PAGE4/8酶法合成阿莫西林介紹β-內(nèi)酰胺抗生素經(jīng)過多年的發(fā)展，己成為抗生素中的最主要類型之一。由于具有良好的抗菌效力，較低的毒副作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，其發(fā)展非常迅速。現(xiàn)全世界耗用量已過萬噸，預(yù)計今后還會增長。其中，青霉素和頭孢菌素為最重要的兩大類β-內(nèi)酰胺抗生素。酶法合成技術(shù)始于20世紀(jì)60年代末70年代初，經(jīng)過30多年的發(fā)展，現(xiàn)在酶縮合反應(yīng)技術(shù)、產(chǎn)品分離以及固定化酶技術(shù)等方面取得很大的發(fā)展，配套技術(shù)日益完善，具備了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。全球著名的β-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)廠家如荷蘭DSM公司已有酶法合成的商品頭孢氨芐、阿莫西林等產(chǎn)品面世。由于酶法應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺抗生素合成，不僅可減少反應(yīng)步驟，而且還可減少廢棄物的產(chǎn)生，有利于保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)異，所含雜質(zhì)極少。因此，21世紀(jì)β-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成將是發(fā)展的必然趨勢。我國酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，與國外先進(jìn)廠家差距較大。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，人們對自身居住環(huán)境的要求，政府對環(huán)保的重視，政府和越來越多的企業(yè)加大“綠色化學(xué)制藥”的研究開發(fā)，特別是加快工業(yè)化生產(chǎn)的推進(jìn)進(jìn)程。酶法產(chǎn)品主要有三大特點：

一是產(chǎn)品含量穩(wěn)定、變化小，可降低制劑在有效期內(nèi)的檢測風(fēng)險，并且雜質(zhì)低，降解速度慢，對制劑的安全性，尤其是特殊制劑的穩(wěn)定性尤為重要。

二是酶法產(chǎn)品生產(chǎn)批量能夠達(dá)到化學(xué)法產(chǎn)品的2～3倍，這既能夠大幅度節(jié)省制劑生產(chǎn)商的檢驗成本，粗略估算原料檢測成本能夠節(jié)約人民幣9元/kg；同時，也便于物流、倉儲和生產(chǎn)管理。

三是酶法產(chǎn)品是通過生物酶一步到位生產(chǎn)而得，以純凈水為介質(zhì)，不使用傳統(tǒng)化學(xué)工藝中的特殊化工原料，有機溶劑的使用量大幅度減少90%，廢水排放減少80%，品質(zhì)更純凈。1青霉素酰化酶的發(fā)展青霉素酰化酶是從微生物或其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素酰化酶的微生物廣泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌(Kluyvera)等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、柑橘黃單胞菌和大腸桿菌,尤以大腸桿菌最為常用。為了獲得廉價高效的青霉素酰化酶,人們對大腸桿菌等進(jìn)行了選育和基因改造,用獲得的大腸桿菌天然或工程菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)而得到所需要的酶。從大腸桿菌或其他微生物獲得的酶可以以游離的形式使用,也可以被固定在載體上制成固定化酶(ImmobilizedEnzyme)使用。與液體酶(酶溶液)相比,固定化酶的主要優(yōu)點是:①酶和反應(yīng)液易于分離,酶可重復(fù)使用。②穩(wěn)定性高于天然酶。③有利于反應(yīng)過程的連續(xù)化和自動化控制。④反應(yīng)液中殘留雜質(zhì)少,有利于產(chǎn)品質(zhì)量控制。⑤產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低廉。從微生物發(fā)酵提純的酶溶液制備固定化酶的方法大致可分為吸附法、包埋法和共價結(jié)合法三大類。共價結(jié)合法具有酶與載體結(jié)合牢固、不易脫離等優(yōu)點,因此應(yīng)用較多。其工藝過程為:濃縮酶溶液在緩沖溶液中與交聯(lián)劑(如戊二醛)和高分子載體進(jìn)行振蕩偶合,然后過濾洗滌得到固定化酶,所得固定化酶因其載體形態(tài)不同大致分為纖維狀和顆粒狀2種。近年來使用顆粒狀固定化酶比較普遍。用做固定化酶載體的高分子材料有:聚丙烯纖維、醋酸纖維、聚氨酯泡沫樹脂、環(huán)氧樹脂、丫內(nèi)酯樹脂等。2青霉素催化內(nèi)酰胺抗生素合成研究酶法合成一內(nèi)酰胺類抗生素可以通過動力學(xué)或熱力學(xué)控制完成。動力學(xué)控制的合成反應(yīng)的產(chǎn)量取決于酶催化的3種不同反應(yīng)的速率：(1)一內(nèi)酰胺類化合物的合成反應(yīng)；(2)活化的酰基供體的水解反應(yīng)；(3)合成的抗生素的水解反應(yīng)。反應(yīng)過程中青霉素酰化酶同樣具有水解活性，通過固定生物催化劑，選擇適宜的溶劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，提供高濃度的活化側(cè)鏈供體及一內(nèi)酰胺核等一系列條件可以減少水解反應(yīng)。合成過程涉及適宜的親核試劑(如6一氨基青霉烷酸、7一氨基頭孢霉烷酸、7一氨基脫乙酰氧頭孢霉烯酸)，在低pH值條件下的直接酰化作用。低pH值條件下，大多數(shù)底物以非解離狀態(tài)存在，有利于合成，因此采用水／有機溶劑混合溶劑減少了離子化形式的底物，從而有助于一內(nèi)酰胺抗生素的合成。Fernandez等在含50％(體積分?jǐn)?shù))的有機溶劑的非常規(guī)介質(zhì)中，利用來自于E．coli及Kluyveracitrophila的固定化青霉素G酰化酶成功地合成了抗生素。然而，有機溶劑對酶有一定的抑制作用，從而使酶的活性降低。目前的解決方法主要是利用固定化技術(shù)增強酶在不利介質(zhì)中的穩(wěn)定性，如將酶共價結(jié)合到載體上，使其穩(wěn)定性大大提高。當(dāng)存在高濃度的有機助溶劑時，在固定化酶分子周圍人工建立一個微環(huán)境可以增強酶的穩(wěn)定性，并使酶活性損失最小。圖1.1酶法合成阿莫西林反應(yīng)路線圖2、反應(yīng)機理據(jù)文獻(xiàn)報道，大腸桿菌青霉素G酰化酶催化合成阿莫西林的機理如下，首先具有活性的Serβ∶Oγ羥基親核進(jìn)攻對羥基苯甲酸酯上的羰基碳原子，形成一種四面體結(jié)構(gòu)的反應(yīng)中間體，由于兩個氨基酸的氫鍵作用使得氧負(fù)離子空穴穩(wěn)定。當(dāng)釋放甲醇，羰基復(fù)原后形成共價的酰基-酶復(fù)合體中間體。在接下來的步驟中，酰基與6-APA中的氨基結(jié)合生成酰胺鍵，合成阿莫西林，酶復(fù)原，當(dāng)然若酰基與水中的羥基結(jié)合，則生成羧基，即發(fā)生對羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)生成對羥苯甘氨酸[9]。從反應(yīng)的歷程可以推測，在進(jìn)行阿莫西林的合成過程中，對羥苯甘氨酸甲酯的水解反應(yīng)是不可避免的，只能是通過改變其它條件盡可能降低水解反應(yīng)的速率，進(jìn)而降低側(cè)鏈酯的消耗，當(dāng)然最根本的還是通過酶特性的改進(jìn)，改善S/H值。具體反應(yīng)歷程見圖1.2圖1.2酶法合成阿莫西林反應(yīng)機理參考文獻(xiàn)[1]Influenceof6-aminopenicillanicacidonamoxicillinsynthesisandp-hydroxyphenylglycinemethylesterhydrolysisBiocatalysisandBiotransformation2005,23(2)[2]AKineticStudyofSynthesisofAmoxicillinUsingPenicillinGAcylaseImmobilizedonAgarose[3]Mathematicalmodelingofbatchandsemibatchreactorsfortheenzymicsynthesisofamoxicillin[4]UseofneuralnetworksinthemathematicalmodellingoftheenzymicsynthesisofamoxicillincatalysedbypenicillinGacylaseimmobilizedinchitosan,WorldJourrnalofMicrobiology&Biotechnology,24(9),1761-1767;2008[5]Processforpreparationofβ-lactamsatconstantlyhighconcentrationofreactantsUS6048708[6]酶法阿莫西林質(zhì)量研究，河北化工，2008，31（4）生物酶反應(yīng)常溫生物酶反應(yīng)常溫結(jié)晶分離干燥水6-APA側(cè)鏈阿莫西林水溶液阿莫西林

工藝路線簡述：將水、側(cè)鏈活性酯（或酯的鹽酸鹽）和6-APA加入反應(yīng)罐，在固定化酶的作用下，反應(yīng)生成阿莫西林。反應(yīng)過程中，以氨水/鹽酸控制pH。反應(yīng)完畢，將分離出的固體阿莫西林及反應(yīng)液混勻、加鹽酸溶解過濾，加氨水進(jìn)行等電點結(jié)晶。將濕晶進(jìn)行分離、洗滌、干燥、混粉、磨粉、檢驗、包裝（出口產(chǎn)品可干壓加工成重粉）得成品。1.3酶的實驗技術(shù)現(xiàn)狀和發(fā)展歷程

青霉素酰化酶是從微生物或其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一類具有特定活性的蛋白質(zhì)。能夠產(chǎn)生青霉素酰化酶的微生物廣泛分布于細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母中,如:醋酸桿菌、假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、黃單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枝狀桿菌、克氏梭菌(Kluyvera)等,其中常用的有巴氏醋酸桿菌、糞產(chǎn)堿菌、巨大芽孢桿菌、柑橘黃單胞菌和大腸桿菌,尤以大腸桿菌最為常用。為了獲得廉價高效的青霉素酰化酶,人們對大腸桿菌等進(jìn)行了選育和基因改造,用獲得的大腸桿菌天然或工程菌株進(jìn)行工業(yè)化生