流式細胞儀數據分析5.1數據采集及顯示光信號轉換成電壓脈沖后，再通過模數轉換器轉換成為計算機能夠儲存處理的數字信號。流式細胞儀的數據以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學協會”制定。根據FSC標準，數據存儲格式應包括三個文件：樣本獲取文件，數據設置文件和數據分析結果。4參數〔FSC，SSC，FITC和PE〕的單細胞分析會生成8位數據。當單個樣品累計收集到10000個細胞時，FCS數據文件為80kB。數據采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內收集到的細胞數量〔如圖5-1〕。處在同一通道的每一細胞均符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側信號的熒光強度明顯高于左側，越靠右側熒光亮度越強。圖5-1流式數據分析圖雙參數可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1〔FL1〕，Y軸顯示通道2〔FL2〕。3維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量〔如圖5-1〕。習題：數據采集及顯示1在直方圖中橫軸和縱軸分別表示。2二維點圖用于顯示參數。3在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表。5.2設門通過設門的方法可以定義細胞亞群的區域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設門，其數據結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。圖5-2全血樣本中淋巴細胞亞群的數據分析圖習題：設門1設門的方法通常用于分析樣本內的指定細胞。〔對錯〕5.3細胞亞群的數據分析數據分析包括從點圖中的list-mode文件中顯示數據,然后統計點圖中的細胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用于顯示數據，而且可通過設門的方法區分指定的細胞亞群。如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設門，以單獨分析或分選該亞群細胞。圖5-3選定淋巴細胞亞群設門門內細胞的數據結果可在隨后的圖中顯示。在下面的實例中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。我們可以通過單參數直方圖，二維點圖和三維圖來分析結果。單參數直方圖可定位邊界，二維點圖可設置象限標志。如果需要，還可以建立數據統計表以輸出結果。直方圖可直觀單個參數的細胞數量。陰性對照用于決定直方圖中單參數的左右邊界〔見圖5-4〕。左圖中M1為陰性對照峰。右圖中M2為CD3FITC陽性峰。圖5-4陰性對照峰M1〔NORM001〕和CD3FITC陽性峰M2〔NORM002〕圖5-5的統計結果說明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中M1〔陰性〕細胞619個，M2〔CD3陽性〕細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統計結果為：M2：2272/2891=78.59%。圖5-5直方圖統計結果二維點圖以雙參數顯示結果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用于設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限〔LL〕為雙陰性細胞，左上象限〔UL〕為Y軸陽性細胞〔CD19PE〕，左下象限〔LR〕為X軸陽性細胞〔CD3FITC〕，右上象限〔UR〕為雙陽性細胞〔CD19+/CD3+〕。圖5-6陰性對照組(NORM001)和CD3FITC/CD19PE雙染樣本(NORM002)如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞〔CD19+/CD3+〕的百分含量為：296/2839=10.43%。圖5-7散點圖統計結果另一個分析方法是劃定區域，也就是設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區域〔如圖5-8所示〕；然后統計該區域內指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細胞亞群，其結果為：40/2866=1.40%。圖5-8CD3FITC/CD4PE雙染樣本分析圖圖5-9CD3FITC/CD4PE雙染樣本數據統計結果這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發生變化，這就需要操作者重新調整區域或邊界位置。為防止這種情況的發生，我們采用一種稱為集群分析〔clusteranalysis〕的新方法。BD公司的MultiSETTM和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區域或邊界到相應的細胞亞群位置〔見圖5-10〕。圖5-10使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化比照5.4流式細胞儀的其它應用以及數據分析這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統計結果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20〔從左至右〕。圖5-11單細胞株分析圖除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子〔接合子〕定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數。圖5-12使用QuantiCALC軟件計算每個細胞的抗體結合位點數我們使用ModFitLTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰〔G0/G1期，S期和G2M期〕不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結果。圖5-13細胞周期的DNA直方圖習題：數據分析1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什么？2見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。3LL象限代表雙陽性細胞亞群。〔對錯〕4見圖5-6和圖5-7，淋巴細胞〔CD3+/CD19-〕的百分含量是多少。5只能使用矩形設定細胞區域范圍。〔對錯〕6使用區域設定法分析樣本有哪些缺乏。7防止細胞亞群移動的分析方法是什么。8在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。5.5CellQuest和CellQuestPro軟件使用CellQuest和CellQuestPro軟件是目前運用最為廣泛的流式細胞儀采集及分析軟件。它運行于蘋果電腦上，優質的矢量圖顯示使得操作界面特別優美。現最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuestPro時的強大功能及視覺質感。CellQuest和CellQuestPro軟件主安裝在BDFACSCalibur型流式細胞儀上。1．軟件數據流程在CellQuest和CellQuestPro軟件的數據流分為二個局部：方案和數據包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點圖、設門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關系。可以使用方案進行數據采集或分析以往已有的數據。每個采集方案分析樣本后會生成數據包，該數據包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測參數上的數值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest和CellQuestPro方案文件的圖標CellQuest和CellQuest和CellQuestPro數據文件的圖標CellQuest和CellQuest和CellQuestPro軟件中還會有關于儀器設置的文件，保存所有的實驗條件。它只能由CellQuest和CellQuestPro軟件翻開。數據包必須由方案文件翻開，無法單獨顯示，或者可由第三方軟件進行分析，如WinMDI。2.軟件與儀器的連接流式細胞儀需要加電開啟后會向計算機發出信息，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然后再開啟計算機。先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。在蘋果菜單下點擊CellQuest和CellQuestPro軟件。從Aquire菜單下選擇connettocytometer。3．方案與數據之間的關系CellQuest和CellQuestPro軟件的方案與數據相互獨立保存，數據包可以由任一方案文件進行分析，分析后不改變數據包中的任何數據。CellQuest和CellQuestPro軟件中方案內的直方圖或散點圖有三種狀態：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當圖的屬性為Acquire時，此圖只限于采集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；當圖的屬性為Analysis時，此圖只限于分析已保存的數據包，它不能用于采集數據。當圖的屬性為Acquire-Analysis時，此圖即可用于采集數據也可用于分析已有數據。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為Acquire-Analysis屬性。CellQuestProCellQuest4．方案的建立A選擇實驗參數默認情況下，FACSCalibur流式細胞儀開機后只翻開一根激光器，及五個參數供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當我們要使用第二根激光器及FL4通道時需要勾選FL4的選項，儀器自動翻開633nm激光器。選擇FourColor后，儀器自動選擇FourColor后，儀器自動翻開第二根激光器，且此時FL4可用。B,建立散點圖或直方圖，命名坐標CellQuestPro軟件主要工作界面，軟件類似于Officeword的工作面，可在A4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設立各種門。使用工具條可以建立散點圖、直方圖并在圖上設立各種門。在CellQuest在CellQuestPro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點圖就會出現該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來翻開圖的屬性對話框，其中包括了關于該圖所有選項。建立好直方圖或散點圖后，我們需要對所選的參數進行命名，如不修改軟件自動命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇ParameterDescription，可出現關于文件存儲和參數命名的對話框。在這個對話框中用P字母來代表每個參數，并在此對每個采集參數進行命名，FL1為CD3FITC，FL2為CD4PE……。C,設門并建立門與圖之間的關系在工具欄上有左側幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。在工具欄上有左側幾個按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動門。本處重點介紹Snap-To本處重點介紹Snap-To門，它可根據細胞群體的分布自動調整門的形狀適應細胞群體。R與G的關系R是Region的首個字母，Region一般是指一個閉合形的區域，如矩形區、自由區和圓形區。區域與區域之間可以進行邏輯運算，如AND、OR、NOT等關系。當區域進行運算時軟件引進了算術公式的管理概念：Gate實際了個代數式，簡稱G，其運算式默認如下：G1=R1，或G2=R2當我們要進行邏輯運算時，可變更為G1=R1ANDR2。此時G1就成了一個算術結果了。G1=R1ANDR2G2=R1NOTR2G3=R1ORR2RegionList管理門，可以重命名或刪除門。GateList是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。建立門與圖之間的關系翻開要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話框，選擇Gate選項，選擇門即可。D，顯示統計參數如何編輯這些統計參數選擇統計參數框，在Stats菜單下的EditStatistic如何編輯這些統計參數選擇統計參數框，在Stats菜單下的EditStatistic會變得可用，點出后出現統計參數編輯對話框。選擇任意直方圖或散點圖，在Stats下拉菜單下會有更種統計參數選項。對應于不同的圖出現不同的統計參數。5．儀器的操作當計算機與流式細胞儀聯機后便會出現以下采集控制框：在有關儀器操作所有控制選項框都在Cytometer下拉菜單下，同時按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調取所有控制框：6．文件的保存及調用