生物信息學軟件及使用技巧BioinformaticsBasics吳元明講師第四軍醫大學基礎部wuym@第1頁生物信息學軟件分類單機分析軟件：如winplas在線分析軟件:如webcutter生物學數據庫:如NCBI,DDBJ,EBI第2頁生物信息學軟件意義分析和處理試驗數據和公共數據，加緊研究進度，縮短科研時間。提醒、指導、替換試驗操作，利用對試驗數據分析所得結論設計下一階段試驗。用計算機管理試驗數據。BioinformaticsBasics第3頁生物學軟件慣用功效（核酸類）DNA序列片斷拼接----ContigExpress分析mRNA開放讀框限制性酶切位點分析DNA模擬電泳PCR引物設計RNA二級結構分析BioinformaticsBasics第4頁生物學軟件慣用功效（蛋白類）蛋白一級結構分析（氨基酸分析）蛋白二級結構分析（結構域分析）蛋白三級結構分析（空間結構分析）BioinformaticsBasics第5頁生物學軟件慣用功效（共同類）DNA、蛋白質序列同源分析進化樹構建BioinformaticsBasics生物學軟件慣用功效（其它類）質粒繪圖類圖象處理軟件第6頁一、DNA序列片斷拼接（電子基因克?。┤〉酶信d趣EST，在dbEST數據庫中找出EST最有路徑是尋找同源序列，標準：長度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。然后將檢出序列組裝為重合群（contig），以此重合群為被檢序列，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重合樣系列，重復以上過程，直到沒有更多重合EST檢出或者說重合群序列不能繼續延伸，有時可取得全長基因編碼序列。再與GeneBank核酸數據庫進行相同性檢測，假如有準確匹配基因，將EST序列數據據EST六種閱讀框翻譯成蛋白質，接著與蛋白質序列數據庫進行比較分析。第7頁VectorNTI5.2---contigExpress第8頁二、分析mRNA開放讀框（一)5’-UTR結構

1、mRNA5’端m7G帽有增強翻譯水平作用．

2、“上游AUG密碼子”(位于起始AUG上游其它AUG密碼子)存在往往抑制下游開放讀框翻譯效率．

3、起始AUG旁側序列對翻譯效率影響．

Kozak序列：GCCAUGG(二)3’-UTR結構

1．poly(A)尾增加翻譯效率

2．富含UA序列抑制翻譯。

第9頁二、分析mRNA開放讀框取得盡可能長mRNA序列。分析可能讀框（六種）。軟件：VectorNTI，Omiga等。在線:（/tools/dna.html）選取最可能一個?？词欠穹细鞣N條件。分析步驟：第10頁當前應用蛋白質結構預測算法同源預測(一級結構決定高級結構)結構與結構相對比（DALI算法）當前最先進結構預測方法： 結構類識別（foldrecognition）先建立一個已知結構類數據庫（foldlibrary)，將待測序列“穿過”該數據庫組成座標，并依據事先確定物理限制，逐一位置移動（threading，sequence-structurealignment)，并一個函數（sequence-structurefitnessalignment)判斷序列與結構類符合程度，找出未知序列在目標結構上能量最優和構象最穩固比對位置。對計算機要求很高。第11頁Cn3D2.5顯示1EQFA鏈三維結構第12頁十一、質粒繪圖winplasPlasmidprocessorDMUPbetaVectorNTI第13頁Winplas2.6質粒構建第14頁七、DNA與蛋白質序列同源分析（進化樹構建）個體與數據庫比較。兩個或兩個以上個體比較。不一樣情況：internet網絡。如，NCBIBLAST;ExPASyAlignment.軟件。如，VecotrNTI分析方法：第15頁VectorNTISuitAlignX同源比較—主窗口第16頁VectorNTISuit同源比較—進化樹第17頁八、蛋白質一級結構分析氨基酸組成。PIMW亞細胞定位包含：internet網絡。如，ExPASyprimarystructureanalysis

topologyprediction.軟件。如，VecotrNTI,Antheprot分析方法：第18頁Omiga2.0ORFMap第19頁三、限制性酶切位點分析一個能識別特殊，短核苷酸序列，并在DNA一些位點上切割蛋白質。細菌包含了400種這么酶，能識別和切割100種以上不一樣DNA序列。

如：EcoRI識別序列定義：GAATTCGTTAAC第20頁三、限制性酶切位點分析找到待分析核酸序列。利用VectorNTI軟件分析。利用webcutter2.0在線分析。（/cutter）分析步驟：第21頁四、DNA模擬電泳找到待分析核酸序列。利用VectorNTI或其它軟件分析。分析步驟：DNA模擬電泳含有一定試驗預示功效。模擬電泳不能作為試驗結果或依據。注意：第22頁VectorNTISuit5.5模擬電泳第23頁GeneConstructionKit2.0模擬電泳第24頁五、PCR引物設計（雜交探針設計）引物設計標準引物要跟模板緊密結合；引物與引物之間不能有穩定二聚體或發夾結構存在；引物不能在別非目標位點引發高效DNA聚合反應(即錯配)。第25頁如：引物長度（primerlength），產物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，ΔG值(internalstability)，引物二聚體及發夾結構（duplexformationandhairpin），錯誤引發位點（falseprimingsite），引物及產物GC含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。引物設計需要考慮原因第26頁引物設計關鍵點普通引物長度為16-23bp，慣用長度為18-21bp，過長或過短都不適當。引物3’端堿基普通不用A，因為A在錯誤引發位點引發效率相對比較高，而其它三種堿基錯誤引發效率相對小一些。引物GC含量普通為45-55%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物GC含量不能相差太大。引物所對應模板序列Tm值最好在72℃左右，當然因為模板序列本身組成決定其Tm值可能偏低或偏高，可依據詳細情況靈活利用。第27頁引物設計關鍵點ΔG值反應了引物與模板結合強弱程度，也是一個主要引物評價指標。普通情況下，在Oligo5.0軟件ΔG值窗口中，引物ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間部分ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超出9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發反應而可預防錯誤引發。其原理，引物與模板應含有較高結合能量，這么有利于引物與模板序列整合，所以5’端與中間段ΔG值應較高，而3’端ΔG值影響DNA聚合酶對模板DNA解鏈，過高則不利于這一步驟。第28頁引物設計關鍵點可能錯誤引發位點決定于引物序列組成與模板序列組成相同性，相同性高則錯誤引發率高，錯誤引發引發率普通不要高過100，最好沒有錯誤引發位點，如此能夠確保不出非目標產物假帶。引物二聚體及發夾結構能量普通不要超出4.5，不然輕易產生引物二聚體帶，且會降低引物濃度從而造成PCR正常反應不能進行。對引物修飾普通是增加酶切位點，應參考載體限制酶識別序列確定，經常對上下游引物修飾序列選取不一樣限制酶識別序列，以有利于以后工作。

第29頁關于引物自動搜索和評價分析推薦使用自動搜索軟件：PrimerPremier5.0推薦使用引物評價軟件：Oligo5/6第30頁OLIGO5.0PCR引物設計第31頁六、RNA二級結構預測主要軟件：

DNAsis,RNAstructure,RNAdraw

ViennaRNAPackageRDFolder是RNA二級結構預測Web服務器

（北京大學生物信息學中心）意義：

分析RNA結構穩定性，為可能（酶、核酸）作用位點分析等提供依據。第32頁DNASIS2.5RNA二級結構預測第33頁DNASIS2.5tRNA二級結構預測第34頁RNAStructure3.5RNA二結構預測第35頁Antheprot5.0預測蛋白跨膜區域第36頁Antheprot5.0預測信號肽斷裂點第37頁九、蛋白質二級結構分析Helix,Sheet,Turn,Coil包含：internet網絡。如，ExPASysecondarystructureanalysis

軟件。如，DNAsis,DNAstar,VecotrNTI分析方法：第38頁DNASIS2.5蛋白二級結構預測第39頁DnaStar之Protean對dif14蛋白二級結構預測Bioinformatics