃度低于LLOQ增加樣品體積(制備樣品濃度高于LLOQ);同法進行QC樣品和空白介質試驗特異性不降低,準確度和精密度符合要求生物利用度/生物等效性研究,不需處理2024/7/1944(九)作為藥用的內源性物質的測定

對生物介質進行處理 生物介質通過活性炭濾過、透析等技術去除所含的該內源性物質后,作為空白生物介質使用使用特定生物周期階段的生物介質

適用于呈周期性變化的內源性物質(如雌激素)使用替代介質

如兔血漿,人血清蛋白,緩沖液,0.9％氯化鈉溶液等;測得的濃度需進行校正采用標準加入法適用于內源性物質含量較低的藥物;結果為總濃度2024/7/1945(十)微生物學/免疫學方法的驗證微生物學或免疫學分析法的標準曲線本質上是非線性的,應盡可能采用更多的濃度點建立標準曲線如果重復測定能夠改善準確度,則應在方法驗證和未知樣品測定中采用同樣的步驟(如雙樣本分析)微生物學或免疫學分析方法驗證實驗應包括在幾天內進行的6個分析批,每個分析批應包括4個濃度(LLOQ、低、中、高濃度)的質控雙樣本2024/7/1946(十一)名詞解釋1標準物質(referencestandard):用于制備標準樣品和QC樣品的待測物的參比標準在結構上可以是待測物本身,也可以是其游離堿或酸,鹽或酯常用的標準物質主要有三種來源:①法定標準物質(如ChP標準品或對照品,