細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎一、本文概述骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是一種慢性的關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和關(guān)節(jié)周?chē)M織的炎癥。隨著全球人口老齡化趨勢(shì)的加劇，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。細(xì)胞凋亡，又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本文旨在深入探討細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，以及如何通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎，為骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供新的思路和方法。二、細(xì)胞凋亡概述細(xì)胞凋亡，又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡方式。它與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用；它也不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡對(duì)于多細(xì)胞生物完成正常發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，以及抵御各種外界因素的干擾都起著非常關(guān)鍵的作用。在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中，細(xì)胞凋亡具有十分重要的生物學(xué)意義。在骨關(guān)節(jié)炎（OA）的病理過(guò)程中，細(xì)胞凋亡也扮演了重要的角色。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)關(guān)節(jié)受到損傷或老化時(shí)，軟骨細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生凋亡，導(dǎo)致軟骨組織的破壞和關(guān)節(jié)功能的喪失。因此，深入研究細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎中的具體作用機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的骨關(guān)節(jié)炎治療方法具有重要的指導(dǎo)意義。細(xì)胞凋亡的過(guò)程復(fù)雜且精細(xì)，涉及多種信號(hào)通路的交互作用。其中，死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是三條主要的凋亡信號(hào)通路。這些通路在接收到凋亡信號(hào)后，會(huì)觸發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。在骨關(guān)節(jié)炎中，這些凋亡通路可能會(huì)因?yàn)楦鞣N原因被激活，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，它在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。深入研究細(xì)胞凋亡的機(jī)制，將有助于我們更好地理解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。三、骨關(guān)節(jié)炎中的細(xì)胞凋亡骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種慢性的關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨的退化、骨贅形成以及關(guān)節(jié)周?chē)M織的炎癥。在OA的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞凋亡扮演了重要的角色。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，它在維持組織穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細(xì)胞數(shù)量和防止疾病發(fā)展等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在OA中，軟骨細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化的重要機(jī)制之一。多種因素，如年齡、肥胖、關(guān)節(jié)損傷、代謝異常等，都可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡的增加。隨著年齡的增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞的凋亡率逐漸上升，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的合成與分解平衡被打破，軟骨逐漸變薄、粗糙，最終發(fā)生退化。肥胖和關(guān)節(jié)損傷可通過(guò)增加關(guān)節(jié)內(nèi)壓力、引發(fā)炎癥反應(yīng)等方式，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。代謝異常，如高血糖、高血脂等，也可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路或增加氧化應(yīng)激等方式，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除了軟骨細(xì)胞外，OA中的滑膜細(xì)胞、骨細(xì)胞等其他關(guān)節(jié)組織細(xì)胞也可能發(fā)生凋亡?；ぜ?xì)胞的凋亡可能導(dǎo)致滑膜炎癥的減輕，但過(guò)度的凋亡也可能影響關(guān)節(jié)液的分泌和關(guān)節(jié)潤(rùn)滑，加劇關(guān)節(jié)磨損。骨細(xì)胞的凋亡則可能影響骨代謝平衡，導(dǎo)致骨贅形成和骨質(zhì)疏松等病理改變。因此，深入探討骨關(guān)節(jié)炎中細(xì)胞凋亡的機(jī)制，對(duì)于揭示OA的發(fā)病機(jī)理、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。未來(lái)的研究應(yīng)關(guān)注如何通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡來(lái)減緩OA的進(jìn)程，為OA的防治提供新的思路和方法。四、細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎治療的關(guān)聯(lián)細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞生命周期中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其異常與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，深入探討細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎治療的關(guān)聯(lián)，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的骨關(guān)節(jié)炎治療方法具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞死亡和基質(zhì)降解是骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。針對(duì)這一過(guò)程，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡通路，可以有望逆轉(zhuǎn)或延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。例如，通過(guò)抑制凋亡誘導(dǎo)因子或凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，可以減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，從而維護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的完整性和功能。目前，針對(duì)細(xì)胞凋亡的骨關(guān)節(jié)炎治療方法主要包括藥物治療和基因治療。藥物治療中，一些具有抗凋亡作用的藥物如抗氧化劑、生長(zhǎng)因子等，已被證實(shí)可以在一定程度上緩解骨關(guān)節(jié)炎的癥狀，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。然而，藥物治療的效果往往有限，且存在副作用和耐藥性等問(wèn)題?；蛑委焺t是一種更具潛力的治療方法。通過(guò)基因工程技術(shù)，可以針對(duì)特定的凋亡相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的精確調(diào)控。例如，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將抗凋亡基因?qū)腙P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，可以增強(qiáng)其抗凋亡能力，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的再生和修復(fù)。除了藥物治療和基因治療外，一些物理治療和手術(shù)治療方法也可以通過(guò)影響細(xì)胞凋亡過(guò)程來(lái)改善骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)后。例如，物理治療如超聲波、電刺激等可以通過(guò)促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝和增殖，抑制其凋亡過(guò)程；而手術(shù)治療如關(guān)節(jié)置換等則可以通過(guò)移除病變的關(guān)節(jié)組織，為新的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)提供環(huán)境。細(xì)胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎治療之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。通過(guò)深入研究細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，并探索基于細(xì)胞凋亡調(diào)控的治療方法，有望為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路和手段。五、結(jié)論細(xì)胞凋亡是一種有序的、受基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程，它在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。通過(guò)深入研究和理解細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎中的具體作用，我們可以為預(yù)防和治療這一常見(jiàn)疾病提供新的策略。細(xì)胞凋亡的失調(diào)可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過(guò)度死亡，從而加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。在骨關(guān)節(jié)炎的病變過(guò)程中，細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等起著關(guān)鍵作用。這些因子的表達(dá)變化不僅影響了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生存和死亡，還進(jìn)一步影響了關(guān)節(jié)軟骨的代謝和修復(fù)。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，一些外部因素如炎癥、機(jī)械壓力等也能通過(guò)影響細(xì)胞凋亡的過(guò)程，從而參與到骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中。這些發(fā)現(xiàn)為我們理解骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程中起著重要作用，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程，我們有可能找到新的骨關(guān)節(jié)炎治療策略。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步深入探索細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎中的具體作用機(jī)制，以期找到更有效的預(yù)防和治療方法。參考資料：凋亡素，一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，近年來(lái)已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。特別是其在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用，更是引發(fā)了大量研究者的關(guān)注。本文將重點(diǎn)探討凋亡素與腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展。凋亡素是一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用的蛋白質(zhì)，它參與了細(xì)胞凋亡的多個(gè)環(huán)節(jié)。在正常情況下，細(xì)胞凋亡是一種自然的程序性死亡過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織發(fā)育至關(guān)重要。然而，在腫瘤細(xì)胞中，凋亡素的表達(dá)和功能往往受到異常調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和逃避凋亡。凋亡素在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平與其增殖和凋亡狀態(tài)密切相關(guān)。研究表明，多種因素可以影響凋亡素的表達(dá)，如基因突變、表觀遺傳學(xué)改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等。深入探討這些因素如何調(diào)控凋亡素的表達(dá)，對(duì)于理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義。腫瘤細(xì)胞中存在著復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)在凋亡素的表達(dá)和功能中起著重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，凋亡素可以與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用，通過(guò)影響這些分子的活性來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。因此，深入研究凋亡素與腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。由于凋亡素在腫瘤細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，它已成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，一些研究已發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控凋亡素的表達(dá)或活性，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。還有一些研究試圖將凋亡素與其他抗腫瘤療法相結(jié)合，以提高治療效果。凋亡素與腫瘤細(xì)胞凋亡的研究是一個(gè)充滿(mǎn)挑戰(zhàn)和機(jī)遇的領(lǐng)域。雖然目前我們已經(jīng)取得了一些重要的研究成果，但仍有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步探討。例如，我們?nèi)孕枭钊肓私獾蛲鏊卦谀[瘤細(xì)胞中的具體作用機(jī)制，以及其在不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)和功能差異。如何有效調(diào)控凋亡素的表達(dá)或活性，以便將其應(yīng)用于臨床腫瘤治療，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，我們相信凋亡素將在未來(lái)為腫瘤治療提供更多新的思路和方法。我們也期待研究者們?cè)诘蛲鏊嘏c腫瘤細(xì)胞凋亡的研究中取得更多突破性的成果，為人類(lèi)戰(zhàn)勝癌癥做出更大的貢獻(xiàn)。本研究旨在探討單味中藥骨碎補(bǔ)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，采用骨碎補(bǔ)進(jìn)行干預(yù)，觀察軟骨細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，骨碎補(bǔ)可以顯著降低軟骨細(xì)胞凋亡率，對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用。骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變和細(xì)胞凋亡增加。目前，骨關(guān)節(jié)炎的藥物治療主要集中在非甾體消炎藥和關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)劑上，但治療效果有限。因此，尋找有效的藥物治療方案成為研究重點(diǎn)。單味中藥骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血止痛的功效，被廣泛應(yīng)用于治療骨折、骨關(guān)節(jié)炎等疾病。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討骨碎補(bǔ)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的作用。選取30只健康成年家兔，等量隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組給予生理鹽水，定時(shí)記錄關(guān)節(jié)腫脹程度；實(shí)驗(yàn)組給予骨碎補(bǔ)灌胃。采用無(wú)菌操作技術(shù)，在無(wú)菌條件下切除家兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶及部分內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)囊，造成膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。實(shí)驗(yàn)組家兔給予骨碎補(bǔ)灌胃，給藥劑量為10g/kg，每天1次，連續(xù)給藥4周。采用HE染色觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)變化；采用TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡情況；采用Westernblot法檢測(cè)Bcl-Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。采用SPSS0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)，P<05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞外基質(zhì)變性；實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整，排列較為整齊，細(xì)胞外基質(zhì)較為豐富。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P<05）。Westernblot法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bax、Caspase-3表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<05）。本研究結(jié)果表明，單味中藥骨碎補(bǔ)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，骨碎補(bǔ)可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡過(guò)程。這為骨碎補(bǔ)在骨關(guān)節(jié)炎治療中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)胞凋亡（apoptosis）指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。人體內(nèi)的細(xì)胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關(guān)細(xì)胞死亡過(guò)程的研究，已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。人們已經(jīng)知道細(xì)胞的死亡起碼有兩種方式，即細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡（apoptosis）。細(xì)胞壞死是早已被認(rèn)識(shí)到的一種細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞凋亡則是逐漸被認(rèn)識(shí)的一種細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類(lèi)型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P35等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)多種細(xì)胞凋亡的過(guò)程有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識(shí)，但是迄今為止凋亡過(guò)程確切機(jī)制尚不完全清楚。而凋亡過(guò)程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。人的部分生理結(jié)構(gòu)屬于自然凋亡，如人的有尾階段，尾部在發(fā)育過(guò)程中自動(dòng)凋亡。1．凋亡概念的形成1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門(mén)靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞，這些細(xì)胞的溶酶體并未被破壞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集，從其周?chē)慕M織中脫落并被吞噬，機(jī)體無(wú)炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始，在此之前，關(guān)于胚胎發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)的研究，肝細(xì)胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎(chǔ)。2)染色體DNA的降解：細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特征就是細(xì)胞染色質(zhì)的DNA降解，凋亡時(shí)DNA的斷片大小規(guī)律是200bp的整數(shù)倍。4)鈣離子變化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要條件。4．細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段細(xì)胞凋亡的研究，其生命力在于最終能夠有利于疾病機(jī)制的闡明，以及新療法的探索及問(wèn)世。其實(shí)從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來(lái)說(shuō)，細(xì)胞程序性死亡（PCD）與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。細(xì)胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是個(gè)功能性概念，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。例如蝌蚪變成青蛙，其變態(tài)過(guò)程中尾部的消失伴隨大量細(xì)胞死亡，高等哺乳類(lèi)動(dòng)物指間蹼的消失、顎融合、視網(wǎng)膜發(fā)育以及免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育都必須有細(xì)胞死亡的參與。這些形形色色的在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡有一個(gè)共同特征：即散在的、逐個(gè)地從正常組織中死亡和消失，機(jī)體無(wú)炎癥反應(yīng)，而且對(duì)整個(gè)機(jī)體的發(fā)育是有利和必須的。因此認(rèn)為動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中存在的細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)發(fā)育學(xué)概念，而細(xì)胞凋亡則是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。但是一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個(gè)概念可以交互使用，具有同等意義。雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過(guò)程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡小體逐漸被鄰近的細(xì)胞或體內(nèi)吞噬細(xì)胞所吞噬，凋亡細(xì)胞的殘余物質(zhì)被消化后重新利用。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，無(wú)內(nèi)容物外溢，因此不引起周?chē)难装Y反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周?chē)鷮?zhuān)職或非專(zhuān)職吞噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體的DNA降解，這是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長(zhǎng)度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長(zhǎng)度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的寡聚核小體片段，實(shí)驗(yàn)證明，這種DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。細(xì)胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中往往還有新的基因的表達(dá)和某些生物大分子的合成作為調(diào)控因子。如我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的TFAR-19就是在細(xì)胞凋亡時(shí)高表達(dá)一種分子，再如在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞凋亡過(guò)程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質(zhì)合成抑制劑即能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后胞內(nèi)一系列控制開(kāi)關(guān)的開(kāi)啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同，所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說(shuō)對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還是不全面的，比較清楚的通路主要有：1）細(xì)胞凋亡的膜受體通路：各種外界因素是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)劑，它們可以通過(guò)不同的信號(hào)傳遞系統(tǒng)傳遞凋亡信號(hào)，引起細(xì)胞凋亡，我們以Fas-FasL為例：Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。它的活化包括一系列步驟：首先配體誘導(dǎo)受體三聚體化，然后在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物中包括帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD。Fas又稱(chēng)CD95，是由325個(gè)氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as一旦和配體FasL結(jié)合，可通過(guò)Fas分子啟動(dòng)致死性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起細(xì)胞一系列特征性變化，使細(xì)胞死亡。Fas作為一種普遍表達(dá)的受體分子，可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面，但FasL的表達(dá)卻有其特點(diǎn)，通常只出現(xiàn)于活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞，因而已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞，往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細(xì)胞于死地。Fas分子胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域（DD,deathdomain）。三聚化的Fas和FasL結(jié)合后，使三個(gè)Fas分子的死亡結(jié)構(gòu)域相聚成簇，吸引了胞漿中另一種帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白FADD。FADD是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白，它由兩部分組成：C端（DD結(jié)構(gòu)域）和N端（DED）部分。DD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該蛋白再以DED連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分，由此引起N段DED隨即與無(wú)活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián)，聚合多個(gè)caspase8的分子，caspase8分子遂由單鏈酶原轉(zhuǎn)成有活性的雙鏈蛋白，進(jìn)而引起隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Caspases，后者作為酶原而被激活，引起下面的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞發(fā)生凋亡。因而TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑與此類(lèi)似線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子，如AIF，參與激活caspase?？梢?jiàn)，細(xì)胞凋亡小體的相關(guān)組份存在于正常細(xì)胞的不同部位。促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然，細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究的關(guān)鍵問(wèn)題。多數(shù)凋亡刺激因子通過(guò)線粒體激活細(xì)胞凋亡途經(jīng)。有人認(rèn)為受體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)也有細(xì)胞色素C從線粒體的釋放。如對(duì)Fas應(yīng)答的細(xì)胞中，一類(lèi)細(xì)胞（type1）中含有足夠的胱解酶8（caspase8）可被死亡受體活化從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在這類(lèi)細(xì)胞中高表達(dá)Bcl-2并不能抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在另一類(lèi)細(xì)胞（type2）如肝細(xì)胞中，F(xiàn)as受體介導(dǎo)的胱解酶8活化不能達(dá)到很高的水平。因此這類(lèi)細(xì)胞中的凋亡信號(hào)需要借助凋亡的線粒體途經(jīng)來(lái)放大，而B(niǎo)id--一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號(hào)從胱解酶8向線粒體傳遞的信使。盡管凋亡過(guò)程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過(guò)程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過(guò)程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程，到目前為止，至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn)，Caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據(jù)功能可把Caspase基本分為二類(lèi)：一類(lèi)參與細(xì)胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二類(lèi)參與細(xì)胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)，此激活位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域?yàn)镼ACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其內(nèi)部保守的天冬氨酸殘基經(jīng)水解形成大（P20）?。≒10）兩個(gè)亞單位，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個(gè)P20/P10異二聚體可來(lái)源于同一前體分子也可來(lái)源于兩個(gè)不同的前體分子。參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類(lèi)：?jiǎn)?dòng)酶（inititaor）和效應(yīng)酶（effector）它們分別在死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。Caspase的活化是有順序的多步水解的過(guò)程，Caspase分子各異，但是它們活化的過(guò)程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性的四聚體。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步，也是必須的，但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽，Caspase活化基本有兩種機(jī)制，即同源活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關(guān)，一般來(lái)說(shuō)后者是前者的結(jié)果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱(chēng)為啟動(dòng)caspase（initiatorcaspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導(dǎo)凋亡后，起始Caspase通過(guò)adaptor被募集到特定的起始活化復(fù)合體，形成同源二聚體構(gòu)像改變，導(dǎo)致同源分子之間的酶切而自身活化，通常caspase-8,10,2介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復(fù)合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡，則被募集到Cytc/dATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。同源活化是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的capases水解活化事件，啟動(dòng)Caspase活化后，即開(kāi)啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過(guò)異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號(hào)放大，同時(shí)將死亡信號(hào)向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱(chēng)為執(zhí)行caspase（凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬，這一過(guò)程大約經(jīng)歷30-60分鐘，Caspase引起上述細(xì)胞凋亡相關(guān)變化的全過(guò)程尚不完全清楚，但至少包括以下三種機(jī)制：正?；罴?xì)胞因?yàn)楹怂崦柑幱跓o(wú)活性狀態(tài)，而不出現(xiàn)DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化（fragmentation）?，F(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱(chēng)為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonucleaseCAD），而把它的抑制物稱(chēng)為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因?yàn)镃AD-ICAD，以一種無(wú)活性的復(fù)合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產(chǎn)生，有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種共轉(zhuǎn)錄方式存在，因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制卻是必需要的。Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個(gè)近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focaladhesionkinase,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導(dǎo)致其活性下降。如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產(chǎn)生片段，使之不能通過(guò)肌動(dòng)蛋白（actin）纖維來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。除此之外，Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進(jìn)行"破壞"，它們切斷細(xì)胞與周?chē)穆?lián)系，拆散細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)可被其他的細(xì)胞吞噬的信號(hào)，并進(jìn)一步使之降解為凋亡小體。細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞Caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開(kāi)始，Caspase被活經(jīng)隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡——細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的舉例如下。迄今為止，人類(lèi)已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA,IAPs，F(xiàn)LIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。1)P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結(jié)果表明P35以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體并且抑制Caspases活性，同時(shí)P35在位點(diǎn)DMQD！G被靶Caspases特異切割，切割后的P35與caspase的結(jié)合更強(qiáng)，CrmA（CytokineresponsemodferA）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)P35和CrmA的同源分子。2)FLIPs(FLICE-imhibiroryproterins）能抑制Fas/TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它有多種變異體，但其N(xiāo)-端功能前區(qū)（Prodomain）完全相同，C端長(zhǎng)短不一。FLIPs通過(guò)DED功能區(qū)，與FADD和Caspase-8，10結(jié)合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10募集到死亡受體復(fù)合體和它們的起始化。3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitorsofApoptosisprotien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到，發(fā)現(xiàn)能夠抑制由病毒感染引起的宿主細(xì)胞死亡應(yīng)答。其特性是有大約20氨基酸組成的功能區(qū)，這對(duì)IAPs抑制凋亡是必需要的，它們主要抑制Caspase3,-7，而不結(jié)合它的酶原，對(duì)Caspase則即可以結(jié)合活化的，又可結(jié)合酶原，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。這一家族有眾多成員，如Mcl-NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數(shù)成員間有兩個(gè)結(jié)構(gòu)同源區(qū)域，在介導(dǎo)成員之間的二聚體化過(guò)程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實(shí)現(xiàn)或功能調(diào)節(jié)的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過(guò)度表達(dá)。Bcl-2的亞細(xì)胞定位已經(jīng)明確，它在不同的細(xì)胞類(lèi)型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過(guò)阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時(shí)，它從胞液遷移到線粒體和核膜。有人研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性藥物誘發(fā)凋亡時(shí)，核膜Bax水平的上升與lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關(guān)。用Bax寡核苷酸處理的細(xì)胞，只能特異地阻斷Lamin的降解，對(duì)PARP的降解不起作用。這種效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為我們所知的機(jī)理需要我們一步的探索。1)胸腺細(xì)胞成熟過(guò)程中的凋亡：胸腺細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的發(fā)育過(guò)程而成為各種類(lèi)型的免疫活性細(xì)胞。在這一發(fā)展過(guò)程中，涉及了一系列的陽(yáng)性細(xì)胞選擇和陰性細(xì)胞選擇過(guò)程。以形成CD4+的T淋巴細(xì)胞亞型及CD8+的T淋巴細(xì)胞亞型；同時(shí)，對(duì)識(shí)別自身抗原的T細(xì)胞克隆進(jìn)行選擇性地消除，其細(xì)胞克隆死亡的機(jī)制主要是通過(guò)程序性細(xì)胞死亡。因此，正常的免疫系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)局，既形成了有免疫活性的淋巴細(xì)胞，又產(chǎn)生了對(duì)自身抗原的免疫耐受。耐受機(jī)制的形成，主要靠識(shí)別自身抗原的T淋巴細(xì)胞克隆的程序性細(xì)胞死亡機(jī)制的活化。2）活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）是T淋巴細(xì)胞程序性死亡的又一個(gè)主要類(lèi)型。正常的T淋巴細(xì)胞在受到入侵的抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞被激活，并誘導(dǎo)出一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)。機(jī)體為了防止過(guò)高的免疫應(yīng)答，或防止這種免疫應(yīng)答無(wú)限制地發(fā)展下去，便有AICD來(lái)控制激活T細(xì)胞的壽命。實(shí)際上：T淋巴細(xì)胞的增殖與T淋巴細(xì)胞AICD具有共同的信號(hào)通路。T淋巴細(xì)胞受到刺激后就開(kāi)始活化，活化以后的T淋巴細(xì)胞如果有生長(zhǎng)因子的存在，即發(fā)生生殖反應(yīng)，如果沒(méi)有或較少的生長(zhǎng)因子的存在，則發(fā)生AICD。3）淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的攻擊：免疫活性細(xì)胞，特別是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK），是過(guò)繼性免疫治療的一種重要形式。在抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。這些免疫活性細(xì)胞在攻擊腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床病毒的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在凋亡及其機(jī)制的研究，闡明了一大類(lèi)免疫病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)，特別是細(xì)胞凋亡與腫瘤及艾滋病之間的密切關(guān)系倍受人們重視。HIV感染引起艾滋病，其主要的發(fā)病機(jī)制是HIV感染后特異性地破壞CD4+細(xì)胞，使CD4+以及與其相關(guān)的免疫功能缺陷，易招致機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，但HIV感染后怎樣特異性破壞CD4+細(xì)胞呢？一般認(rèn)為，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)顯著減少的原因，主要是通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制造成的。這不僅闡明了AIDS時(shí)CD4+T細(xì)胞減少的主要原因，同時(shí)也為AIDS的治療研究指明了一個(gè)重要的探索方向。一般認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞是因?yàn)槭Э厣L(zhǎng)，過(guò)度增殖，從細(xì)胞凋亡的角度看則認(rèn)為是腫瘤的凋亡機(jī)制受到抑制不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)。這些基因的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著極為密切的關(guān)系。癌基因中一大類(lèi)屬于生長(zhǎng)因子家族，也有一大類(lèi)屬于生長(zhǎng)因子受體家族，這些基因的激活與表達(dá)，直接刺激了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子許多種類(lèi)的癌基因表達(dá)以后，即阻斷了腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程，使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加，因此，從細(xì)胞凋亡角度來(lái)理解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，是由于腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，腫瘤細(xì)胞減少受阻所致。因此，通過(guò)細(xì)胞凋亡角度和機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)對(duì)腫瘤的治療方法就是重建腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)遞系統(tǒng)，即抑制腫瘤細(xì)胞的生存基因的表達(dá)，激活死亡基因的表達(dá)。自身免疫病包括一大類(lèi)難治性的免疫紊亂而造成的疾病，自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞及產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞是引起自身免疫病的主要免疫病理機(jī)制，正常情況下，免疫細(xì)胞的活化是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程。在自身抗原的刺激作用下，識(shí)別自身抗原的免疫細(xì)胞被活化，從而通過(guò)細(xì)胞凋亡的機(jī)制而得到清除。但如這一機(jī)制發(fā)生障礙，那么識(shí)別自身抗原的免疫活性細(xì)胞的清除就會(huì)產(chǎn)生障礙。有人觀察到在淋巴增生突變小鼠中觀察到Fas編碼的基因異常，不能翻譯正常的Fas跨膜蛋白分子，如Fas異常，由其介導(dǎo)的凋亡機(jī)制也同時(shí)受阻，便造成淋巴細(xì)胞增殖性的自身免疫疾患。4)神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變：老年性癡呆是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的加速而產(chǎn)生的。阿爾茨海默?。ˋD）是一種不可逆的退行性神經(jīng)疾病，淀粉樣前體蛋白（APP）早老蛋白-1（PS1）早老蛋白-2（PS2）的突變導(dǎo)致家族性阿爾茨海默?。‵AD）。研究證明PS參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控PSPS2的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。Bcl-2基因家族兩個(gè)成員Bcl-xl和Bcl-2參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是動(dòng)物細(xì)胞生成ATP的主要地點(diǎn)。線粒體基質(zhì)的三羧酸循環(huán)酶系通過(guò)底物脫氫氧化生成NADH。NADH通過(guò)線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化。與此同時(shí)，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和/或跨膜電位。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜質(zhì)子梯度能量合成ATP。合成的ATP通過(guò)線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體與細(xì)胞質(zhì)中ADP交換進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞的各種需能過(guò)程。1951年，巴黎第八大學(xué)榮譽(yù)教授Glucksmann提出正常脊椎動(dòng)物發(fā)育中的細(xì)胞死亡。1966年，Saunders提出在形態(tài)發(fā)生中細(xì)胞死亡。1972年，Kerr提出細(xì)胞凋亡（apoptosis），說(shuō)明這是在組織動(dòng)力學(xué)方面有廣泛作用的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。1974年，Lockshin提出細(xì)胞程序性死亡。美國(guó)麻省理工學(xué)院教授Horvitz在研究線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)的每個(gè)細(xì)胞的位置、分裂與命運(yùn)都是由遺傳決定的程序所精確地預(yù)先確定的。在構(gòu)成成蟲(chóng)體時(shí)有1090個(gè)細(xì)胞誕生，131個(gè)細(xì)胞死亡。1993年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系終身教授袁鈞瑛發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)的死亡基因ced-3的產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳類(lèi)白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)換酶有同源性。此后，屬于同一家族的十幾個(gè)相關(guān)基因陸續(xù)在哺乳動(dòng)物基因組中被發(fā)現(xiàn)。統(tǒng)稱(chēng)為胱冬肽酶（caspases）。1994年，瑞士蘇黎世大學(xué)分子生命科學(xué)研究所Hengartner發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)的存活基因ced-9的產(chǎn)物與哺乳動(dòng)物原癌基因bcl-2的產(chǎn)物相似。細(xì)胞凋亡的特征是細(xì)胞由于降解酶，主要是水解酶（蛋白酶與核酸酶）的作用，在近乎正常的細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)趨向死亡。這與壞死時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜早期破損不同。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，質(zhì)膜脂雙層喪失二側(cè)不對(duì)稱(chēng)性，磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面，從而導(dǎo)致被吞噬。有陸續(xù)報(bào)道說(shuō)明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程。線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，氧化線粒體內(nèi)膜上的心磷脂。實(shí)驗(yàn)證明，用解偶聯(lián)劑mClCCP會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡。而如果能穩(wěn)定線粒體跨膜電位就能防止細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了動(dòng)態(tài)的由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)的通透性轉(zhuǎn)變孔道（PT孔道）（圖1）。PT孔道由線粒體各部分的蛋白質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)聯(lián)合構(gòu)成。這包括細(xì)胞液蛋白：己糖激酶，線粒體外膜蛋白：外周苯并二嗪（benzodiazepine）受體與電壓依賴(lài)陰離子通道，線粒體膜間間隙蛋白：肌酸激酶，線粒體內(nèi)膜蛋白：ADP-ATP載體，線粒體基質(zhì)蛋白：親環(huán)蛋白D（通過(guò)一些實(shí)驗(yàn)室的研究，以下諸點(diǎn)值得指出：⑴線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)變既是細(xì)胞凋亡的必須條件，也是它的充足條件。⑵PT孔道打開(kāi)后導(dǎo)致線粒體許多功能的致命性變化從而啟動(dòng)了死亡途徑。⑶PT孔道作為許多生理效應(yīng)的感受器（二價(jià)陽(yáng)離子、ATP、ADP、NAD、ΔΨm、pH、巰基與多肽），整合了電生理、氧化還原與細(xì)胞代謝狀態(tài)的信息。⑷PT孔道的組成成分ADP-ATP載體是能量代謝的重要分子，由于ADP-ATP載體是由一個(gè)基因家族的幾個(gè)成員所編碼，它的表達(dá)有嚴(yán)格的組織專(zhuān)一性。因此，PT孔道在不同細(xì)胞中的調(diào)節(jié)可能稍有不同。⑸PT孔道的作用有自放大的效應(yīng)。PT誘導(dǎo)ΔΨm耗散，而反過(guò)來(lái)mClCCP使ΔΨm去極化會(huì)導(dǎo)致PT。一些PT的結(jié)果例如ΔΨm耗散，活性氧的生成本身也會(huì)導(dǎo)致PT。這就說(shuō)明PT會(huì)有正反饋，從而在細(xì)胞凋亡中有自摧毀的作用。反過(guò)來(lái)，如果能防止ΔΨm的耗散，就能避免氧化還原不平衡、磷酯酰絲氨酸的暴露與蛋白酶和核酸酶的激活。PT孔道有開(kāi)放與關(guān)閉二種構(gòu)象。PT孔道開(kāi)放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而PT孔道關(guān)閉能防止細(xì)胞凋亡。當(dāng)PT孔道與環(huán)孢菌素A（cyclosporinA）或SH，或米酵菌酸（bongkrekacid）結(jié)合時(shí)PT孔道被關(guān)閉。在PT孔道開(kāi)放時(shí)線粒體釋放細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）。AIF可能是一種蛋白水解酶，位于線粒體膜間間隙，它能被蛋白酶抑制劑如N-芐氧羰基-纈氨酰-丙氨酰-門(mén)冬氨酰氟甲基酮（PT孔道的作用并不相同。蒼術(shù)苷促進(jìn)PT通道開(kāi)放。這可能與二種抑制劑和ADP-ATP載體的結(jié)合部位不同有關(guān)。蒼術(shù)苷只能與ADP-ATP載體的胞液側(cè)結(jié)合而米酵菌酸可與ADP-ATP載體的胞液及基質(zhì)二側(cè)結(jié)合。⑴若將純化的正常的線粒體與純化的細(xì)胞核在一起保溫，并不導(dǎo)致細(xì)胞核的變化。但若將誘導(dǎo)生成PT孔道的線粒體與純化的細(xì)胞核一同保溫，細(xì)胞核即開(kāi)始凋亡變化。⑵細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白不論是抑制死亡的bcl-2家族還是促進(jìn)細(xì)胞死亡的Bax家族均以線粒體作為靶細(xì)胞器。bcl-2蛋白的C端的疏水肽段能插入線粒體外膜。事實(shí)上相當(dāng)量的bcl-2位于線粒體內(nèi)外膜的接觸位點(diǎn)。⑶高表達(dá)bcl-2能防止ΔΨm的耗散，從而導(dǎo)致對(duì)蒼術(shù)苷、原卟啉I與mClCCP的不敏感與AIF釋放的抑制；反之，高表達(dá)Bax則導(dǎo)致ΔΨm的耗散。細(xì)胞凋亡與線粒體的結(jié)構(gòu)與功能有著密切的關(guān)系。如果線粒體有大量PT孔道形成，細(xì)胞ATP濃度很快下降，則在致凋亡的蛋白酶被活化前細(xì)胞就壞死了。而如果PT孔道的誘導(dǎo)生成是一種比較緩和與持續(xù)的狀態(tài)，在細(xì)胞ATP濃度下降前專(zhuān)一的蛋白酶被激活；而另一方面ΔΨm的耗散產(chǎn)生的超氧陰離子則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是一把雙刃劍。一方面是機(jī)體發(fā)育的正常過(guò)程，另一方面如果細(xì)胞凋亡過(guò)速，則會(huì)導(dǎo)致慢性退行性病變；如果細(xì)胞不凋亡就有可能導(dǎo)致癌變或?qū)煹牟幻舾?。進(jìn)一步研究線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用，有助于深入了解細(xì)胞凋亡的機(jī)制與對(duì)疾病的防治。1)PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測(cè)：PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴(lài)性的磷脂結(jié)合蛋白，能專(zhuān)一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。美國(guó)著名生物試劑公司CLONTECH和Invitrogen公司分別開(kāi)發(fā)了多種標(biāo)記的AnnexinV產(chǎn)品，簡(jiǎn)便快速，10分鐘就可完成檢測(cè)。其中帶熒光標(biāo)記的AnnexinV-EGFP（EnhancedGreenFluorescentProtein）及AnnexinV-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白AnnexinV-EGFP，EGFP與PS的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測(cè)。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的AnnexinV，可通過(guò)常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。另外，MACS公司將磁珠包被AnnexinV，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對(duì)較新的趨勢(shì)，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過(guò)熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類(lèi)型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號(hào)啟動(dòng)的ATP依賴(lài)的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非常活躍時(shí)，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動(dòng)凋亡效應(yīng)器caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。由于GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項(xiàng)檢測(cè)除了對(duì)研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa和3T3細(xì)胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測(cè)。細(xì)胞色素C作為一種信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號(hào)刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1）后啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochromecoxidasesubunitⅣ：CO4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志。ApoAlertTMCellFractionationKit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過(guò)Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和CO4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和CO4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測(cè)上線粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對(duì)此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號(hào)。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrialMembraneSensorKit就采用這種原理來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200bp的DNA片段。對(duì)于這一現(xiàn)象的檢測(cè)通常有以下兩種方法：1)TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的dNTP（多為dUTP）間接（通過(guò)地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過(guò)酶聯(lián)顯色或熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果。美國(guó)Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過(guò)氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測(cè)。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡(jiǎn)便。而間接標(biāo)記有信號(hào)放大的作用，檢測(cè)靈敏度高。當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測(cè)樣品量很少（如活體組織切片）時(shí)，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCRLadderAssayKit通過(guò)LM-PCR（ligation-mediatedPCR），連上特異性接頭，專(zhuān)一性地?cái)U(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測(cè)凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體的梯度片段。LM-PCR檢測(cè)是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。上述兩種方法都針對(duì)細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會(huì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)會(huì)受到其它原因的干擾。這是相對(duì)來(lái)說(shuō)推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒(méi)有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會(huì)縮短，這可能作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-ezeTelemeraseDetectionKit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對(duì)的引物。如果待測(cè)樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通過(guò)PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測(cè)就可觀察到相差六個(gè)堿基的DNALadder現(xiàn)象（參見(jiàn)圖4）。Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)的試劑盒.同樣，這種檢測(cè)方法也不專(zhuān)對(duì)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)異常的基因，檢測(cè)這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as蛋白結(jié)合受體后能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxicTcells）等靶細(xì)胞。Bcl-2和bcl-（長(zhǎng)）作為抗凋亡（bcl-2和bcl-）的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定了細(xì)胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。隨著熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平無(wú)疑比之前者更快更準(zhǔn)確。Invitrogen公司的AmplifluorApoptosisGeneSystems就根據(jù)這一新技術(shù)原理，通過(guò)檢測(cè)fas,bax-alpha和bcl-（長(zhǎng)的）基因的mRNA表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。1．未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。2．染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342），HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為5~1mg/ml。結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱(chēng)為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維護(hù)正常組織和器官的細(xì)胞恒定與生長(zhǎng)平衡，乃至機(jī)體衰老方面都起著重要作用。因此，有關(guān)凋亡的研究在臨床和基礎(chǔ)等各個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛開(kāi)展,凋亡細(xì)胞的檢測(cè)方法顯得非常重要。流式細(xì)胞儀(Flowcytometry,FCM)將流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等集于一體,較其它方法有不可比擬的優(yōu)越性，既可定性又可定量,且具有簡(jiǎn)單、快速和敏感性高的特點(diǎn),可進(jìn)行多參數(shù)和活體細(xì)胞分析。在APO的研究得到較為廣泛的應(yīng)用，開(kāi)辟了新途徑。在FCM系統(tǒng)中，被檢細(xì)胞在液流中通過(guò)儀器測(cè)量區(qū)時(shí),經(jīng)激光照射,細(xì)胞向空間360°立體角的所有方向散射光線,其中前向散射光(FSC)的強(qiáng)度與細(xì)胞大小有關(guān),而側(cè)向散射光(SSC)的強(qiáng)度與質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。細(xì)胞凋亡時(shí),細(xì)胞固縮,體積變小,核碎裂形成,細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多,故凋亡細(xì)胞FSC降低而SSC增高。細(xì)胞壞死由于胞體腫脹,細(xì)胞核亦碎裂分解故FSC和SCC均增高。正常細(xì)胞FSC高而SSC低。根據(jù)光散射特性檢測(cè)凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞表面免疫熒光分析結(jié)合起來(lái),用以區(qū)別辯認(rèn)經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇凋亡的淋巴細(xì)胞亞型,也可用于活細(xì)胞分類(lèi)。值得注意的是,根據(jù)FSC和SSC判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核細(xì)胞漿比率影響很大,因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中,用光散射特性檢測(cè)凋亡的可靠性較好而在腫瘤細(xì)胞凋亡中其可靠性較差。細(xì)胞凋亡時(shí),核酸內(nèi)切酶激活,導(dǎo)致DNA斷裂,這是凋亡的特征性表現(xiàn),也為FCM鑒別凋亡細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。而檢測(cè)細(xì)胞凋亡DNA斷裂的方法中,最常用、最簡(jiǎn)便的就是細(xì)胞DNA含量分析。當(dāng)細(xì)胞用乙醇、Trtion—100處理后細(xì)胞膜上出現(xiàn)漏洞,小片段DNA從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái),使其DNA含量低于正常細(xì)胞的二倍體。用碘化丙啶(PI)染色后分析,可在二倍體C0/G1,峰前出現(xiàn)“亞二倍體”峰,即細(xì)胞凋亡峰(APO峰),根據(jù)APO峰可測(cè)出凋亡細(xì)胞百分率,該法簡(jiǎn)單易行,可大批定量檢測(cè)凋亡標(biāo)本,亦可同時(shí)分析細(xì)胞的細(xì)胞周期位置。另外,應(yīng)用FCM方法通過(guò)對(duì)DNA和RNA的聯(lián)合檢測(cè)可以鑒別出G0期細(xì)胞,因此,可分析細(xì)胞凋亡與G1或G0細(xì)胸的關(guān)系。DNA降解的程度取決于凋亡的階段、細(xì)胞的類(lèi)型和凋亡誘發(fā)因子的特性。染色過(guò)程中DNA的逸出量變化也影響FCM檢測(cè)結(jié)果。據(jù)研究,將高濃度的磷酸鹽———枸椽酸鹽緩沖液加入漂洗液中,可增高降解DNA的逸出量,從而提高鑒別凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞的能力。DNA含量測(cè)定在檢測(cè)細(xì)胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因?yàn)锳PO峰代表了一組細(xì)胞群體,包括凋亡細(xì)胞、機(jī)械損傷細(xì)胞、低DNA含量的細(xì)胞或不同染色體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,在上述情況下,DNA與熒光染料的結(jié)合量均小。另外,非固定的細(xì)胞在低滲溶液中被溶解時(shí),可導(dǎo)致大量的核碎片出現(xiàn),此時(shí)APO峰的細(xì)胞數(shù)目只代表了核碎片的數(shù)目,并不代表凋亡細(xì)胞數(shù)目。敏感性較差的原因是細(xì)胞凋亡早期只有DNA斷裂點(diǎn)出現(xiàn),但尚未出現(xiàn)DNA片段的大量丟失,所以該法不能檢出早期凋亡細(xì)胞和發(fā)生于S期或G2/M期的凋亡細(xì)胞,因?yàn)槠鋵?shí)際含量不低于二倍體細(xì)胞所含的DNA,因此該法進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析時(shí)應(yīng)結(jié)合其它形態(tài)或生化方法,以期更準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。3Y啶橙染色法(AcridineOrange,AO)AO可將細(xì)胞或細(xì)胞核中的雙鏈DNA和變性DNA染成不同顏色的熒光。AO插入雙鏈DNA中時(shí),發(fā)綠色熒光;AO也可與單鏈或通過(guò)變性而產(chǎn)生的DNA單鏈發(fā)生作用,這時(shí)發(fā)出紅色熒光,因此,通過(guò)FCM檢測(cè)不同的熒光,可判斷凋亡的發(fā)生。在測(cè)定被標(biāo)準(zhǔn)化后,綠色和紅色熒光強(qiáng)度的量與總DNA含量成比例,紅色熒光與總體細(xì)胞(紅色加綠色)熒光的比率表示細(xì)胞中變性DNA的比例,因此,這種方法可用于評(píng)價(jià)DNA對(duì)原位變性的敏感性。有時(shí)候,凋亡細(xì)胞DNA降解不明顯,依賴(lài)于DNA降解來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法如細(xì)胞DNA含量測(cè)定、DNA末端標(biāo)記等就難以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡變化。AO法檢測(cè)凋亡的原理不依賴(lài)于DNA片斷的產(chǎn)生,因此其最主要的優(yōu)點(diǎn)是可應(yīng)用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO染色法不能有效區(qū)分有絲分裂細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。細(xì)胞生活狀態(tài)下,胞膜上的鈉-鉀泵、鈣泵等的作用,使細(xì)胞膜內(nèi)外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na+,K+,Cl-,Ca2+等,形成細(xì)胞膜電位。FCM可以檢測(cè)親脂性離子熒光染料在胞膜內(nèi)外的分布,來(lái)測(cè)量膜電位的高低,以評(píng)價(jià)細(xì)胞的活力。Rh123是一種親脂性陽(yáng)離子熒光染料,對(duì)細(xì)胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細(xì)胞存活狀態(tài)時(shí),若丹明123通過(guò)細(xì)胞膜,積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細(xì)胞凋亡時(shí),線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降,電負(fù)性降低,故細(xì)胞線粒體積聚Rh123的能力也喪失,熒光強(qiáng)度降低,據(jù)此檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化。但應(yīng)指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數(shù)細(xì)胞器和細(xì)胞功能相對(duì)較好,因此,Rh123法對(duì)于早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的鑒別比較困難。細(xì)胞凋亡時(shí),DNA斷裂早于形態(tài)學(xué)改變及DNA含量減少,原位末端標(biāo)記(ISEL)是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶和DNA的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷裂相結(jié)合,較前述方面具更高靈敏性。通常有兩種方法:①DNA聚合酶I或klenow大片段介導(dǎo)的單位缺口平移(INST);②末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)。INST是利用DNA多聚酶將核苷酸整合到凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂的DNA處的3’末端,同時(shí)水解5’末端,以修復(fù)DNA,若使用已標(biāo)記的核苷酸即可顯示出有斷裂DNA的細(xì)胞。1993年,Gorczyca等提出了末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)標(biāo)記法采檢測(cè)凋亡細(xì)胞的DNA斷裂,此種方法已得到廣泛應(yīng)用。由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活,細(xì)胞自身的染色質(zhì)或D