關于原核生物的轉錄與調控第2頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉錄

(

transcription

)——生物體以DNA為模板按5’

3’方向合成RNA的過程轉錄RNADNA

第3頁,共60頁，2024年2月25日，星期天參

與

轉

錄

的

物

質：原料:4種NTP

(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA

酶:RNA聚合酶其他蛋白質因子第4頁,共60頁，2024年2月25日，星期天A.原核生物的轉錄一、轉錄概述二、轉錄的基本過程三、大腸桿菌RNA聚合酶四、轉錄的機制第5頁,共60頁，2024年2月25日，星期天一、轉錄概述第6頁,共60頁，2024年2月25日，星期天起始點

(startpoint)：合成第一個RNA堿基的位置，用“+1”表示。啟動子(promoter)：位于轉錄起始點前，和RNA聚合酶結合的一段DNA序列。終止子

(terminator)：使RNA聚合酶終止轉錄的一段DNA序列。轉錄單位

(transcriptionunit)：從啟動子到終止子間的一段DNA序列。基本術語：第7頁,共60頁，2024年2月25日，星期天上游序列：基因中起始點前面的序列，用

“-”

表示下游序列：在起始點后面的序列，用

“+”

表示初級轉錄本：剛轉錄完成的RNA產物轉錄泡：RNA聚合酶與啟動子結合后形成的DNA解旋區。轉錄泡可和RNA聚合酶一起沿DNA鏈移動，RNA合成在轉錄泡內進行。基本術語：第8頁,共60頁，2024年2月25日，星期天轉錄泡的結構當RNA聚合酶沿DNA模板移動時，它打開泡前的DNA雙螺旋（在解鏈點打開），并在復鏈點使DNA復原。轉錄泡的長度隨增長反應階段而異，在12-20bp之間(17bp)，但其中的RNA-DNA雜合雙螺旋區域比這個長度要短(12bp)。第9頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉錄的基本過程1.識別啟動子RNA聚合酶識別啟動子，并在啟動子處結合形成一個“轉錄泡”，轉錄泡內的DNA雙鏈解開，為RNA合成提供模板。轉錄泡有義鏈模板鏈，反義鏈第10頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.轉錄起始a.轉錄起始無需引物。b.流產起始：轉錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈的過程是通過啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區域，新生RNA鏈與DNA模板鏈的結合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導致轉錄重新開始，這一過程稱為流產起始。c.啟動子清除：一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區域，轉錄就進入正常的延伸階段，這一過程稱為啟動子清除。d.通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱，時間越短表明該基因轉錄起始的頻率越高。第11頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.鏈的延伸RNA聚合酶沿DNA模板鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。酶移動時局部解旋DNA；酶經過之后，

DNA又重新形成雙螺旋。第12頁,共60頁，2024年2月25日，星期天4.鏈的終止和釋放當RNA鏈延伸到轉錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態，而RNA聚合酶和RNA鏈都從模板上釋放出來，這就是轉錄的終止。第13頁,共60頁，2024年2月25日，星期天三、大腸桿菌RNA聚合酶1.RNA聚合酶的功能a.RNA合成b.合成起始和終止位點的識別c.確定與DNA結合位點的結合與脫離的時間等第14頁,共60頁，2024年2月25日，星期天核心酶

coreenzyme全酶

holoenzyme

全酶至少含5個亞基：

2、、’、

，是轉錄起始所必需的。

2、和

’亞基組成核心酶，種間基本沒有變化；

因子存在廣泛的種間變異，用于識別不同的啟動子。2.RNA聚合酶的結構第15頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2)

因子的功能：使RNA聚合酶特異性地與啟動子結合。大腸桿菌中最常見的

因子是

70核心酶不能區分DNA的啟動子和其它序列，它與DNA非選擇性結合形成松散型復合體。

因子是通過將核心酶對非特異序列的親和力降低104倍，同時增加其對啟動子的親和力來幫助啟動子識別的。RNA鏈延伸至8-9nt時，

因子會從RNA聚合酶中釋放出來，它可以再與其他核心酶結合重新起始轉錄。第16頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.RNA聚合酶在細胞內的分布形式1)很少有游離的核心酶和全酶2)細胞內

因子數量只有核心酶的30%，因此在任何時刻只有1/3的聚合酶能以全酶的形式存在。第17頁,共60頁，2024年2月25日，星期天四、轉錄的機制1.啟動子識別和轉錄起始1)在RNA聚合酶開始鏈延長前，它與DNA的相互作用經歷了4個階段：a.RNA聚合酶與處于堿基配對狀態的啟動子序列結合形成閉合復合物。b.DNA的初始解旋導致DNA與聚合酶形成開放復合物，這一過程稱為緊密結合。c.進行多次流產起始d.起始成功后，聚合酶釋放

因子，形成聚合酶-DNA-新生RNA的三聚復合物，RNA鏈開始延伸。第18頁,共60頁，2024年2月25日，星期天RNApol是如何發現正確的起點而啟動基因轉錄的呢？第19頁,共60頁，2024年2月25日，星期天1)啟動子的識別取決于共有序列保守性序列：每個啟動子都包括一個能被RNA聚合酶識別的特征DNA序列。共有序列：是根據保守性序列總結出的一種理想序列，它的每一個位置代表了很多實際序列中最經常發現的堿基。典型的啟動子有3個共有序列：-35序列、-10序列和起始點序列-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1Pribnow框Sextama框第20頁,共60頁，2024年2月25日，星期天細菌啟動子有４個保守性特征：轉錄起始點：開始堿基90%是嘌呤，G比A更常見。-10序列：起始點上游一個6bp區，這個六聚體的中心靠近起始點上游的第10堿基對，它的共有序列是TATAAT。-10序列是RNA聚合酶的牢固結合位點，是聚合酶啟動DNA解旋的序列。因此，-10序列可通過影響開放復合物的形成速度而控制轉錄。-35序列：也是一個六聚體，其中心位于-35堿基對處，它的共有序列是TTGACA，是RNA聚合酶的識別位點。-35和-10序列之間的距離十分重要，在90%的啟動子中變動在16和18個堿基之間，兩序列間為17bp時轉錄效率最高。-35序列-10序列起始點TTGACATATAATAC－TG16-18bp5-8bp+1第21頁,共60頁，2024年2月25日，星期天啟動子的突變影響它所控制的基因的轉錄水平而不改變轉錄產物：

下降突變：TATAAT

AATAAT

上升突變：TATGTT

TATATT-35序列的作用是為RNA聚合酶的識別提供信號，而-10序列使復合物由閉合轉化為開放。所以我們可以認為-35序列包括一個識別結構域，而-10序列包括一個解鏈結構域。起始點周圍的堿基序列對起始作用也有影響，起始轉錄區間（+1→+30）影響RNA聚合酶沿啟動子滑動的速度從而影響啟動子的強度。第22頁,共60頁，2024年2月25日，星期天4)

轉錄起始的效率不同啟動子的起始效率有差異。不同啟動子與全酶的結合緊密程度不同，結合的緊密程度與啟動子起始轉錄的效率有關。轉錄起始受調節蛋白控制。啟動子上游序列可能增強啟動子的活性。負超螺旋狀態有利于轉錄起始，是因為負超螺旋結構需較少的自由能，就可使起始復合物中的雙鏈解開。第23頁,共60頁，2024年2月25日，星期天5)特定類型基因的轉錄由不同的

因子控制在細胞中不止一種

因子RNA聚合酶起始一些基因的轉錄需要特殊的

因子不同大腸桿菌

因子識別不同的啟動子在噬菌體中通過

因子的改變控制不同時期基因的表達。第24頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.RNA鏈的延伸a.全酶結合在啟動子后，開始不斷的流產起始，直至移出啟動子區域，才進行鏈的延伸。b.當RNA聚合酶全酶剛結合上DNA時，它覆蓋75-80bp，從-55延伸至+20，在起始階段它保持著這個位置。c.進入鏈延伸階段后，

因子被釋放，RNA聚合酶不再覆蓋-55到-35的DNA，只剩下約60bp被RNA聚合酶所覆蓋。第25頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.

鏈的終止RNA鏈停止增長，并與DNA模板鏈分離。終止子：促進轉錄終止的DNA序列，在RNA水平上通過轉錄出的終止子序列形成莖環結構而起作用。可分為兩類：不依賴于

因子的終止子（內在終止子）依賴于

因子的終止子第26頁,共60頁，2024年2月25日，星期天（1）不依賴于

因子的終止子核心酶可以在沒有任何其它輔助因子的情況下，在某些終點終止，這些位點稱為不依賴于

因子的終止子

。特征：轉錄產物中包含發卡狀的二級結構（7-20bp）和3’末端連續4個或更多的U殘基，發卡莖部結構中富含G-C。第27頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2)依賴于

因子（rho）的終止子需要Rho的存在才能終止反應。特征：在終止點前有一段富含C但缺乏G的區段。這段堿基越長，終止效率越高。第28頁,共60頁，2024年2月25日，星期天

因子：46KD的蛋白，功能形式是六聚體，是RNA聚合酶的一個輔助因子，只在鏈終止時起作用。

因子具有ATPase的活性，結合在終止點上游的RNA新生鏈的某個位置，然后可能沿RNA鏈向RNA聚合酶移動，如果趕上暫停在終止點的RNA聚合酶，合成就終止。如果沒有

因子因子存在，聚合酶暫停在終止子后，又繼續RNA合成。第29頁,共60頁，2024年2月25日，星期天B.原核生物的轉錄調控一、基因表達的調控水平二、轉錄水平的調控－操縱子三、操縱子的一般類型四、乳糖操縱子五、色氨酸操縱子第30頁,共60頁，2024年2月25日，星期天一、基因表達的調控水平1.DNA水平：基因丟失、擴增、重排、甲基化等2.轉錄水平：轉錄起始和轉錄終止的調控。轉錄起始調節是最為經濟的一種方式。3.轉錄后加工水平：RNA初級轉錄本本身可以是調節的目標。例如，它的穩定性與它能否被翻譯有關。4.翻譯水平：和轉錄水平一樣，翻譯水平的調控也包括起始和終止的調控。機體可以在基因表達過程的任何階段進行調控，一般以轉錄水平上的調控為主。第31頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉錄水平的調控－操縱子操縱子是原核生物基因結構、表達和調控的基本形式。一個操縱子包括一個上游的調控區和一個以上的結構基因組成。調控區包含啟動子和操縱基因兩部分。該區控制連鎖在一起的多個基因的轉錄。1.操縱子第32頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.結構基因：編碼蛋白質或RNA產物的任何基因。細菌的結構基因常以基因簇的形式存在。基因簇中基因的編碼產物功能上是相關的。例如，編碼同一代謝途徑中酶的基因常存在于同一基因簇。基因簇中基因能受單一啟動子的共同控制，結果是整簇基因或者都表達或者都不表達。二、轉錄水平的調控－操縱子第33頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：lac基因簇（乳糖操縱子中的三個結構基因）

-半乳糖苷分解酶

-半乳糖苷透性酶硫代半乳糖苷乙酰轉移酶Plac原核生物操縱子中的全部結構基因從同一個啟動子開始轉錄成一個多順反子的mRNA分子。第34頁,共60頁，2024年2月25日，星期天二、轉錄水平的調控－操縱子3.操縱基因：是原核生物的操縱子中調節蛋白的結合位點，為控制結構基因轉錄的DNA序列。4.調節基因：僅指參與其他基因表達調控的RNA和蛋白質的編碼基因。調節基因編碼的調節蛋白通過與DNA上的操縱基因結合而控制結構基因的轉錄，是基因表達調控的關鍵。第35頁,共60頁，2024年2月25日，星期天5.反式作用因子與順式作用元件基因表達的產物（蛋白質或RNA）從合成的場所擴散到目標場所而發揮作用的過程稱為反式作用（trans-acting），此基因表達產物被稱為反式作用因子（trans-actingfactor）

。反式作用因子通常為蛋白質或RNA，其特征為可以從合成地擴散到目標場所發揮作用。二、轉錄水平的調控－操縱子第36頁,共60頁，2024年2月25日，星期天順式作用元件（cis-actingfactor）是指對結構基因表達有調節活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因。順式作用元件通常不編碼蛋白質，多位于基因旁側或內含子中。順式作用（cis-acting）的概念用于任一不轉變為任何其他形式的DNA序列，它只在原位發揮DNA序列的作用，僅影響與其物理上相連的DNA序列的活性。基因活性的調控主要通過反式作用因子（通常是蛋白質）和順式作用元件（通常在DNA上）相互作用而實現。第37頁,共60頁，2024年2月25日，星期天位于轉錄開始和結束位置上的DNA序列如啟動子、終止子都是典型的順式作用元件，能受同一類反式作用因子RNA聚合酶的識別。操縱基因（O）是位于操縱子前端部分的順式作用元件，它能和調節蛋白結合，控制結構基因的轉錄。調節蛋白是調節基因的表達產物，是參與操縱子調節的反式作用因子。第38頁,共60頁，2024年2月25日，星期天6.負調控與正調控負調控：基因的表達處于啟動狀態，但是調節蛋白與操縱基因的結合關閉了基因的表達。第39頁,共60頁，2024年2月25日，星期天正調控：基因的表達處于關閉狀態，調節蛋白與操縱基因結合，結構基因才能表達。第40頁,共60頁，2024年2月25日，星期天7.誘導作用和阻抑作用細菌應答某種特定物質出現而合成特定酶的過程，稱為誘導作用（induction）。大腸桿菌乳糖操縱子是這種機制最好的范例。如果某種小分子物質能夠開啟操縱子的轉錄，這種小分子物質就叫做誘導物（inducer）。誘導物在誘導物－抑制子復合體中使抑制子失去抑制作用。二、轉錄水平的調控－操縱子第41頁,共60頁，2024年2月25日，星期天三、操縱子的一般類型1.誘導型操縱子調節基因（R）組成型表達抑制子與抑制子作用的的小分子物質是誘導物，通常是即將被分解的糖或代謝物。只有當誘導物存在時，抑制子被失活，操縱子才表達，表達的產物(酶)分解該誘導物。利用類似自然誘導物的物質可以誘導基因表達，但不能被酶分解，這類誘導物稱為義務誘導物（安慰誘導物），如IPTG（異丙基-

-D-硫代半乳糖苷）。第42頁,共60頁，2024年2月25日，星期天mRNARPOABCDNARI產物RPOABCDNARmRNA＋IABC不表達RI:

無活性的抑制子表達R:有活性的抑制子無I例如：誘導物存在時：誘導物缺乏時：第43頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.阻遏型操縱子調節基因組成型表達能被輔阻遏物激活的抑制子。和抑制子相互作用的小分子物質是輔阻遏物，通常是合成代謝的末端產物，例如氨基酸。只有當缺乏輔阻遏物時，操縱子才表達；表達產物是合成該輔阻遏物所必需的。三、操縱子的一般類型第44頁,共60頁，2024年2月25日，星期天例如：mRNARPOABCDNAR產物RPOABCDNACo-RmRNAABC不表達表達+Co缺乏輔阻遏物時：輔阻遏物存在時：Co-R:

有活性的抑制子R:無活性的抑制子第45頁,共60頁，2024年2月25日，星期天四、乳糖操縱子1.結構基因：a.乳糖操縱子包括-6000bpofDNA。b.乳糖操縱子（lactoseoperon，lac）的三個結構基因成簇排列，編碼參與β-半乳糖苷（如乳糖）分解代謝所需的三種蛋白質：lacZ編碼β-半乳糖苷酶，lacY編碼β-半乳糖苷透性酶，lacA編碼β-半乳糖苷轉乙酰基酶。第46頁,共60頁，2024年2月25日，星期天lacI基因（調節基因）正好與結構基因相鄰，但它不與結構基因屬于同一轉錄單位，它有自己獨立的轉錄單位，含有自己的啟動子和終止子。lacI編碼可擴散的產物，理論上它不必位于結構基因附近。將lacI基因轉移到其他任何地方都能很好地發揮作用，因此lacI的表達產物屬于反式作用因子。Lac阻抑蛋白的單體結構：包含幾個獨立的結構域第47頁,共60頁，2024年2月25日，星期天lacI基因的表達產物稱為乳糖操縱子阻抑蛋白（lacrepressor）。LacI阻抑蛋白通過與操縱基因結合使Lac操縱子處于不活躍狀態。因此，乳糖操縱子的調控屬于負調控。第48頁,共60頁，2024年2月25日，星期天3.誘導物的添加影響了阻抑蛋白與操縱基因的結合能力，使阻抑蛋白從操縱基因上釋放出來，從而啟動轉錄。第49頁,共60頁，2024年2月25日，星期天乳糖第50頁,共60頁，2024年2月25日，星期天五、色氨酸操縱子色氨酸操縱子的基本特征：5個結構基因，trpE,D,C,B,A。

控制區包括：啟動子，操縱基因，前導序列和弱化子

。

調節基因trpR與操縱基因trpO不連在一起。色氨酸是一個輔阻遏物，與trpR產物構成有活性的抑制復合體。

表達通過阻遏和弱化兩種方式控制。第51頁,共60頁，2024年2月25日，星期天2.阻遏方式Trp操縱基因序列長21bp，是trp阻抑蛋白的作用位點。五、色氨酸操縱子第52頁,共60頁，2024年2月25日，星期天(1)trpE基因前有162個堿