關于遺傳變異的概念及物質基礎第八章微生物的遺傳變異和育種生物體最本質的屬性之一。遺傳，講的是親子間的關系，指生物的上一代將自己的一整套遺傳因子傳遞給下一代的行為或功能，它具有極其穩定的特性。變異：指生物體遺傳物質結構或數量的改變，即遺傳型的改變。第2頁,共151頁，2024年2月25日，星期天微生物與遺傳學研究：個體結構簡單；營養體多為單倍體；易于在成分簡單的合成培養基上生長繁殖；繁殖速度快；易于累積不同的最終代謝產物及中間代謝物；菌落形態特征的可見性與多樣性；環境條件對各個體作用具有直接性和均一性；易于形成營養缺陷型；一般都有相應的病毒；存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式等。研究現代遺傳學和重要的生物學基本理論問題，微生物是最佳材料和研究對象。第3頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第一節遺傳變異的概念及物質基礎一、基本概念（一）、遺傳型、基因型：某一生物個體所含有的全部遺傳因子（基因的總和）。具有某遺傳型的生物只有在適當的環境條件下，通過自身的代謝和發育，才能將它具體化，即產生表型。----------代謝----

遺傳型+環境條件------->表型

--------------發育----第4頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基本概念（二）、表型：某一生物體所具有的一切外表特征及內在特性的總和，是遺傳型在合適環境下的具體體現。表型是一種現實性。第5頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基本概念（三）、變異：在某種外因或內因的作用下，生物體遺傳物質結構或數量的改變，即遺傳型的改變。變異特點：在群體中以極低的幾率(一般為10-5～10-10)出現；性狀變化的幅度大；變化后的新性狀是穩定和可遺傳的。第6頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基本概念（四）、飾變：不涉及遺傳物質結構改變而只發生在轉錄、翻譯水平上的表型變化。飾變特點：整個群體中每一個體都發生同樣變化；性狀變化的幅度小；飾變性狀不遺傳。例如，粘質沙雷氏菌25℃培養，產生深紅色靈桿菌素，把菌落染成鮮血似的(因此過去稱它為“神靈色桿菌”或“靈桿菌”)；37℃時，群體中所有個體都不產色素。重新降溫至25℃，所有細胞產色素能力又可以恢復。第7頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、證明核酸是遺傳變異

物質的經典實驗（一）、轉化實驗

（二）、噬菌體感染實驗

（三）、植物病毒的重建實驗

第8頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）轉化實驗英，F.Griffith，1928年研究肺炎鏈（雙）球菌發現轉變現象。肺炎鏈（雙）球菌，球菌，成雙或成鏈，致人肺炎、小鼠敗血癥。有許多不同菌株，有莢膜者具致病性，菌落表面光滑，稱S型；有的不形成莢膜，無致病性，菌落外觀粗糙，稱R型。第9頁,共151頁，2024年2月25日，星期天F.Griffith的三組試驗：1、動物試驗：小白鼠體內加入活R菌或死S菌，小白鼠活；小白鼠體內加入活S菌，小白鼠死；小白鼠體內加入活R菌和熱死S菌，小白鼠死，抽心血分離，發現有活的S型細胞－轉化現象。2、細菌培養試驗：熱死S菌在培養皿中培養，不生長；活R菌在培養皿中培養，長出R菌；熱死S菌和活R菌在培養皿中培養，長出大量R菌和10-6S菌。3、S型菌無細胞抽提液試驗：活R菌加S菌的無細胞抽提液，在培養皿中培養，長出大量的R菌和少量的S菌。第10頁,共151頁，2024年2月25日，星期天(a)無毒菌系RII不使白鼠死亡，從鼠體內分離仍得無毒細菌；(b)將SIII加熱殺死，不使白鼠死亡，鼠體內無有毒細菌；(c)混合活RII和加熱殺死的SIII，使白鼠死亡，并在死鼠體內發現活的SIII細胞第11頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）轉化實驗以上實驗說明，加熱殺死的S型細菌，在其細胞內可能存在一種轉化物質，它能通過某種方式進入R型細胞，并使R型細胞獲得穩定的遺傳性狀。第12頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）轉化實驗1944年，美Avery等進行了離體條件轉化實驗。1、從活S菌分離提純各種細胞成分——DNA，RNA，蛋白質，莢膜多糖等。2、將各組分逐個與活R菌混合（①加S菌的DNA；②加S菌的DNA及DNA酶以外的酶；③加S菌的DNA和DNA酶(分解DNA)；④加S菌的RNA；⑤加S菌的蛋白質；⑥加S菌的莢膜多糖），體外培養。3、結果：①、②長出S菌；③、④、⑤、⑥只長R菌。第13頁,共151頁，2024年2月25日，星期天自SIII抽提的DNA與活R菌系細菌混合，少數R細胞轉化成S細胞。加脫氧核糖核酸酶(DNase)可阻止轉化作用第14頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）轉化實驗上述結果說明：S菌DNA將R型轉化為S型。DNA純度越高，轉化效率越高。微量純DNA(6×10-8g)，仍有轉化能力。S菌轉移給R菌的，不是某一遺傳性狀(如莢膜多糖)本身，而是以DNA為物質基礎的遺傳信息。第15頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）噬菌體感染實驗1952，A.Hershey等利用示蹤元素，證明DNA是噬菌體遺傳物質。以放射性32PO3-4或35SO2-4作為磷源或硫源培養E.coli，讓T2噬菌體（只有核酸和蛋白質）感染E.coli

，獲得含32P-DNA核心的噬菌體或含35S-蛋白質外殼的噬菌體。將32P-DNA噬菌體、35S-蛋白質外殼噬菌體分別感染無放射性的E.coli，攪拌離心，觀察。發現DNA是噬菌體遺傳物質。

第16頁,共151頁，2024年2月25日，星期天用含32PDNA(核心)的噬菌體作感染實驗第17頁,共151頁，2024年2月25日，星期天用含35S蛋白質(外殼)的噬菌體作感染實驗第18頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）植物病毒的重建實驗：

1956，美H.Fraenkel-Conrat，TMV（RNA）和HRV（與TMV近緣的霍氏車前花葉病毒）。將TMV放在一定濃度的苯酚溶液中振蕩,使蛋白質外殼與RNA分離。分離的RNA能感染煙草患典型癥狀,病斑中能分離出正常病毒粒子。RNA裸露，缺乏蛋白質衣殼保護，感染頻率低于正常TMV粒子的感染頻率。第19頁,共151頁，2024年2月25日，星期天TMV重建實驗示意圖(粗線箭頭表示遺傳信息的去向)第20頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、證明核酸是遺傳變異

物質的經典實驗通過上述三個經典實驗，確信無疑地得出結論，只有核酸才是貯存遺傳信息的真正物質。

第21頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式（一）、細胞水平：核或核質體（二）、細胞核水平：核內染色體(核基因組)，核外染色體（真核質粒、質體－線粒體、葉綠體；原核質粒：F因子性因子、R因子抗性因子、Col質粒產大腸桿菌素因子、Ti質粒誘癌、巨大質粒固氮、降解性質粒降解復雜物質）（三）、染色體水平：數目，倍數

（四）、核酸水平：DNA，RNA第22頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式（五）、基因水平：具有特定核苷酸順序的核酸片段，具有自主復制能力的最小遺傳功能單位。相對分子量約為6.7×105Da，1000--1500bp(堿基對)，每個細菌一般含有5，000—10，000個基因。第23頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式（六）、密碼子水平：決定3個核苷酸順序（AA）的片斷，遺傳的信息單位。43=64＞20－23，出現一種以上密碼子編碼同一種氨基酸的現象。有些被用作“起讀”(AUG)或“終止”信號(UAA、UGA和UAG)。

（七）、核苷酸、堿基水平：最低突變單位或交換單位（A、G、T、C）。

第24頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式原核生物的基因調控系統是由操縱子（啟動基因、操縱基因、結構基因）和調節基因組成。結構基因決定多肽(酶及結構蛋白)的合成，操縱基因與結構基因緊密連鎖在一起的，控制結構基因轉錄的開放或關閉。啟動基因是轉錄起始部位。調節基因一般與操縱子有一定間隔距離(一般小于100個堿基)，調節結構基因的活動。第25頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式順序：啟動基因－操縱基因－結構基－調節基因關閉轉錄：調節基因轉錄出自己的mRNA,經翻譯產生阻遏蛋白,識別并附著在操縱基因上，相互作用使DNA雙鏈無法分開，阻擋RNA聚合酶沿著結構基因移動。啟動轉錄：阻遏蛋白從操縱基因上解除；依賴于DNA的RNA多聚酶附著在啟動基因上，通過操縱基因，沿著結構基因移動，轉錄mRNA。

第26頁,共151頁，2024年2月25日，星期天三、遺傳物質在細胞中的存在方式真核生物的基因：沒有操縱子結構，存在不編碼序列和重復序列，轉錄與翻譯有空間分隔，基因之間被許多無編碼功能的內含子阻隔。第27頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒cccDNA：游離于染色體外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環狀DNA分子。1984，天藍色鏈霉菌等，發現線形質粒。某些質粒具有與核染色體整合和脫離的功能，如F因子，稱“附加體”。分子量一般在106～108Da，大小約為1%核基因組。攜帶染色體上沒有的基因，賦予某些特殊功能，例如接合、產毒、抗藥、固氮、產特殊酶或降解有毒物質等。質粒消失不會造成菌體死亡。

第28頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒質粒復制與核染色體同步，稱“嚴緊型復制控制”，細胞一般含1～2個質粒；不同步，稱“松弛型復制控制”，一般含10～15個或更多。質粒之間及質粒與核染色體之間可以發生重組。少數質粒可以在不同菌株間發生轉移，如F、R等。遇吖啶類染料、絲裂霉素C、紫外線、利福平、重金屬離子或高溫等因素，可使子代細胞中質粒消失。第29頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（一）、F因子、致育因子或性因子：E.coli等細菌中決定性別。約等于2%核染色體DNA的小型cccDNA。分子量為6.2×107Da，94.5kb（千堿基對），其中有1/3的基因與接合作用有關。第30頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（二）、R因子、R質粒：多數由相連的兩個DNA片段組成。其一稱RTF質粒(抗性轉移因子)，含有調節DNA復制和拷貝數的基因及轉移基因，有時還有四環素抗性基因。11×106Da。其二為r質粒（抗性決定質粒），幾百萬至100×106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、安比西林、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素和磺胺等基因。第31頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一種可通過接合而轉移的R因子的形成

(IS因子是轉座因子，可使RTF質粒和r決定質粒結合)第32頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（三）、Col因子、產大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是E.coli某些菌株分泌的細菌毒素，具有通過抑制復制、轉錄、翻譯或能量代謝等，專一地殺死其他腸道細菌的功能。約4～8×104Da。攜帶Col因子的菌株，由于質粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。第33頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（四）、Ti質粒、誘癌質粒：大型，長200kb。根癌土壤桿菌侵入到雙子葉植物細胞中，Ti質粒片段與植物細胞核染色體組發生整合，破壞控制細胞分裂的激素調節系統，轉變成癌細胞。植物遺傳工程研究的重要載體。外源基因可借DNA重組技術插入到Ti質粒中，進一步整合到植物染色體上，改變遺傳性，培育優良品種。第34頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（五）、巨大質粒：200～300×106Da，比一般質粒大幾十倍至幾百倍。根瘤菌屬中發現，具有一系列固氮基因。第35頁,共151頁，2024年2月25日，星期天四、原核生物的質粒（六）、降解性質粒：可編碼降解復雜物質的酶，利用一般細菌難以分解的物質作碳源。如CAM(樟腦)質粒，OCT(辛烷)質粒，XYL(二甲苯)質粒，SAL(水楊酸)質粒，MDL(扁桃酸)質粒，NAP(萘)質粒和TOL(甲苯)質粒等。僅在假單胞菌屬中發現。第36頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第二節

基因突變與基因重組

突變指遺傳物質的核苷酸順序突然發生了穩定的可遺傳的變化。基因重組指把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過重新組合，形成新遺傳型個體。屬于分子水平雜交。第37頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基因突變

（一）、類型

（二）、特點

（三）、機制

第38頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）基因突變類型按內部結構：1、基因突變（點突變）：一對或少數幾對堿基發生改變。2、染色體畸變：DNA的大段變化(損傷)，表現為插入、缺失、重復、易位和倒位。按表型特征：1、形態突變型：細胞或菌落形態改變。2、生化突變型--代謝途徑發生變異而形態沒有明顯變化。分營養缺陷型、抗性突變型和抗原突變型。第39頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）基因突變類型A、營養缺陷型：基因突變引起代謝過程中某種酶的合成能力喪失，必須在原有培養基中添加細胞不能合成的營養成分才能正常生長。B、抗性突變型：能抵抗有害理化因素，分抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等。C、抗原突變型--細胞成分尤其是細胞表面成分(細胞壁、莢膜、鞭毛)的細微改變而引起抗原性變化。第40頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）基因突變類型3、致死突變型--基因突變導致個體死亡。A、條件致死突變型：突變后，在某種條件下可正常生長、繁殖并實現其表型，而在另一條件下卻無法生長、繁殖。例如，E.coli的某些菌株可在37℃下正常生長，不能在42℃下生長等。B、其他突變型：如毒力、糖發酵能力、代謝產物的種類和產量以及對某種藥物的依賴性等。第41頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）基因突變類型按分離：1、選擇性突變：具有選擇性標記，可通過某種環境條件使它們得到優勢生長,從而取代原始菌株。如營養缺陷型或抗性突變型等。2、非選擇性突變：沒有選擇性標記，只有一些性狀的數量差別。例如菌落大小、顏色深淺及代謝產物量的多少等。第42頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）基因突變特點1、不對應性--突變性狀與原因無直接對應關系。

2、自發性--沒有人為誘變因素，自發產生。

3、稀有性--自變頻率低且穩定，多為10-6～10-9

。

4、獨立性--某一群體中，可發生抗青霉素的突變型，也可發生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性。某一基因的突變，不影響其他基因的突變率。突變對某一細胞是隨機的，對某一基因也是隨機的。第43頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）基因突變特點5、誘變性--誘變劑可提高自變頻率10～105倍。

6、穩定性--遺傳結構突變，新性狀穩定遺傳。7、可逆性--由原始野生型基因變異為突變型基因的過程稱為正向突變，反之稱為回復突變或回變。實驗證明，任何性狀既有正向突變，也可發生回復突變。第44頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制1、誘變機制：顯著提高突變頻率的理化因子，稱為誘變劑。A、堿基對置換：只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，屬于微小損傷，又稱點突變。分為轉換（嘧啶或嘌呤同類更換）、顛換（嘧啶或嘌呤異類更換）。某一種誘變劑，可同時引起轉換與顛換，也可只具一個功能。第45頁,共151頁，2024年2月25日，星期天堿基的置換（實－轉換、虛－顛換）第46頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制直接置換誘變：直接與核酸堿基發生化學反應的誘變劑，不論在機體內或在離體條件下均有作用。種類很多，例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑(硫酸二乙酯、甲基磺酸乙脂、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、N-甲基-N-亞硝基脲、乙烯亞胺、環氧乙酸、氮芥等)。它們可與一個或幾個核苷酸發生化學反應，引起DNA復制時堿基配對的轉換，進一步使微生物發生變異。第47頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制間接置換誘變：通過活細胞的代謝活動使堿基類似物摻入到DNA分子中引起誘變。如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鳥嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等。對休止細胞、游離噬菌體粒子或離體DNA分子不起作用。第48頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制B、移碼突變：誘變劑使DNA分子中一個或少數幾個核苷酸增添(插入)或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發生轉錄和翻譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產生的突變株，稱為移碼突變株。第49頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制C、染色體畸變：某些理化因子如X射線及烷化劑、亞硝酸等，引起DNA的大損傷，包括染色體結構的缺失（基因減少）、重復（基因增加）、插入、易位、倒位（基因排列順序相反）和染色體數目變化。染色體結構變化，分染色體內畸變和染色體間畸變。前者只涉及一條染色體，后者非同源染色體間的易位。第50頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制注意：許多理化誘變劑的誘變作用都不是單一功能的。例如，亞硝酸既能引起堿基對的轉換作用，又能誘發染色體畸變；一些電離輻射也可同時引起基因突變和染色體畸變。

第51頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制2、自發（沒有人工參與所發生）突變機制：A、背景輻射和環境因素的誘變：不少“自發突變”實質上是一些原因不詳的低劑量誘變因素長期綜合誘變導致。例如，充滿宇宙空間的各種短波輻射或高溫誘變效應，以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質(在微環境中有時也可能是高濃度)的作用等。第52頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制B、自身代謝產物的誘變：過氧化氫是普遍存在于微生物體內的一種代謝產物。對脈孢菌有誘變作用，加入過氧化氫酶可降低這種作用。如果在加入該酶的同時又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。說明過氧化氫很可能是“自發突變”中的一種內源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養物中易出現自發突變株，可能也是同樣原因。第53頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制C、互變異構效應：DNA鏈中，T以烯醇式出現，復制時，其相對位置不再是A，而是G；C以亞氨基形式出現，就和A配對，使基因發生突變，造成自發突變。堿基對發生自發突變的幾率約為10-8～10-9。第54頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（三）基因突變機制D、環出效應：DNA復制中，如果其中某一單鏈上偶而產生一個小環，則會因其上的基因越過復制而發生遺傳缺失，從而造成自發突變。第55頁,共151頁，2024年2月25日，星期天環出效應設想圖：復制時，上鏈標記B處發生“環出”，只有A及C獲得復制，從而發生自發突變。在下鏈中,復制正常進行。第56頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、基因重組

（一）、原核微生物的基因重組：轉化、轉導、接合、原生質體融合

（二）、真核微生物的基因重組：有性雜交

、準性生殖--

第57頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組1、轉化與轉染：受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換，整合到自己的基因組中，從而獲得供體菌的部分遺傳性狀的現象稱轉化。轉化后的受體菌，稱為轉化子。來自供體的DNA片段稱為轉化因子，一般是雙鏈DNA片段。第58頁,共151頁，2024年2月25日，星期天轉化過程示意圖

第59頁,共151頁，2024年2月25日，星期天G＋肺炎雙球菌的轉化過程

①吸附：雙鏈

DNA片段與感受態（受體菌最易接受外源DNA片段并實現轉化的生理狀態）受體菌細胞表面的特定位點(主要在新形成細胞壁的赤道區)結合，膽堿可促進這一過程；②酶解：吸附的DNA被核酸內切酶分解，形成平均分子量4～5×106的DNA片段；③進入：一條單鏈被膜上另一種核酸酶切除，另一條單鏈耗能后逐步進入細胞。分子量＜5×105的DNA片段不能進入細胞。低濃度溶菌酶處理，提高細胞壁通透性，可提高轉化頻率；第60頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組④轉化：進入的單鏈與受體菌染色體組上的同源區段配對，接著受體染色體組的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA所交換和取代，形成雜合DNA區段(它們間的DNA順序不一定互補，故可呈雜合狀態)；⑤復制：染色體組復制，雜合區段分離成兩個，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。細胞分裂后，該染色體發生分離，形成1個轉化子。第61頁,共151頁，2024年2月25日，星期天轉化中單鏈外基因組片段與雙鏈內基因組間的交換與整合過程示意圖

第62頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組轉染：抽提噬菌體或其他病毒的DNA(或RNA)，感染感受態的宿主細胞，產生正常的噬菌體或病毒后代的現象。與轉化不同之處：病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌，中間也不發生任何遺傳因子的交換或整合，最后也不產生具有雜種性質的轉化子。第63頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組2、轉導與溶源轉變：通過缺陷或溫和噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得了前者部分遺傳性狀的現象。獲得新遺傳性狀的受體細胞，稱為轉導子。1952年在鼠傷寒沙門氏桿菌中發現。大腸桿菌、芽孢桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬中均發現。第64頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組A、普遍性轉導：噬菌體本身DNA沒有包進去，形成缺陷型，同時誤包供體菌中的任何基因(包括質粒)，使受體菌實現各種性狀的轉導。分為完全普遍轉導（完全轉導）和流產普遍轉導（流產轉導）。

第65頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組完全轉導：鼠傷寒沙門氏菌野生型菌株作供體菌，營養缺陷型為受體菌，P22噬菌體作為轉導媒介。當P22在供體菌內增殖時，宿主染色體組斷裂，待噬菌體成熟之際，極少數(10-6—10-8)噬菌體衣殼誤包與噬菌體DNA相仿的供體菌DNA片段(約1%)，形成完全不含噬菌體本身DNA的假噬菌體(一種完全缺陷的噬菌體)。供體菌裂解時，如把少量裂解物與大量的受體菌群相混，這種特殊噬菌體將外源DNA片段導入受體菌。第66頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組1個完全缺陷的假噬菌體只能感染1個受體細胞，受體細胞不會發生溶原化和裂解。導入的供體DNA片段可與受體染色體組上的同源區段配對，再通過雙交換而重組到受體菌染色體上，形成遺傳性穩定的轉導子。第67頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

外源染色體片段(雙鏈DNA)通過雙交換形成一個穩定的轉導子圖示

第68頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組流產轉導：在獲得供體菌DNA片段的受體菌內，轉導DNA不能與受體菌DNA進行重組并復制，也不迅速消失，（只是借住而已）僅表現穩定轉錄、轉譯、表達的現象。受體菌進行分裂時，只有一個子細胞獲得這段DNA，另一子細胞僅獲得供體基因的產物—酶，在表型上出現供體菌的某一特征。并且，每經過一次分裂，就受到一次“稀釋”。所以，只能在選擇性培養基平板上形成一個微小菌落（即其中只有一個細胞是轉導子）。第69頁,共151頁，2024年2月25日，星期天流產轉導示意圖

第70頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組B、局限轉導：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉導現象。①只能轉導供體菌的個別特定基因(一般為噬菌體整合位點兩側的基因)；②該特定基因由部分缺陷（與完全缺陷相對而言）的噬菌體攜帶。分為低頻轉導和高頻轉導。第71頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組低頻轉導(LFT)：用低感染復數的LFT裂解物感染宿主，獲得極少量局限轉導子的方式。（宿主染色體被不正常切離的頻率極低，故只能獲得極少量部分缺陷噬菌體，即極少量局限轉導子）

第72頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組當溫和噬菌體感染受體菌后，其染色體開環，以線狀形式整合到宿主染色體的特定位點上，使宿主細胞發生溶原化。該溶原菌因誘導而發生裂解時，有極少數(～10-5)的前噬菌體發生不正常切離，將插入位點兩側之一的少數宿主基因，連接到噬菌體DNA上，噬菌體也將相應的一段DNA遺留在宿主的染色體組上，通過衣殼的“誤包”，形成一種特殊的噬菌體—（部分）缺陷噬菌體。當它感染宿主并整合在宿主基因組上時，可使宿主細胞成為一個局限轉導子，而不是一個溶原菌，不具有對相同溫和噬菌體的免疫性。第73頁,共151頁，2024年2月25日，星期天低頻轉導(LFT)裂解物的形成

第74頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組高頻轉導(HFT)：用高感染復數的HFT裂解物感染其它E.coligal-受體菌，高頻率地轉化為E.coligal+轉導子的方式。

第75頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組用高感染復數的LFT裂解物感染E.coligal-受體菌（不發酵半乳糖的營養缺陷型），凡感染λdgal（帶供體菌gal基因）噬菌體的細胞，幾乎同時感染正常的λ噬菌體。兩種噬菌體同時整合在一個受體菌核染色體組上，受體菌成為雙重溶原菌。當雙重溶原菌被紫外線等誘導時，正常λ噬菌體（助體或輔助噬菌體）的基因可補償λdgal

所缺失的部分基因功能，兩種噬菌體同時獲得復制的機會；裂解物含有等量λ和λdgal

粒子，稱HFT裂解物。第76頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組-溶原轉變：溫和噬菌體感染宿主使之溶原化，使宿主獲得除免疫性以外的新性狀的現象。當宿主喪失這一噬菌體時，通過溶原轉變而獲得的性狀也同時消失。區別：1、溫和噬菌體不攜帶供體菌基因；2、噬菌體完整，沒有缺陷。典型例子：不產毒白喉棒狀桿菌菌株（β噬菌體）－產白喉毒素。鴨沙門氏菌（ε15噬菌體）－細胞表面多糖結構變化。紅霉素鏈霉菌（P4噬菌體）－紅霉素生物合成及形成氣生菌絲等能力。第77頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組3、接合：通過供體菌和受體菌完整細胞間直接接觸而傳遞大段DNA的過程。細菌以生活在腸道內的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、賽氏桿菌、弧菌、固氮菌、克氏桿菌和假單胞桿菌等屬的一些種最為常見。放線菌研究得最多的是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等，尤以天藍色鏈霉菌最為詳細。接合還可發生在不同屬之間，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌與痢疾志賀氏菌之間。

第78頁,共151頁，2024年2月25日，星期天研究細菌接合方法的基本原理

第79頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組大腸桿菌F因子(即致育因子或性質粒)：獨立于染色體外的小型的環狀DNA，一般呈超螺旋狀態，具有自主的與染色體進行同步復制和轉移到其他細胞中去的能力。還帶有一些對細胞生命活動關系較小的基因。分子量5×107，DNA含量2%，1～4個／細胞。屬于附加體質粒，既可脫離染色體獨立存在，也可插入(即整合)到染色體組上；既可經過接合作用而獲得，也可通過一些理化因素(如吖啶橙、利福平、環已亞胺和加熱等)的處理從細胞中消失。第80頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組大腸桿菌的4種類型：F-(“雌性”)菌株：沒有F因子,表面不具性菌毛。

F+(“雄性”)菌株：細胞中存在游離F因子,表面具性菌毛，數目與因子數相同。Hfr(高頻重組)菌株：F因子被整合在DNA上。-F′菌株：Hfr的F因子脫離DNA,形成攜帶一小段(最多可達1／3)染色體基因的游離F因子,特稱F′因子。該菌株稱為初生F′菌株。-

第81頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組大腸桿菌的接合類型：

1、F+

F-：F+通過性菌毛將F因子轉移給F-成為F+。F因子傳遞“滾環模型”

：①F因子的一條DNA單鏈在特定位置上發生斷裂；②斷裂的單鏈逐漸解開，同時以留下的另一條環狀單鏈作模板，通過模板的旋轉，將解開的單鏈通過性菌毛推入F-中，同時在供體細胞內，重新合成一條新的環狀單鏈，取代解開的單鏈；③F-細胞中，外來DNA單鏈上也合成一條互補的新DNA鏈，恢復成環狀雙鏈F因子，F-變成了F+。

第82頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組2、F′F-

初生F′菌株與F-菌株接合，使之成為次生F′菌株，含有質粒基因和若干原屬Hfr菌株的遺傳性狀。通過質粒來傳遞供體基因的方式，稱為F質粒轉導、F因子轉導、性導、F質粒媒介轉導。第83頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（一）原核微生物基因重組-Hfr與F-：接合時，Hfr染色體在F因子處發生斷裂，由環狀變成線狀，F因子位于最末端。由于種種原因，這種線狀染色體在轉移過程中經常會發生斷裂，越在前端的基因，進入的機會就越多，在F-中出現重組子的時間就越早，頻率也高。F因子位于最末端，進入的機會最少，引起性別轉化的可能性也最小。因此，Hfr與F-接合的結果重組頻率雖高，但卻很少出現F+的菌株，大多數情況下，仍是F-。

第84頁,共151頁，2024年2月25日，星期天F因子的存在方式及其相互關系

第85頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）真核微生物基因重組1、有性雜交：指性細胞間的接合和隨之發生染色體重組，并產生新遺傳型后代的一種方式。能產生有性孢子者，均可采用有性雜交。2、準性生殖：類似于有性生殖但更為原始的一種生殖方式。可使同一生物的兩個不同來源的體細胞經融合后，不通過減數分裂而導致低頻率的基因重組。第86頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）真核微生物基因重組1、有性雜交—釀酒酵母：將甲、乙兩個雙倍體親本，分別接種到產孢培養基(醋酸鈉培養基等)斜面上，使其產生子囊，減數分裂，形成4個單倍體子囊孢子。用蒸餾水洗下子囊，經機械法(加硅藻土和石蠟油，在勻漿管中研磨)或酶法(如蝸牛酶)破環子囊，離心，獲得子囊孢子，涂布平板，培養，得到單倍體菌落。把兩個親體的不同性別的單倍體細胞密集接觸在一起，有機會出現雙倍體的雜交后代。雙倍體細胞和單倍體細胞有很大不同,易于識別。第87頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第88頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）真核微生物基因重組2、準性生殖：菌絲聯結：形態沒有區別,遺傳性上有差別的兩個同種親本的單倍體體細胞間發生菌絲聯結。形成異核體：聯結后,原有的兩個單倍體核集中到同一個細胞中,形成雙相異核體。異核體能獨立生活。核配：異核體中的雙核偶爾可以發生核融合,產生雙倍體雜合子核。如構巢曲霉、米曲霉核融合頻率為10-5～10-7。某些理化因素如樟腦蒸汽、紫外線或高溫等的處理,可以提高頻率。第89頁,共151頁，2024年2月25日，星期天（二）真核微生物基因重組體細胞交換和單倍體化：體細胞交換即體細胞中染色體的交換,也稱有絲分裂交換。雙倍體雜合子性狀極不穩定,在其進行有絲分裂過程中,其中極少數核中的染色體會發生交換和單倍體化,從而形成了極個別具有新性狀的單倍體雜合子。如對雙倍體雜合子用紫外線、γ射線等進行處理,就會促進染色體斷裂、畸變或導致染色體在兩個子細胞中分配不均,因而有可能產生各種不同性狀組合的單倍體雜合子。第90頁,共151頁，2024年2月25日，星期天半知菌的準性生殖示意圖

第91頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第92頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第三節微生物育種目前，微生物發酵已由野生型菌株發酵向代謝調控發酵轉移。代謝調控發酵：利用遺傳學原理和方法，在DNA水平人為地改變和控制微生物代謝，使目的產物大量積累的發酵。關鍵之一：選育從遺傳角度解除了微生物正常代謝機制的突變株。方法：主要是誘變、雜交、遺傳工程等。

第93頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種（一）、自發突變與育種：1、生產選育：富于實際經驗并且善于細致觀察的人們在日常生產過程中，發現自然突變，選育優良菌株。2、定向培育：用某一特定因素長期處理某一微生物培養物，同時不斷對它們進行傳代，以達到累積并選擇相應的自發突變體的一種古老的育種方法。過程十分緩慢，“守株待兔”。

第94頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種分離篩選步驟1、采樣（土壤、食品等）2、增殖培養（數量不足時）3、純種分離（稀釋、劃線、組織分離等）4、純培養（擴大）5、生產性能測定第95頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種（二）、誘變育種：利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的細胞群，大幅度提高突變頻率，通過簡便、快速和高效的篩選，從中挑選符合育種目的的突變株。發酵工業和其他微生物生產部門使用的高產菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產性能的。提高產量、改進質量、擴大品種和簡化生產工藝等，是使用最廣泛的育種手段之一。第96頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種1、誘變育種的基本結果：以高產突變株為例--------誘變

出發菌株－－{絕大多數死亡-------

---------------少數存活{-多數未變-多數負變

----------------------------少數突變{-少數正變少數正變{-多數幅度小---------------------------------------少數幅度大{多數不宜投產少數適宜投產第97頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種2、誘變育種的基本路線：確定出發菌株→純化選優→性能測定→同步培養→制備單細胞（單孢子）懸液→活菌濃度測定→誘變劑選擇與劑量確定預試驗→誘變處理→平板分離→計數（變異菌落與突變率）→挑取疑似菌落純培養→突變體初篩→復篩→搖瓶發酵試驗→選出突變體→生產試驗或重復誘變處理（詳情見教材）

第98頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種3、誘變育種的原則：挑選優良的出發菌株-處理單孢子(或單細胞)懸液選擇簡便有效、最適劑量的誘變劑-

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第99頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種出發菌株是用于育種的原始菌株。①選用單倍體純種，排除異核體和異質體影響；②采用優良性狀菌株；③選擇對誘變劑敏感的菌株，或改變菌株的遺傳型，提高菌株敏感性；④高產突變往往需要逐步累積，有必要多選一些經過誘變的菌株為出發菌株，進行多步育種，確保高產菌株的獲得。

第100頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種誘變育種必須使用均勻狀態的單細胞懸液。誘變劑一般只作用于DNA雙鏈中的某一條單鏈，因此，處理多核或單核細胞、孢子時，某一突變無法反映在當代的表型上。只有經過DNA復制和細胞分裂，表型才會發生變異，出現不純菌落，稱為“表型延遲”。這是初次分離的菌株經傳代后很快出現生產性狀“衰退”的主要原因。誘變霉菌或放線菌稍加萌發的孢子；芽孢桿菌的芽孢(只有一個核質體)；細菌對數期誘變處理效果較好。

第101頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種誘變劑主要有物理誘變劑和化學誘變劑。如紫外線、X射線、γ射線和快中子等；烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。最常用的烷化劑有N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基亞硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亞胺和環氧乙烷等。物理誘變劑劑量：強度×時間，紫外線強度單位是爾格，X射線單位是倫琴或拉得等；化學誘變劑劑量：一定溫度下誘變劑濃度和處理時間。常采用殺菌率作各種誘變劑的相對劑量。

第102頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種誘變劑的作用：①提高突變頻率；②擴大產量變異幅度；③使產量變異向正變(提高)或負變(降低)的方向移動。凡在高誘變率的基礎上既能擴大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。

第103頁,共151頁，2024年2月25日，星期天誘變劑的劑量對產量變異的影響：a.未經誘變劑的處理--b.變異幅度擴大c.正變占優勢--d.負變占優勢第104頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種確定合適劑量，要多次試驗。正變較多出現在偏低劑量中，負變則相反；經多次誘變而提高產量的菌株，更容易出現負變。過去用紫外線作誘變劑，常采用殺菌率為99或99.9%的劑量，近年來傾向于采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對于經多次誘變后的高產菌株更是如此。

第105頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、突變與育種誘變劑的復合處理常呈現一定的協同效應。復合處理的方法：兩種或多種誘變劑的先后使用；同一種誘變劑的重復使用；兩種或多種誘變劑的同時使用。第106頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第107頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種（一）基本原理：將兩個親株細胞壁分別通過酶解作用加以剝除，在高滲環境中釋放出只有原生質膜包被著的球狀原生質體；將兩個親株的原生質體在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使細胞質融合；通過兩套基因組之間的接觸、交換，發生基因組的遺傳重組，在再生細胞中獲得重組體。第108頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種（二）、育種步驟：①篩選標記菌株；②制備原生質體；③原生質體融合；④原生質體再生；⑤選擇融合子；⑥篩選實用性菌株。

第109頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種1、篩選標記菌株--親株常采用常規誘變育種方法，獲得營養缺陷和抗藥性等遺傳性狀為標記。目的基因不一定與標記基因連鎖。已知融合頻率較高時，為了減少標記對正常代謝的干擾，可以僅有一個標記。每個親株各有兩個隱性性狀的營養缺陷標記，可以排除獲得的原養型融合子是回復突變的可能。最好選擇對菌株生產性能沒有影響的標記。特別是對于工業生產菌來說，用誘變方法獲得標記，往往對該菌株的生產性能影響甚大，應盡可能采用該菌株自身已帶的遺傳標記。第110頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種2、制備原生質體--細菌和放線菌主要采用溶菌酶；酵母菌和霉菌可用蝸牛酶和纖維素酶。影響因素：①進行預處理，加強壁對酶的敏感性。在細菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-環絲氨酸等；在放線菌的中加入1%～4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入2-脫氧葡萄糖等。（甘氨酸取代肽聚糖的L-丙氨酸和D-丙氨酸殘基；青霉素干擾甘氨酸肽橋與四肽側鏈上D-丙氨酸之間的聯結；環絲氨酸結構類似于D-丙氨酸，競爭性抑制丙氨酸消旋酶的作用，使L-丙氨酸不能轉變為D-丙氨酸，不能合成N-乙酰胞壁酸五肽）第111頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種②選擇適宜的培養時間，生長、代謝旺盛，壁對酶解作用最為敏感，原生質體形成率、再生率均很高。細菌采用對數生長后期，放線菌采用對數生長期到平衡期之間的轉換期最為合適。③酶濃度過低，不利于原生質體形成；酶濃度增加，形成率增大；超過一定范圍，形成率提高不明顯，并且導致再生率降低。最佳酶濃度是使形成率和再生率之積達到最大。

④提高酶解溫度，酶解反應加快；酶蛋白逐漸變性失活。最適溫度是兩種效應的共同結果。還要以再生率加以校正。一般酶解溫度20～40℃。

第112頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種⑤酶解時間應適宜。過短，原生質體形成不完全；過長，隨著酶解時間的延長，酶使膜損傷，原生質體破裂、失活，再生率急劇降低。⑥滲透壓保護原生質體免于膨脹作用，有助于酶和底物的結合。細菌中多用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，霉菌中多用KCl和NaCl等。濃度0.3～0.8mol/L。此外，破壁pH值、培養基成分、培養方式、離子強度和種類等，亦有一定影響。

第113頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種3、融合：表面活性劑聚乙二醇及Ca2*、Mg2*等陽離子，使融合頻率出現突破性提高。PEG分子量從1000到12000，融合時多用4000和6000兩種。研究發現，融合開始時，強烈脫水引起質體粘合，不同程度地形成聚集場，質體收縮并高度變形，大量粘著的質體形成非常緊密的接觸。接觸處的膜間蛋白顆粒發生轉位和聚集，鄰近的脂質分子發生相互反應。Ca2*等強烈地促進脂質分子的擾動和重新組合，使接觸處的膜形成小區域的融合，產生小的原生質橋并逐漸增大，直至兩個原生質體融合。

第114頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種4、再生酶解去壁后的原生質體應能重建細胞壁，恢復細胞完整形態，生長、分裂。再生培養基必須加入具有一定滲透壓的基質，成分因種而異。壁剝離不徹底，有助于再生。菌種本身的再生特性、原生質體制備條件、再生培養基成分及再生培養條件等影響再生。

-------------------再生菌數

原生質體再生率=－－－－－－－－×100%

-------------------破壁前菌數－剩余菌數0.00％－100%。

第115頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種5、選擇融合子

質體融合可以是真正融合（雜合二倍體或單倍重組體）；或是暫時融合（異核體）。兩者均可在選擇培養基上生長，一般前者較穩定，后者不穩定，會分離成親本類型，有的甚至以異核狀態移接幾代。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體再生后，進行幾代自然分離和選擇，才能加以確定。

如果有兩個遺傳標記互補可以確定其為融合子。第116頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、原生質體融合育種6、篩選實用性菌株融合子類型是各種各樣的，存在性能和產量不同的情況。需要人為定向篩選融合子。以純齒棒桿菌B9和天津短桿菌TG-866為親株進行質體融合，初篩后發現，有的根本不產生谷氨酸，如F5、F38、F220等；有的產率很低，如F12、F268、F300等；有的產率介于兩親株之間，如F70；有的產率較兩親株都高，如F263、F288等。第117頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第118頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

原生質體融合基本過程示意圖

第119頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第四節基因工程重組DNA技術：在體外對不同來源的DNA分子進行重組，引入合適的寄主細胞內，使之復制和表達。基因工程屬于狹義的遺傳工程，習慣上所說的遺傳工程多指基因工程。廣義的遺傳工程包括基因工程、細胞工程、染色體工程、細胞器工程等。第120頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基因工程的基本操作

（一）、目的基因的取得：①選擇適宜的給體細胞，從中采集分離有生產意義的目的基因；②通過反轉錄酶的作用由mRNA合成cDNA(互補DNA)；③用化學方法合成特定功能的基因。第121頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基因工程的基本操作（二）、選擇載體：原核受體細胞的載體，主要是細菌質粒(松弛型)和λ噬菌體。動物細胞，主要是SV40病毒。植物細胞主要是TI質粒載體必須具備:①有自我復制能力；②能在受體細胞內大量增殖，有較高的復制率；③最好只有一個限制性內切酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；④載體上必須有一種選擇性遺傳標記，如具有四環素、氨芐青霉素等的抗性基因，以便及時把極少數“工程菌”選擇出來。第122頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基因工程的基本操作（三）、目的基因與載體DNA的體外重組：采用限制性內切酶處理目的基因與載體DNA，獲得互補粘性末端或人工合成粘性末端。把兩者放在較低的溫度(5～6℃)下混合“退火”。由于每一種限制性內切酶所切斷的雙鏈DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸組分，所以當兩者相混時，凡粘性末端上堿基互補的片段，就會因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈，這時，在外加連接酶的作用下，供體的DNA片段與質粒DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個完整的有復制能力的環狀重組體——嵌合體。第123頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、基因工程的基本操作（四）、重組載體引入受體細胞：微生物、動物或植物細胞。使用最廣泛的是E.coli。其次為枯草桿菌和釀酒酵母。以重組質粒作載體,用轉化方法；以病毒DNA作重組載體,用感染方法。理想情況，重組載體進入受體細胞,通過自主復制而大量擴增,使受體細胞表達出供體基因所提供的部分遺傳性狀,受體細胞就成為“工程菌”。

第124頁,共151頁，2024年2月25日，星期天

基因工程的主要操作步驟

第125頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、基因工程在微生物方面的應用

1、提高代謝產物產量：例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系統中克隆與表達。其中蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸和組氨酸等工程菌已達到工業化生產水平。蘇氨酸工程菌在前蘇聯和日本都已用于工業生產,蘇氨酸產量可達60g/L以上，我國蘇氨酸產量可達20g/L。第126頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、基因工程在微生物方面的應用2、生產新的抗菌素天藍鏈霉菌合成藍色的多酮肽抗菌素－放線紫紅素，麥迪霉素產生菌合成褐色的麥迪霉素。經過兩級克隆，麥迪霉素產生菌產生一種新的紫色化合物，是麥迪霉素與放線紫紅素的雜種化合物，為一種新的抗菌素,命名為MederhodinA。第127頁,共151頁，2024年2月25日，星期天二、基因工程在微生物方面的應用3、改良工業酶生產菌株：蛋白酶、木糖異構酶、纖維素酶、葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均進行了研究。研究較多的是α-淀粉酶和青霉素酰化酶。1981年起，在枯草桿菌或大腸桿菌中克隆和表達了來自枯草桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌種的α－淀粉酶基因，比野生株最高的可達30倍。目前美國已用基因工程菌生產。德國首先克隆大腸桿菌青霉素G酰化酶基因。我國青霉素G酰化酶的產量可達3000單位/L以上。

第128頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第129頁,共151頁，2024年2月25日，星期天第五節菌種保藏微生物受外界環境的影響會經常地發生小機率的變異，這種變異可能造成菌種生產性狀的劣化或自身死亡。要使菌種在生產中長期保持優良的生產性狀就必須設法減少菌種的退化和死亡，做好保藏工作。第130頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治（一）、菌種退化：生產菌株生產性狀的劣化或遺傳研究菌株遺傳標記的丟失。如產孢能力喪失、發酵液產物組成改變、主產物減少和副產物增加等。菌種退化是一個逐漸發展的過程，指細胞群體的變化，而不是指單個細胞的變化。自發變異的單個細胞與其它細胞一起接入新鮮培養基時，由于細胞生理、代謝調節及產生產物的不同，在某些培養條件下，發生自發變異退化細胞的數量可能逐漸增多，經過多次傳代能使此變異類型完全占優勢而導致細胞群體的退化。第131頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治環境條件可以影響菌種退化的速率。不利環境往往加速突變型生產菌向野生型方向退化。單純環境條件如碳源、氮源、pH、溫度等造成生產性狀的下降是因批而異的，下一次發酵可以完全恢復正常，菌種本身并沒有變化，不是退化。由于雜菌污染導致生產性狀下降也不是退化，通過采取對設備的清洗、維修、重新殺菌等一系列措施，加強無菌操作，可以避免雜菌的繼續污染。只有菌株本身性狀的劣化，才是退化。第132頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治（二）、菌種退化的原因：1、基因（負）突變。缺陷型基因發生頻率很低的回復突變，由于具有生長優勢，在傳代過程中，數量比例上升很快，就斜面菌種而言退化細胞還只是少數，但發酵過程中這些少數菌的存在會使退化性狀表現強烈，成為事實上退化菌種。

第133頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治-2、非基因突變。如構窠曲霉用分生孢子傳代，子囊孢子逐漸減少，表現出不產子囊孢子的“突變”；如果用子囊孢子傳代，則分生孢子逐漸減少。培養和保藏條件可以從多方面影響菌種的退化。如陳舊的培養物中可能積累對微生物有毒害作用的物質而提高突變率，溫度上升也有利于突變，某些營養成分的不足可促進野生型回復突變株的生長優勢。泡盛曲霉變異菌株糖化酶產生株在馬鈴薯葡萄糖培養基上傳代酶產量降低極少，在麥汁酵母膏培養基上傳到第10代，產酶能力降至1/4。第134頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治（三）、菌種退化的防治：1、菌種選育方法---使用單核細胞；采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力，減少分離回復。誘變處理后進行充分的后培養及分離純化，以保證保藏菌種純粹，不再發生分離回復。2、菌種保藏方式---溫度影響自發突變及細胞活力。斜面保藏于4℃時，突變的可能性大，且斜面保藏一般每3個月到半年需傳代1次，對菌種不利。作為生產菌株需同時采用斜面保藏和其它的保藏方式如冷凍干燥孢子、砂土管及液氮保存等。保藏所用的斜面培養基組成應根據不同菌種的特性加以選擇。第135頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治3、菌種培養條件---①給予營養缺陷型菌適當的營養必需成分降低回復突變頻率；②給予抗性菌以一定濃度的藥物，使回復的敏感型菌株的生長受到抑制，而生產菌能正常生長；③控制培養基中氮源或碳源的性質，使之有利于生產菌株而不利于退化菌株的生長，從而限制退化菌株的數量上升；④改變培養pH、溫度等條件防止退化。如棲土曲霉3.942培養中，培養溫度由28～30℃提高到30～34℃防止了產孢子能力的衰退。避免使用陳舊的培養物作為種子。第136頁,共151頁，2024年2月25日，星期天一、菌種退化及其防治4、菌種管理措施--定期針對性地進行分離純化。純化可以用劃線分離、稀釋分離、單孢子分離等方法，所得單菌落需作生產性狀測試，以保證性能優良。利用生產菌株的遺傳標記，如營養缺陷型及抗性等，進行生長譜平板檢查、藥物濃縮或抗性平板生長等也是純化的方法。使已部分退化的菌種接觸一些惡劣環境，如藥物、低溫及高溫等，汰弱留強。絲狀菌采用孢子移種避免菌絲傳代，交替使用分生孢子和子囊孢子傳代等也可防止