第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第3章基因工程選修三問(wèn)題探討我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。棉花在種植過(guò)程中，常常會(huì)受到一些害蟲(chóng)的侵襲，其中以棉鈴蟲(chóng)最為常見(jiàn)。如何能培育出自身就能抵抗蟲(chóng)害的棉花新品種呢？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花問(wèn)題探討培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程蘇云金桿菌普通棉花（無(wú)抗蟲(chóng)特性）棉花細(xì)胞抗蟲(chóng)棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定Bt基因目的基因的篩選與獲取1基因表達(dá)載體的構(gòu)建2目錄將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5習(xí)題檢測(cè)6目的基因的檢測(cè)與鑒定41.闡明基因工程的原理和基本操作程序。2.嘗試進(jìn)行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。一、學(xué)習(xí)目標(biāo)二、重點(diǎn)1.基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟。利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因。三、難點(diǎn)2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定。目的基因的篩選與獲取1目的基因的篩選與獲取1一、目的基因的篩選在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。1.目的基因習(xí)題鞏固

當(dāng)Bt抗蟲(chóng)蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲(chóng)腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲(chóng)死亡。1.Bt抗蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)原理？2.抗蟲(chóng)棉中的Bt抗蟲(chóng)蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體，因此，Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。一、目的基因的篩選蘇云金桿菌制成殺蟲(chóng)劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲(chóng)蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因目的基因的篩選與獲取1一、目的基因的篩選2.篩選合適的目的基因

從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。2.篩選合適的目的基因測(cè)序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）序列比對(duì)工具（如BLAST）測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的工具。通過(guò)比對(duì)識(shí)別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段DNA片段基因1基因2基因3放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。非編碼區(qū)：不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段。基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)1.原核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游連續(xù)的、不間隔的RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。啟動(dòng)子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因上游基因的結(jié)構(gòu)1.原核生物的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子連續(xù)的、不間隔的終止轉(zhuǎn)錄。終止子本質(zhì)：位置：作用：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因下游基因的結(jié)構(gòu)2.真核生物的基因結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游間隔的、不連續(xù)的內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。基因的結(jié)構(gòu)2.真核生物的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子轉(zhuǎn)錄初級(jí)RNA成熟mRNA剪切、拼接基因的結(jié)構(gòu)原核生物真核生物不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都有能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼非編碼序列=非編碼區(qū)原核基因非編碼序列真核基因=非編碼區(qū)+內(nèi)含子目的基因的篩選與獲取1二、目的基因的獲取方法3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1.從基因文庫(kù)中獲取2.通過(guò)DNA合成儀直接合成1.從基因文庫(kù)中獲取（1）基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。1.從基因文庫(kù)中獲取（2）基因文庫(kù)的類型基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（主要是cDNA文庫(kù)）①基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段該生物基因組文庫(kù)每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體1.從基因文庫(kù)中獲取含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。②cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)中的基因含有啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子，cDNA文庫(kù)中的基因不含以上結(jié)構(gòu)。與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶某一發(fā)育時(shí)期質(zhì)粒質(zhì)粒cDNA片段逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入細(xì)菌中逆轉(zhuǎn)錄cDNAmRNAcDNA文庫(kù)細(xì)胞基因組DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA片段導(dǎo)入細(xì)菌中基因組文庫(kù)二、目的基因的獲取方法1.從基因文庫(kù)中獲取文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以習(xí)題鞏固1.下列關(guān)于cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說(shuō)法中，不正確的是(

)A.cDNA文庫(kù)中只含有某種生物的部分基因，

基因組文庫(kù)中含有某種生物的全部基因B.如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因

與該生物的基因組文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同，

則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)也完全相同C.cDNA文庫(kù)中的基因沒(méi)有啟動(dòng)子D.一種生物的cDNA文庫(kù)可以有許多種，但基因組文庫(kù)只有一種B目的基因的篩選與獲取1二、目的基因的獲取方法2.通過(guò)DNA合成儀直接合成（1）前提（2）方法基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成2.通過(guò)DNA合成儀直接合成反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA目的基因的篩選與獲取1二、目的基因的獲取方法3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR是一項(xiàng)根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與

，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.解旋：在ATP的驅(qū)動(dòng)下，解旋酶將DNA雙螺旋的兩條鏈解開(kāi)。CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程2.定序：游離的脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則隨機(jī)地與兩條母鏈

的堿基配對(duì)，確定子鏈的脫氧核苷酸排列順序。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT形成氫鍵體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT3.合成子鏈：在DNA聚合酶的催化下從子鏈的5'端把子鏈的脫氧

核苷酸聚合成脫氧核苷酸鏈。合成方向：子鏈的5'端→3'端形成磷酸二酯鍵ACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATP體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程4.形成子代DNA分子：每條新鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程（2）體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR的原理DNA半保留復(fù)制引物3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′端

引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)子鏈合成需要引物引物

引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個(gè)核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。什么是引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵-5′3′-引物5′--3′5′--3′引物3′--5′（3）體外DNA復(fù)制所需的基本條件耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

腺嘌呤核糖PPP~~腺苷三磷酸（ATP）A-P~P~P

腺嘌呤核糖核苷酸(AMP）腺苷二磷酸（ADP）腺苷（A)OHOH腺苷三磷酸脫氧核苷三磷酸dATP

腺嘌呤脫氧核苷酸dADP腺苷（A)

腺嘌呤脫氧核糖PPP~~OHH在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。參與的組分在PCR的作用目的基因DNA4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)引物緩沖液Mg2+高溫使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（兩種）打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈維持反應(yīng)體系的pH激活DNA聚合酶的活性（3）體外DNA復(fù)制所需的基本條件（3）體外DNA復(fù)制所需的基本條件耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸引物（2種）待擴(kuò)增DNA片段5’5’含Mg2+的緩沖溶液第1步：變性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′當(dāng)溫度超過(guò)90℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈。95℃（4）PCR的過(guò)程3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因5

′-3

′--3

′-5

′5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復(fù)性

當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。50℃長(zhǎng)度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高（4）PCR的過(guò)程思考：復(fù)性的過(guò)程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？

復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開(kāi)的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的

碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。（4）PCR的過(guò)程第2步：復(fù)性5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。72℃（4）PCR的過(guò)程DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增(PCR儀)中自動(dòng)完成。（4）PCR的過(guò)程第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，

即呈_____形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。一倍指數(shù)（4）PCR的過(guò)程5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′（4）PCR的過(guò)程5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。PCR過(guò)程歸納目的基因DNA________后________，____與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以_________為模板在

作用下進(jìn)行_____，即將4種___________加到___________，如此重復(fù)循環(huán)多次。受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNA耐高溫的DNA聚合酶引物的3′端脫氧核苷酸每次循環(huán)一般可以分為_(kāi)____、_____、_____三步。變性復(fù)性延伸變性：加熱至90℃以上，___________________;

復(fù)性：冷卻至

℃左右，引物與單鏈DNA結(jié)合；延伸：加熱至72℃左右，

從引物起始進(jìn)行

互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。雙鏈DNA解聚為單鏈50耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于

之間的DNA序列,使其成指數(shù)倍增加。兩個(gè)引物PCR過(guò)程歸納利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因條件①____：DNA的兩條鏈。②____：分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種小的核酸片段。③原料：A、T、G、C四種__________。④酶：

酶。⑤其他條件：需要一定的

溶液和能?chē)?yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。模板引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合緩沖由于延伸后得到的_____又可以作為下一個(gè)循環(huán)的_____，

因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，

即呈_____形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。產(chǎn)物模板一倍指數(shù)比較細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR技術(shù)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制場(chǎng)所主要在細(xì)胞核內(nèi)酶解旋酶、DNA聚合酶等溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件結(jié)果合成整個(gè)DNA分子聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端合成子鏈DNA在高溫下變性解旋全部解旋后再?gòu)?fù)制細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))耐高溫的DNA聚合酶控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行擴(kuò)增特定的DNA片段或基因習(xí)題鞏固1.延伸時(shí)需要加入兩種引物，原因是:

DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。2.兩種引物的要求：①引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；②引物5'端可以修飾，3'端不可修飾；③引物長(zhǎng)度不宜過(guò)短，防止引物隨機(jī)結(jié)合。PCR引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增高效性。1.引物設(shè)計(jì)需考慮的兩個(gè)因素?cái)U(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物特異性：只擴(kuò)增出目標(biāo)DNA的特性高效性：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量特異性太強(qiáng)，擴(kuò)增效率就會(huì)下降提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增特異性就會(huì)下降PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則（1）引物長(zhǎng)度

一般在15-30堿基之間。過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，

不適于Taq酶進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)短特異性差。（2）引物G-C含量一般在40%~60%之間，G-C含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。2.引物設(shè)計(jì)的原則（4）復(fù)性溫度復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。

如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高復(fù)性溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低復(fù)性溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的復(fù)性溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的復(fù)性溫度是一樣的。（3）引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間配對(duì)結(jié)合，從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。2.引物設(shè)計(jì)的原則引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，加標(biāo)記熒光，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3'端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。（5）引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則①引物長(zhǎng)度要適宜②引物G-C含量要適宜③引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列④引物5'端可以修飾，3'端不可修飾⑤復(fù)性溫度要適宜設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡:擴(kuò)增特異性和高效性。（5）PCR產(chǎn)物鑒定3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來(lái)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。較小的DNA片段在凝膠中的移動(dòng)相對(duì)容易，較大的DNA片段移動(dòng)難。

當(dāng)電泳結(jié)束時(shí)，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（標(biāo)準(zhǔn)），這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。習(xí)題鞏固3.在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是（）A.化學(xué)合成法

B.基因組文庫(kù)法C.cDNA文庫(kù)法

D.聚合酶式鏈反應(yīng)D習(xí)題鞏固4.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是（）①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③逆轉(zhuǎn)錄法

④通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④

B．①②③

C．②③④ D．②③D習(xí)題鞏固5.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說(shuō)法，不正確的是(

)A.PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B.PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制C.利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是

要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D.PCR擴(kuò)增中需要解旋酶解開(kāi)雙鏈DNADPCR相關(guān)計(jì)算長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)211引物A引物B擴(kuò)增一次PCR相關(guān)計(jì)算中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)2長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)233擴(kuò)增兩次PCR相關(guān)計(jì)算中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)4長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)277短鏈-短鏈DNA______個(gè)2出現(xiàn)完整的目的基因

擴(kuò)增三次PCR相關(guān)計(jì)算中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)6長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)21515短鏈-短鏈DNA______個(gè)8擴(kuò)增四次PCR相關(guān)計(jì)算擴(kuò)增次數(shù)1次2次3次4次n次DNA總數(shù)212223242n長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A(或B)的DNA20022240226822(n-1)2n-2n137152n-1PCR相關(guān)計(jì)算一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），通過(guò)PCR擴(kuò)增n次：①子代DNA分子數(shù)為：___個(gè)②子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__個(gè)③子代含有的目的基因數(shù)目：_____個(gè)④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個(gè)⑤復(fù)制過(guò)程中共需引物_______個(gè)⑥第n次復(fù)制需要引物___個(gè)2n22n-12n＋1-22n2n-2n習(xí)題鞏固6.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下就可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如下圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第⑤種DNA分子有()A.8個(gè)B.6個(gè)C.4個(gè)D.2個(gè)A習(xí)題鞏固圖中引物中為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為_(kāi)_______。15/167.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基本因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。PCR相關(guān)應(yīng)用擴(kuò)增目的基因檢測(cè)目的基因產(chǎn)生突變基因用模板DNA和目的基因相關(guān)引物擴(kuò)增用待測(cè)DNA和相關(guān)引物擴(kuò)增有擴(kuò)增產(chǎn)物則含有目的基因無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物則不含目的基因可在引物中或引物的5`端引入突變序列產(chǎn)生大量目的基因產(chǎn)生大量突變基因PCR的應(yīng)用習(xí)題鞏固8.SRY—PCR是對(duì)移植前的胚胎進(jìn)行性別鑒定的技術(shù)。以Y染色體上SRY基因（性別決定基因）的一段序列作引物，用被測(cè)胚胎DNA作_____進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)SRY基因序列設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度一般為20～24個(gè)核苷酸，其不宜過(guò)短的原因主要是__________________。兩種引物中G＋C的含量相差不宜過(guò)大，原因主要是________________________________。防止引物隨機(jī)結(jié)合C、G含量差別大，低溫復(fù)性難統(tǒng)一模板習(xí)題鞏固9.用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。RNA鏈

DNA鏈

mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建2基因表達(dá)載體的構(gòu)建2獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？不是。游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。一、基因表達(dá)載體的作用1.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在且遺傳給下一代;2.使目的基因在受體細(xì)胞中能夠表達(dá)且發(fā)揮作用。基因表達(dá)載體的構(gòu)建2二、基因表達(dá)載體的組成質(zhì)粒標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的作用。位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來(lái)。供目的基因插入載體中便于重組DNA的篩選能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上基因表達(dá)載體與基因克隆載體基因克隆載體必須具備的條件標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)基因表達(dá)載體必須具備的條件基因表達(dá)載體插入的目的基因中必須含有能轉(zhuǎn)錄出完整的起始密碼子、終止密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列。基因表達(dá)載體的構(gòu)建2三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建流程同種限制酶或同尾酶或兩種酶DNA連接酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒重組DNA分子限制酶限制酶目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建流程目的基因

基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。啟動(dòng)子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子注意事項(xiàng)1.基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了

。

2.目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：習(xí)題鞏固1.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是()A.啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼B.啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，

對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C.標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A啟動(dòng)子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的比較

項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過(guò)程的結(jié)束習(xí)題鞏固2.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，

錯(cuò)誤的是(

)A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同B將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞3一、常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1.植物細(xì)胞：2.動(dòng)物細(xì)胞：3.微生物細(xì)胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差別。花粉管花粉粒柱頭花柱子房胚囊卵細(xì)胞胚珠精子二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1.植物細(xì)胞（1）花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液

直接注入子房中。②可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。（1）花粉管通道法優(yōu)點(diǎn)①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進(jìn)

入胚囊，此時(shí)的受精卵未形成細(xì)胞壁，且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導(dǎo)再生植株

的全套人工培養(yǎng)過(guò)程。受精卵受體細(xì)胞二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1.植物細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的

微生物，能在自然條件下感染

雙子葉植物和裸子植物，而對(duì)

大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。②當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類化合物，

吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞的DNA上。采用最多表現(xiàn)出新性狀的植物含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入

內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持

和

的過(guò)程。受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)

此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

__________插入Ti質(zhì)粒的________中形成重組Ti質(zhì)粒重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入__________轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞目的基因插入植物細(xì)胞中的________________上目的基因在植物細(xì)胞中穩(wěn)定存在并__________表達(dá)目的基因T-DNA農(nóng)桿菌染色體DNA（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法兩次拼接①第一次拼接：②第二次拼接(非人工操作)：目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

①第一次導(dǎo)入：②第二次導(dǎo)入(非人工操作)：（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與

農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，

并再生成植株；②可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌

的溶液一段時(shí)間，然后培植植株并

獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受體細(xì)胞為_(kāi)______體細(xì)胞受體細(xì)胞為_(kāi)______受精卵（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法習(xí)題鞏固1.研究人員將兩個(gè)抗蟲(chóng)基因(T)導(dǎo)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。那么兩個(gè)抗蟲(chóng)基因在染色體上隨機(jī)整合有幾種情況？轉(zhuǎn)兩個(gè)T基因普通棉花細(xì)胞有三種情況，如下圖所示。2.若甲、乙、丙三種植株自交，其后代抗蟲(chóng)與不抗蟲(chóng)的比例為多少？甲自交→全為抗蟲(chóng)乙自交→抗蟲(chóng)：不抗蟲(chóng)=3:1丙自交→抗蟲(chóng)：不抗蟲(chóng)=15:1甲乙丙習(xí)題鞏固2.(2023·北京海淀區(qū)模擬)科研人員利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將抗病毒蛋白基因C導(dǎo)入番木瓜，培育出轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜，Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖如圖所示。下列敘述正確的是(

)A.農(nóng)桿菌的T-DNA與番木瓜基因發(fā)生重組B.構(gòu)建重組質(zhì)粒需要限制酶和DNA聚合酶C.含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌具有四環(huán)素抗性D.轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性A習(xí)題鞏固3.(2023·北京民族大學(xué)附中期末)下圖是利用基因工程培育抗蟲(chóng)植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是(

)AA.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀就

表明植株發(fā)生了可遺傳變異B.③侵染植物細(xì)胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲(chóng)基因，

則⑤就表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性狀D.②的構(gòu)建需要限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶參與二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1.植物細(xì)胞（3）基因槍法適用于單子葉植物

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法2.動(dòng)物細(xì)胞——顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達(dá)裁體提純→顯微注射入動(dòng)物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物受精卵受體細(xì)胞習(xí)題鞏固4.為什么受體細(xì)胞選受精卵而不是正常體細(xì)胞？受精卵具有全能性且體積大，易操作；而動(dòng)物體細(xì)胞的全能性受限。如果做轉(zhuǎn)基因植物的話，受體細(xì)胞可以采用植物的體細(xì)胞，因?yàn)橹参锟梢越M培，即便一個(gè)體細(xì)胞也可以讓他發(fā)育成一個(gè)完整的植株，但是如果做轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，那就不能用體細(xì)胞作為受體細(xì)胞，因?yàn)橐ＷC全身上下的細(xì)胞都帶有目的基因，如果已經(jīng)是一個(gè)成熟的個(gè)體，只往它身上的某個(gè)部位比如肝臟細(xì)胞導(dǎo)入基因，就不能保證身體所有細(xì)胞都帶上，所以唯一的受體細(xì)胞就是受精卵。二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法3.微生物細(xì)胞（1）原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)①繁殖快②單細(xì)胞③遺傳物質(zhì)少（2）導(dǎo)入方法——Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化使大腸桿菌處于一種易于吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)

通常沒(méi)有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。（2）導(dǎo)入方法——Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）用原核生物生產(chǎn)胰島素示意圖受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T--DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子二、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法拓展科學(xué)家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。拓展腺病毒載體新冠疫苗的制備將編碼新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因組中，接種后，隨載體增殖，大量所需的抗原得以表達(dá)。習(xí)題鞏固5.將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？

如果這么做，效果會(huì)怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。習(xí)題鞏固6.體細(xì)胞不同，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不相同，

下列受體細(xì)胞與導(dǎo)入方法匹配錯(cuò)誤的是()選項(xiàng)受體細(xì)胞導(dǎo)入方法A棉花細(xì)胞花粉管通道法B大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C羊受精卵顯微注射技術(shù)D小麥細(xì)胞基因槍法B習(xí)題鞏固7.基因工程常用的受體細(xì)胞有（）①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動(dòng)植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④D8.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作

的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（

）A.人工合成基因B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C目的基因的檢測(cè)與鑒定4目的基因的檢測(cè)與鑒定4一、分子水平的檢測(cè)檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。1.檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄3.檢測(cè)目的基因是否翻譯二、個(gè)體水平的檢測(cè)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等一、分子水平的檢測(cè)1.檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞（1）PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板是否擴(kuò)增出目的基因PCR操作電泳操作非轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉陰性對(duì)照Marker1.檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞（2）DNA分子雜交技術(shù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理探針目的基因帶標(biāo)記的基因探針（可以是DNA或RNA），與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。（2）DNA分子雜交技術(shù)1.檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞（2）DNA分子雜交技術(shù)①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA。②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素（熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑）等作標(biāo)記，以此做探針。③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交，若顯示出雜交帶，

表明目的基因已插入染色體DNA中。基因探針：一段帶放射性標(biāo)記的、與目的基因互補(bǔ)的特異核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA，探針的長(zhǎng)度可以包括整個(gè)基因，或基因的一部分。一、分子水平的檢測(cè)2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄（1）RNA分子雜交技術(shù)（2）RT-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因生物提取RNARNA作為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNAPCR操作、電泳是否擴(kuò)增出目的基因一、分子水平的檢測(cè)抗原—抗體雜交技術(shù)3.檢測(cè)目的基因是否翻譯蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲(chóng)蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物放射性檢測(cè)

（雜交帶）過(guò)程：提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)抗體→是否出現(xiàn)雜交帶二、個(gè)體水平的檢測(cè)檢測(cè)目的基因是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀。方法：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定等棉鈴蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)（死亡）轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未侵染上病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常二、個(gè)體水平的檢測(cè)目的基因的檢測(cè)與鑒定41.目的基因的篩選和獲取-前提DNA合成儀合成基因文庫(kù)獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵花粉管通道法(植物)、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動(dòng)物)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物)4.目的基因的檢測(cè)與鑒定-保證分子水平：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個(gè)體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。課堂總結(jié)習(xí)題鞏固1.實(shí)時(shí)熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理是：在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）習(xí)題鞏固A.做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B.RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增C.若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者沒(méi)有感染病毒D.病毒的檢測(cè)還可以檢測(cè)病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原理都是抗原—抗體雜交C到社會(huì)中去1.在實(shí)際種植過(guò)程中，棉鈴蟲(chóng)是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的抗蟲(chóng)性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周?chē)嬖诖罅刻烊槐幼o(hù)所，靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種。到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性和抗蟲(chóng)持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲(chóng)基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲(chóng)基因的表達(dá)量等。（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5一、實(shí)驗(yàn)原理①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。

一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。一、實(shí)驗(yàn)原理2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以

帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著

與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA

分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。③凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈

下被檢測(cè)出來(lái)。2.DNA片段電泳鑒定的原理2.DNA片段電泳鑒定的原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段。2.DNA片段電泳鑒定的原理

在電泳開(kāi)始時(shí)使用低壓有利于條帶清晰，是因?yàn)辄c(diǎn)樣之后樣品內(nèi)分子是胡亂排列的，加上電壓之后才統(tǒng)一方向排列好。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。2.DNA片段電泳鑒定的原理常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。2.DNA片段電泳鑒定的原理

電泳緩沖液類似色素提取的層析液，點(diǎn)樣孔通常位于電極的負(fù)極端，由于DNA分子在緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極端移動(dòng)，從而分離出大小不同的DNA片段。DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對(duì)照DNA來(lái)估計(jì)DNA片段大小。

凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下才能被檢測(cè)出來(lái)。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5二、材料用具1.試劑①無(wú)菌水、瓊脂糖；②電泳緩沖液（TAE或TBE）；③凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；④核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。二、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定2.材料用具（1）試劑①無(wú)菌水、瓊脂糖；②電泳緩沖液（TAE或TBE）；③凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑——溴酚藍(lán)）；④核酸染料（常用核酸染料為EB即溴化乙錠）。二、材料用具2.用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）電泳裝置2.用具推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭微量離心管PCR儀注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5三、方法步驟1.PCR加樣

用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分。材料用量10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL2.離心

待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。

將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。3.擴(kuò)增三、方法步驟3.擴(kuò)增循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。可根據(jù)目的片段長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。三、方法步驟加樣用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分離心待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）擴(kuò)增參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。3.擴(kuò)增①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，

以形成加樣孔。三、方法步驟4.配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。5.制備凝膠②凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。——加樣孔側(cè)連電極負(fù)極。電泳緩沖液用來(lái)維持pH值，使DNA帶負(fù)電荷。三、方法步驟6.電泳加樣

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。凝膠載樣緩沖液類似層析液7.電泳、觀察

接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相四、注意事項(xiàng)1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買(mǎi)，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定5五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取Ｈ绻麛U(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過(guò)低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，

請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。習(xí)題鞏固1.下列利用洋蔥進(jìn)行“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，

正確的是（

）A.將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過(guò)濾，要棄去上清液B.采用體積分?jǐn)?shù)為95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分雜質(zhì)C.用塑料離心管是因?yàn)橛貌Ａщx心管容易破損D.將白色絲狀物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后振蕩，

觀察顏色變化B習(xí)題鞏固2.利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增，下列有關(guān)DNA片段

的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)敘述，錯(cuò)誤的是（

）A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾