工業微生物的分離與篩選

第一節微生物的自然分布第二節產生抗生素菌株的來源第三節工業微生物的常規分離第四節有用微生物的篩選工業微生物的分離與篩選1第一節微生物的自然分布一土壤中的微生物二水域中的微生物三空氣中的微生物四極端環境中的微生物第一節微生物的自然分布一土壤中的微生物2一土壤中的微生物◆1種類依據在土壤中的數量多少：細菌、放線菌、真菌、藻類、原生動物、病毒◆2數量大約107～108個/克——在固體培養基上生長發育的菌數。

用顯微鏡直接觀察要高3～4倍到102～103倍土壤中大量微生物已成為分離各種抗生素、生理活性物質、酶和氨基酸產生菌的主要來源原因：可以培養的微生物未生長。發育慢或要求特別營養。因此需進行特別培養純種分離研究其性質。一土壤中的微生物◆1種類◆2數量土壤中大量微生物已成為3二水域中的微生物水環境：地球的70%左右由水覆蓋，其中溶解

和懸浮有機、無機物，流動水有氧滲

入可供微生物生長。微生物種類：水中有機物含量多少決定微生物種類。微生物數量：海水中菌數因深度不同有變化。深度增加菌數減少。應用：從海水中分離產生新抗生素、生理活性物質菌株。污水中的活性污泥是重要有用微生物的來源。二水域中的微生物水環境：地球的70%左右由水覆蓋，其中溶解4三空氣中的微生物

環境：不利于微生物生長，所以無固定種類。

種類分布：主要是真菌和細菌，在醫院，公共場所致病菌的數量多。

作用：可迅速全球傳播，對地球上生物繁衍有

一定意義。三空氣中的微生物環境：不利于微生物生長，所以無固定種類5四極端環境中的微生物極端環境：高等動植物不能生長，大多數微生物不能生活的高溫、低溫、強堿、強酸、高鹽、高壓、高輻射、等特殊環境。◆1種類：極端嗜熱菌，最適生長溫度90～105℃，高達110℃

極端嗜冷菌，可在零下70～80攝氏度度生長。

極端嗜鹽菌，新疆鹽湖中的可耐受20～30％的NaCl

極端嗜堿菌，PH9～10

極端嗜壓菌，在深海底，生活壓力7.1～8.1×107Pa四極端環境中的微生物極端環境：高等動植物不能生長，大多數微6◆3應用

開采石油：嗜壓菌產氣增壓降低原油粘度。

生產特殊酶制劑：嗜堿細菌產生的蛋白酶作為洗滌劑的添加劑

環境保護：嗜堿芽孢桿菌產生的木聚糖酶能夠水解木聚糖產生木糖和寡聚糖，可用來處理人造纖維廢物

遺傳工程以及基因技術：從水生棲熱菌中提取耐熱的TaqDNA聚合酶◆2特性都為古細菌。具有不同于一般微生物底遺傳機制、特殊底細胞結構和生理功能。◆3應用◆2特性7

第二節產生抗生素菌株的來源產生抗生素的菌株主要來源于土壤，可在不同的環境（高山、平原、河川、深海、旱地）采集挖掘樣品分離篩選。放線菌細菌霉菌擔子菌第二節產生抗生素菌株的來源產生抗生素的菌株主要來源于土壤8一放線菌◆1鏈霉菌40年代Waksman發現鏈霉素。從土壤簡單分離。在5000個以上的抗生素菌種中，有50％來自放線菌。其中從土壤樣品中分離出來的放線菌中鏈霉菌屬約占90～95％。是分離探索多種新抗生素、新生理活性物質產生菌的主要來源一放線菌◆1鏈霉菌40年代Waksman發現鏈霉素。從土9一放線菌◆2稀有放線菌Rareactinomycetes稀有放線菌：鏈霉菌以外的放線菌。如小單胞菌、諾卡氏菌、游動放線菌、鏈孢囊菌、糖多孢菌。不易形成孢子。少見。常規培養基不能分離。需對不同來源的樣品做預處理。如分離游動放線菌：將混濁土壤水樣傾入培養皿中，后接入花粉進行培養。或采用加溫處理。一放線菌◆2稀有放線菌Rareactinomycete10放線菌產生的主要抗生素鏈霉菌稀有放線菌氨基糖苷類氯霉素鏈霉素環絲氨酸林可霉素新生霉素小單胞菌氨基糖苷類大環內酯類肽類游動放線菌縮酚肽類肽類多烯類諾卡氏菌氨基糖苷類氯霉素鏈孢囊菌氨基糖苷類優勝霉素普拉克托霉素放線菌產生的主要抗生素鏈霉菌稀有放線菌氨基糖苷類小單胞菌游動11二細菌◆1細菌種類：芽孢桿菌屬，假單胞菌屬◆3提取的優缺點培養時間短，對生產有利。但：※易受到噬菌體的侵襲

※易產生粘性強的多糖類◆2產生的抗生素種類:桿菌肽、短桿菌肽、泰樂菌素、粘菌素、多粘菌素E、多肽類10多種已在臨床應用。——防治污染——采用變異菌株二細菌◆1細菌種類：芽孢桿菌屬，假單胞菌屬◆3提取的優12PPT-工業微生物的分離與篩選13三霉菌1產生的抗生素青霉素G、青霉素O、青霉素V、頭孢菌素、灰黃霉素、赤霉素、煙曲霉素、黃青霉素等。可作為篩選放線菌代謝產物的補充。2產生的其它物質生理活性物質——木霉生產免疫抑制劑環孢菌素維生素——棉病囊霉生產核黃素三頂孢霉生產維生素甲原。三霉菌1產生的抗生素2產生的其它物質14四擔子菌分離的抗生素能抗腫瘤、加強免疫——革蘭菌素、小奧得酮、優靈多糖、云芝多糖、竹黃多糖四擔子菌分離的抗生素能抗腫瘤、加強免疫——革蘭菌素、小奧15第三節工業微生物的常規分離對工業微生物的基本要求及其分離途徑從自然界分離微生物的常規方法第三節工業微生物的常規分離對工業微生物的基本要求及其分離途16一對工業微生物的基本要求微生物菌株是發酵生產成敗的關鍵。1菌株應為“純種培養”。鏡檢無其它微生物。且無噬菌體感染。2菌種具穩定的遺傳性。3必須能生長出可再生的單位——營養細胞孢子4種子質量好——各級種子罐的擴大培養要生長迅速、強健。有用微生物必須具備的特性一對工業微生物的基本要求微生物菌株是發酵生產成敗的關鍵。17

5在短時間內可獲得目的產物——3天或更短。

6菌株的自我保護及采取措施——降低PH

高溫生長

加入選擇性抑制劑。

7目的產物多，且在多組分中易分離。

有用微生物必須具備的特性5在短時間內可獲得目的產物——3天或更短。

618二從自然界分離微生物的常規方法1分離培養微生物的常規操作2采樣分離方法3微生物的接種培養方法4純化分離菌種的方法5原生動物和藻類的分離培養二從自然界分離微生物的常規方法1分離培養微生物的常規操作191分離培養微生物的常規操作分離——從存在于自然界的混合菌群里分離出一種微生物，并加以培養。分離研究微生物要在無菌條件下進行。防雜菌污染包括：（1）操作在無菌室、無菌箱、超凈工作臺上進行。使用前用70～75％酒精棉球擦拭。（2）培養容器（試管、培養皿）要事先滅菌。培養時要加蓋。以防污染。（3）接種用具（吸管、接種環）要滅菌（4）接種時塞子或蓋要在火焰上過一下。1分離培養微生物的常規操作分離——從存在于自然界的混合菌群202采樣分離方法（1）從自然界采樣分離培養分離挖土稀釋接種——表面向下5cm，編號記錄——1000～100萬倍——取0.1～0.2ml稀釋液——選用易生長發育的培養基2采樣分離方法（1）從自然界采樣分離培養分離挖土稀釋212采樣分離方法（2）從檢樣分離從檢樣直接分離菌株時，可采取下列方法的任何一種。A把檢樣土直接混合到預先融化的固體培養基中培養。B取稀釋后檢樣的上清液混合到固體培養基中。C把上清液接入液體培養基中培養一定時間再接入固體培養基。D將土樣連續幾次在液體培養基中富集培養后，接入固體培養基中分離。2采樣分離方法（2）從檢樣分離從檢樣直接分離菌株時，可采取223微生物的接種培養方法（3）稀釋平板培養法（定性、定量）加上下面的輔助措施主要適用于厭氧菌的分離培養對絕對厭氧菌的輔助措施培養用培養箱要預先去除氧并密閉3微生物的接種培養方法（3）稀釋平板培養法（定性、定量）加233微生物的接種培養方法（4）厭氧菌的稀釋轉動分離培養法將瓊脂試管加熱溶解冷卻至50℃（保持液態），接種一支試管，轉動混合后取出1/10接入第二支試管，轉動混合后再取出1/10接入第三支試管，依次類推，連續接種6～10支。冷卻凝固。在瓊脂培養基表面傾注一層無菌石蠟，防止空氣中的氧氣進入。3微生物的接種培養方法（4）厭氧菌的稀釋轉動分離培養法將瓊244純化分離菌種的方法挑取首批菌落菌懸液無菌稀釋液稀釋接種到培養皿培養重復上述步驟單孢子分離稀釋轉動培養——挑取一個菌落——取一部分——觀察。必要時所有操作在無菌條件下進行4純化分離菌種的方法挑取首批菌落菌懸液無菌稀釋液稀釋接種到255原生動物和藻類的分離培養單細胞分離：用顯微鏡或解剖鏡觀察控制，從微生物群體中分離出單一種類的微生物個體。

方法：在無菌液體培養基中采用稀釋法分離。取細長吸液管，從菌群中吸取個體原生動物或藻類要求：熟練的操作技術5原生動物和藻類的分離培養單細胞分離：用顯微鏡或解剖鏡觀察26第四節有用微生物的篩選篩選：從自然界某些含有菌群的材料中，用特定的操作程序分離并發現有用的微生物。篩選有用微生物是工業生產過程的第一步。一供篩選分離樣品（采樣）的來源二初篩三復篩四抗菌譜的測定第四節有用微生物的篩選篩選：從自然界某些含有菌群的材料中，27一供篩選分離樣品（采樣）的來源1自然資源分離篩選土壤采樣分離。最理想是山野、農田、沼澤、湖泊、海洋

考慮不同民俗、動植物生態。2已有菌株包括保藏的菌株。變異處理得到新的菌株。一供篩選分離樣品（采樣）的來源1自然資源分離篩選28二初篩（一）目的：得到具有潛在應用價值的目的微生物。初篩

一次或多次從現有菌群中把多數無用的微生物淘汰，把少量有用的微生物篩選出來。（二）要求：快速——有預測或預見敏捷——迅速處理好眾多的樣品。經濟——得到有廣泛目標的有用微生物。二初篩（一）目的：得到具有潛在應用價值的目的微生物。初篩29二初篩（三）篩選方法瓊脂平板培養基上培養生產出群體后初篩。1用PH指示劑檢測有無有機酸或胺類。

中性麝香草酚藍:PH＜6.0黃,PH＞7.6藍,PH6.0~7.0綠2在培養基中加入碳酸鈣檢測有機酸。可在菌群周圍形成清晰的碳酸鈣溶解區。3在培養基中加入底物檢測細胞外酶、酶抑制劑等特定的底物可以與細胞外酶形成顯色反應；酶的反應對特定底物形成溶解或沉淀。二初篩（三）篩選方法瓊脂平板培養基上培養生產出群體后初篩。30（三）篩選方法4各種抗生素產生菌的初篩（1）有代表性的常用試驗菌（一部分是病原菌）。細菌真菌原蟲革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌枯草桿菌八疊球菌肺炎雙球菌產氣桿菌大腸桿菌痢疾桿菌普通變形桿菌黑曲霉產黃青霉煙曲霉菌白色念珠痢疾阿米巴球蟲（三）篩選方法4各種抗生素產生菌的初篩（1）有代表性的常314各種抗生素產生菌的初篩（2）各種抗生素產生菌的初篩采用抑菌圈法，亦稱平板擴散法。杯碟法方法培養菌液溶化的瓊脂48℃混合倒平板放檢樣杯碟培養無菌操作有抑菌圈為陽性反應4各種抗生素產生菌的初篩（2）各種抗生素產生菌的初篩采用32三復篩1微生物初篩鑒定2發酵培養基的選擇3培養與發酵4抽提試驗三復篩1微生物初篩鑒定33三復篩1微生物初篩鑒定

對初篩菌株進行分類——何屬？何種？目的：預知微生物對人、動物或植物是否有致病性。但分類復雜。輕易不作。三復篩1微生物初篩鑒定34三復篩2發酵培養條件及培養基的選擇（1）尋找產生目的代謝產物時的培養條件

適合微生物生長的條件，不一定是目的代謝產物的高產條件。溫度、PH、滲透壓等進行一系列試驗后，找出最適合的條件。三復篩2發酵培養條件及培養基的選擇（1）尋找產生目的代35（2）確定菌株生長發育、產生代謝產物時培養基的組分。菌種不同，發酵培養基不同。2發酵培養條件及培養基的選擇放線菌：碳源以葡萄糖、淀粉為主氮源采用黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏無機鹽氯化物、硫酸鎂、碳酸鈣。細菌：碳源以葡萄糖、檸檬酸鈉為主氮源肉湯、蛋白胨、豆餅粉、酵母膏無機鹽氯化鈉、磷酸二氫鉀，鐵、錳、鎂霉菌：碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖氮源玉米漿、蛋白胨無機鹽磷酸二氫鉀、磷酸氫鉀、鎂、鐵（2）確定菌株生長發育、產生代謝產物時培養基的組分。菌種不同36液體培養基常用組分表放線菌細菌霉菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖、麥芽糖葡萄糖、檸檬酸鈉乳糖、葡萄糖、蔗糖葡萄糖、蔗糖氮源：大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硝酸銨肉湯、蛋白胨、豆餅粉、酵母膏、硫酸銨玉米漿、蛋白胨蛋白胨無機鹽：氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀氯化鈉、磷酸氫二鉀、錳、鐵磷酸氫二鉀、錳、鐵磷酸二氫鉀癌、磷酸氫鉀、錳、鐵液體培養基常用組分表放線菌細菌霉菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀37三復篩3培養與發酵（1）試管培養試管搖床培養。常用。目的：原種斜面培養后，為了提高初篩效率。（2）搖瓶培養（搖瓶發酵）250或500ml錐形瓶再200rpm搖床上培養。目的：培養基和培養條件的初篩。

三復篩3培養與發酵（1）試管培養（2）搖瓶培養（搖瓶發383培養與發酵（3）玻璃自控發酵罐容量5～50L。是搖床向發酵罐的過渡階段。目的：工藝參數、工藝條件的選擇和考察。（4）試驗罐培養中間工業試驗階段目的：放大和驗證搖床試驗結果，積累發酵工藝規律和發酵參數。為工業規模生產打基礎3培養與發酵（3）玻璃自控發酵罐（4）試驗罐培養393培養與發酵（5）發酵試驗的三個階段3培養與發酵（5）發酵試驗的三個階段40三復篩4抽提試驗采取適當方法把發酵的目的代謝產物抽提出來。有四種方法：（1）溶媒抽提（2）用活性炭抽提（3）用樹脂吸附洗脫（4）從菌絲體浸出抽提三復篩4抽提試驗采取適當方法把發酵的目的代謝產物抽提出來41（1）溶媒抽提方法：選三個不同的且與水不能混合的溶媒，