真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)琚春梅華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物教研室2006-11-301可編輯課件PPT基因與基因工程基因操作的主要技術(shù)原理基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)基因克隆的載體基因的分離與鑒定基因的表達(dá)與調(diào)節(jié)已講述的內(nèi)容2可編輯課件PPT講述的內(nèi)容提綱

真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)影響真核基因表達(dá)效率的因素3可編輯課件PPT第一節(jié)真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系4可編輯課件PPT1.大腸桿菌表達(dá)體系基因工程的重要目標(biāo)制備大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物因此，要選擇能高水平表達(dá)異源真核蛋白的表達(dá)系統(tǒng)目前常用的表達(dá)系統(tǒng)細(xì)菌（大腸桿菌）、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等5可編輯課件PPT背景清楚，特別是對(duì)其基因工程表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理研究的比較深入。安全，且有多種不同的菌株和質(zhì)粒載體。已有許多真核基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，因此易于進(jìn)行批量生產(chǎn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性6可編輯課件PPT真核基因與原核基因的差別：編碼基因的不連續(xù)性，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌不具備對(duì)pre-RNA進(jìn)行加工剪接的能力。轉(zhuǎn)錄信號(hào)的不同：真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不具備結(jié)合細(xì)菌核糖體所必須的SD序列；細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核啟動(dòng)子。真核基因mRNA5’-端有帽子結(jié)構(gòu)，3’-端有poly(A)尾巴，影響其穩(wěn)定性及與細(xì)菌核糖體結(jié)合的能力，從而阻礙正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯。真核基因在大腸桿菌中表達(dá)存在許多障礙7可編輯課件PPT解決方案將克隆的真核基因插入到原核啟動(dòng)子的下游。從真核細(xì)胞中分離完整加工的mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并連接到合適的載體上，可以克服內(nèi)含子問(wèn)題。如果知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化學(xué)方法合成不含內(nèi)含子序列的寡聚核苷酸片斷。對(duì)于細(xì)菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通過(guò)突變的方法消除。8可編輯課件PPT許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物存在翻譯后的修飾過(guò)程：磷酸化、糖基化等，大腸桿菌中無(wú)此過(guò)程，因此，表達(dá)的蛋白無(wú)法正確折疊，由此產(chǎn)生的三級(jí)結(jié)構(gòu)通常是不可溶的，常形成包涵體，無(wú)活性。表達(dá)的真核蛋白質(zhì)被細(xì)菌的蛋白酶識(shí)別并降解。真核基因在大腸桿菌中表達(dá)存在許多障礙9可編輯課件PPT2.克隆基因正確表達(dá)的基本條件最基本條件：能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)錄：真核基因置于原核啟動(dòng)子的下游

3’-末端具有轉(zhuǎn)錄終止子翻譯：mRNA分子具有RBS（ribosomebindingsite）包括AUG或GUG和與16SrRNA3’-末端互補(bǔ)的

SD（Shine-Dalgarno）序列。10可編輯課件PPT另一個(gè)重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。表達(dá)蛋白被大腸桿菌蛋白酶降解。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)形成的速率與其穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的正確形成需要分子伴侶的參與。大腸桿菌不可能對(duì)所有外源蛋白都存在正確的分子伴侶。11可編輯課件PPT第二節(jié)大腸桿菌的表達(dá)載體12可編輯課件PPTPSDCDSTTAmprOriRBSStartcodonStopcodon大腸桿菌表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)特征13可編輯課件PPT1.表達(dá)載體的基本成分啟動(dòng)子：影響外源基因的表達(dá)水平使外源基因高水平表達(dá)必須具備的條件：強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)子呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平：表達(dá)的外源蛋白可能對(duì)寄主細(xì)胞不利。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物使外源基因獲得表達(dá)，如IPTG、溫度等。14可編輯課件PPT轉(zhuǎn)錄終止子上游啟動(dòng)子會(huì)抑制下游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能(啟動(dòng)子封堵作用)，因此需要在克隆基因編碼區(qū)的3’-末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子。轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。15可編輯課件PPT翻譯起始序列：決定mRNA的翻譯起始效率。未鑒定出其保守結(jié)構(gòu)，只能采取一些方法降低mRNA5’-末端二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，增加RBS中A、T含量，堿基定點(diǎn)突變等。增強(qiáng)子：特殊的序列元件，能顯著增強(qiáng)外源基因的表達(dá)效率。16可編輯課件PPT翻譯終止子：必須存在終止密碼子。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)通常裝上全部的三個(gè)終止密碼子(UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖體的跳躍現(xiàn)象。大腸桿菌最偏愛(ài)的密碼子：UAA當(dāng)為四聯(lián)核苷酸UAAU時(shí)，終止效率進(jìn)一步增強(qiáng)。17可編輯課件PPT2.常用的大腸桿菌表達(dá)載體lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體阻遏物iPOzayRNA聚合酶結(jié)合區(qū)阻遏物結(jié)合區(qū)核糖體結(jié)合區(qū)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)模型18可編輯課件PPTIDNAZYAOPmRNA阻遏蛋白pol沒(méi)有乳糖存在時(shí)阻遏基因19可編輯課件PPTmRNA阻遏蛋白有乳糖存在時(shí)IDNAZYAOPpol啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶20可編輯課件PPTlac操縱子受lac阻遏物的負(fù)調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基中缺乏乳糖或其它誘導(dǎo)物時(shí)，lac阻遏物同操縱單元結(jié)合，關(guān)閉乳糖操縱子的活動(dòng)。培養(yǎng)基中加入乳糖或其它誘導(dǎo)物(IPTG)時(shí)，同阻遏物結(jié)合，使乳糖操縱子去阻遏。因此，我們可以通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。21可編輯課件PPTlac操縱子的控制區(qū)，包括核糖體結(jié)合區(qū)、RNA聚合酶結(jié)合區(qū)及阻遏物結(jié)合區(qū)都位于長(zhǎng)203bp的HaeIII片斷上。203bp的HaeIII片斷含有l(wèi)ac啟動(dòng)子、操縱單元及β-半乳糖苷酶的前8個(gè)密碼子。可以將該片斷插入到質(zhì)粒中，構(gòu)建含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體。22可編輯課件PPT這種多拷貝質(zhì)粒中的操縱單元可以把大腸桿菌中所有的lac阻遏物都結(jié)合掉，使細(xì)菌染色體的β-半乳糖苷酶基因解抑制。含有質(zhì)粒載體（lac啟動(dòng)子、操縱單元）的大腸桿菌能夠合成β-半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物)的瓊脂平板上呈藍(lán)色。這種顯色反應(yīng)可用來(lái)快速鑒定陽(yáng)性克隆。23可編輯課件PPTtrp啟動(dòng)子的表達(dá)載體24可編輯課件PPTTrpTrp高時(shí)Trp低時(shí)mRNAOPtrpR調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶RNA聚合酶?色氨酸操縱子25可編輯課件PPT色氨酸不是作為誘導(dǎo)物，而是作為輔阻遏物結(jié)合trp阻遏分子。被色氨酸激活的trp阻遏分子同操縱單元結(jié)合后，就使得RNA聚合酶失去同trp啟動(dòng)子結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而關(guān)閉trp基因的轉(zhuǎn)錄。因此，當(dāng)色氨酸濃度低時(shí)，trp基因轉(zhuǎn)錄才能開(kāi)始。26可編輯課件PPT將trp操縱子插入到質(zhì)粒載體中，可以構(gòu)建含有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體。這種載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)3-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)，可使外源基因獲得高效表達(dá)。該表達(dá)載體優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)蛋白產(chǎn)量高于lac操縱子表達(dá)系統(tǒng)。27可編輯課件PPTPL啟動(dòng)子的表達(dá)載體28可編輯課件PPT來(lái)源于λ噬菌體，是一種最廣泛使用的大腸桿菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子之一。受阻遏基因cI編碼蛋白的正調(diào)控。cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因，即cI857。cI857或存在于大腸桿菌染色體上，或存在于相容性的質(zhì)粒分子上。29可編輯課件PPTcI阻遏蛋白在42℃時(shí)失活，因此大腸桿菌在42℃培養(yǎng)時(shí)，

PL啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；而在28-30℃培養(yǎng)時(shí)，cI阻遏蛋白有活性，使PL啟動(dòng)子處于抑制狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄停止。利用這一特性，我們只要簡(jiǎn)單地改變培養(yǎng)溫度，就可以誘導(dǎo)或關(guān)閉PL啟動(dòng)子的活性。將PL啟動(dòng)子克隆到質(zhì)粒載體上，可以構(gòu)建由PL啟動(dòng)子啟動(dòng)的表達(dá)載體。30可編輯課件PPT31可編輯課件PPTBamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIII32可編輯課件PPT第三節(jié)真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)33可編輯課件PPT1.外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)：易形成包涵體包涵體：由不可溶性蛋白聚集折疊形成，是外源基因高效表達(dá)時(shí)常發(fā)生的一種特殊生理現(xiàn)象。包涵體形成的理化參數(shù)：對(duì)E.coli80種蛋白研究獲得。

電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸的組分、脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。34可編輯課件PPT分析蛋白質(zhì)的氨基酸組分可以預(yù)測(cè)包涵體形成的概率。每種氨基酸出現(xiàn)在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)中的傾向或者頻率不同。例如：Glu(谷aa)主要出現(xiàn)在

螺旋中

Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在轉(zhuǎn)角中

Pro也常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角中，但一般不會(huì)出現(xiàn)在

螺旋中35可編輯課件PPT36可編輯課件PPT表達(dá)蛋白形成包涵體的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：易于分離蛋白被保護(hù)而免受胞內(nèi)酶的降解蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，不會(huì)對(duì)寄主細(xì)胞造成傷害缺點(diǎn)：很難恢復(fù)生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量低37可編輯課件PPT解決方案：限制包涵體的形成⑴外源基因與分子伴侶共表達(dá)分子伴侶：能夠阻止聚合作用而使蛋白質(zhì)正確折疊。⑵使用硫氧還蛋白缺陷的寄主菌株目的：維持有利的氧化還原電位⑶低溫誘導(dǎo)，降低蛋白質(zhì)的合成速率⑷與高可溶性的多肽融合表達(dá)38可編輯課件PPT周質(zhì)中表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：周質(zhì)中細(xì)胞蛋白少，有利于外源蛋白的純化。周質(zhì)中的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。周質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解作用小。條件：需要信號(hào)肽的引導(dǎo)，使表達(dá)蛋白由細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)。信號(hào)肽：有原核的信號(hào)肽，也有真核的信號(hào)肽。39可編輯課件PPT蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜蛋白質(zhì)跨膜過(guò)程還與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。即使存在信號(hào)肽，也不能保證蛋白正確轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中。如：免疫球蛋白與T-細(xì)胞受體分子結(jié)構(gòu)相似。免疫球蛋白可以在周質(zhì)中表達(dá)。

T-細(xì)胞受體不能在周質(zhì)中表達(dá)。40可編輯課件PPT細(xì)胞外表達(dá)：易于分離純化，但相當(dāng)困難。原因：細(xì)菌細(xì)胞有兩層膜，即內(nèi)膜和外膜，表達(dá)蛋白需跨越兩層膜屏障。解決方案：⑴利用大腸桿菌固有的途徑：將外源蛋白與

E.coli分泌型蛋白融合表達(dá)。

⑵增加E.coli細(xì)胞外膜的滲漏性：信號(hào)肽序列、透化劑、與細(xì)菌素釋放蛋白或具透化作用的基因共表達(dá)。41可編輯課件PPT2.融合蛋白的表達(dá)融合基因的概念：具有來(lái)自?xún)蓚€(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA體外重組構(gòu)建的融合基因：外源基因與啟動(dòng)子融合：編碼產(chǎn)物不一定是融合蛋白。兩個(gè)或以上不同基因的編碼序列組成的融合基因：編碼產(chǎn)物為單一的多肽序列，稱(chēng)為融合蛋白、雜種蛋白、嵌合蛋白。42可編輯課件PPT融合蛋白質(zhì)配偶體作用：阻止包涵體的形成改善蛋白質(zhì)的折疊性能限制蛋白酶的酶解簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的檢測(cè)與純化程序種類(lèi)：GST、His6、MBP等43可編輯課件PPT表達(dá)融合蛋白的策略用融合載體表達(dá)融合蛋白質(zhì)：在設(shè)計(jì)時(shí)注意外源基因與靶基因連接后仍保持正確的讀碼框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0kbPtacBspMIBalIPstIAlwNIpBR2332oriMluIBstEIINarIEcoRVBssHIIStopCodonsIGSTAmpLacIGAATTCTAGAEcoRIXbaI44可編輯課件PPT用融合載體組合表達(dá)融合蛋白質(zhì)：在克隆外源基因時(shí)，不用考慮讀碼框問(wèn)題。45可編輯課件PPT用pBR322質(zhì)粒載體表達(dá)融合蛋白質(zhì)

pBR322質(zhì)粒載體中含有唯一的PstI位點(diǎn)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶和dGTP或dCTP進(jìn)行同聚物加尾。G、C配對(duì)，T4DNA連接酶連接后，總有一部分具有正確的讀碼結(jié)構(gòu)。GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCC46可編輯課件PPT融合蛋白的純化：利用與融合蛋白中的配偶體相對(duì)應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱。通過(guò)配偶體與配體之間的相互作用，過(guò)柱的融合蛋白被滯留下來(lái)，其它蛋白則流出柱外。通過(guò)洗脫處理，可回收到純化的融合蛋白。47可編輯課件PPT48可編輯課件PPT融合蛋白的切割：配偶體的存在可能影響融合蛋白的功能。方法：化學(xué)切割：如溴化氰特異切割甲硫氨酸殘基，AUG不是起始密碼子時(shí)編碼，適合鏈內(nèi)不含甲硫氨酸殘基的多肽的切割。MetGST外源蛋白49可編輯課件PPT

酶切割：如凝血因子X(jué)a，在融合基因之間插入編碼Xa的識(shí)別序列，融合蛋白純化后可用Xa切除大腸桿菌的多肽，得到天然的目標(biāo)蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白50可編輯課件PPT3.外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性

影響因素：蛋白的酶解作用：細(xì)菌細(xì)胞的蛋白酶能選擇性地酶解異常蛋白質(zhì)，包括外源蛋白。

解決方案：外源蛋白在周質(zhì)或胞外表達(dá)使用蛋白酶缺陷的菌株低溫培養(yǎng)、與分子伴侶共表達(dá)

消除蛋白酶切割位點(diǎn)、目標(biāo)蛋白的疏水性修飾51可編輯課件PPT結(jié)構(gòu)決定因子：N-氨基酸性質(zhì)及內(nèi)部的PEST序列N-端法則：N-端為精aa、賴(lài)aa、亮aa、苯丙aa、酪aa、色aa時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差。N-端附近的內(nèi)部賴(lài)aa是遍在蛋白質(zhì)的受體，易受依賴(lài)于遍在蛋白質(zhì)的蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷aa、絲aa、蘇aa的區(qū)段，易發(fā)生胞內(nèi)降解，該序列的磷酸化作用增加了與鈣離子結(jié)合，從而促進(jìn)依賴(lài)于鈣離子的蛋白酶的降解。52可編輯課件PPT表達(dá)部位：周質(zhì)與胞外所含蛋白酶較少，在這些部位表達(dá)的蛋白不易被降解。分子伴侶的穩(wěn)定作用：阻止聚合作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。一種分子伴侶的超量表達(dá)無(wú)法使蛋白正確折疊，不同類(lèi)型分子伴侶彼此協(xié)調(diào)參與蛋白質(zhì)的折疊。53可編輯課件PPT第四節(jié)影響真核基因表達(dá)效率的因素54可編輯課件PPT影響因素：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列密碼子的選擇、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性寄主細(xì)胞的生理特征等55可編輯課件PPT1.5’-UTR對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的影響：?jiǎn)?dòng)子序列具有2種保守序列，即-35區(qū)(5’-TTGACA)和-10區(qū)(5’-TATAAT)。啟動(dòng)子序列與此越相似，其表達(dá)能力越強(qiáng)。-35區(qū)和-10區(qū)之間的距離：也是影響克隆基因表達(dá)效率的重要因素。距離越接近17bp，啟動(dòng)子的活性越強(qiáng)。對(duì)于某些啟動(dòng)子，-35區(qū)上游的10-100bp序列：起上游激活物的作用。56可編輯課件PPT啟動(dòng)子與克隆基因之間距離的影響：發(fā)生2-3nt長(zhǎng)度的變化，就能顯著影響翻譯的效率。與質(zhì)粒mRNA5’-端的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)：SD序列或AUG密碼子參與mRNA分子的堿基配對(duì)會(huì)明顯降低mRNA的翻譯效率。要獲得良好表達(dá)，AUG密碼子或SD序列必須處于易接觸的部位，以利于與核糖體結(jié)合起始翻譯過(guò)程。mRNA5’-末端與SD序列的距離也是影響翻譯效率的重要因素，距離小于15nt時(shí)，翻譯效率會(huì)顯著下降。57可編輯課件PPT提高克隆基因表達(dá)效率的方案：建立克隆庫(kù)：使目的基因放置在與啟動(dòng)子不同距離的位置上，從重組體中篩選產(chǎn)量最高的克隆。對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物難以測(cè)定的基因，可先將其N(xiāo)-端片斷與報(bào)告基因融合，再建立克隆庫(kù)，通過(guò)報(bào)告基因產(chǎn)物的活性來(lái)篩選克隆基因有效表達(dá)的重組菌落。最后將該質(zhì)粒中的報(bào)告基因用克隆基因的C-端片斷替換，即得到高效表達(dá)克隆基因的重組質(zhì)粒。58可編輯課件PPT質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響：提高表達(dá)效率的途徑：增加mRNA的數(shù)量。影響mRNA合成速率的因素有兩種，即啟動(dòng)子的強(qiáng)度和基因的拷貝數(shù)。提高基因的拷貝數(shù)：將其克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。質(zhì)粒的不穩(wěn)定性的影響：發(fā)生質(zhì)粒丟失保持抗生素的選擇壓力將質(zhì)粒分配功能區(qū)par克隆到質(zhì)粒載體上2.質(zhì)粒的生物學(xué)特性對(duì)表達(dá)效率的影響59可編輯課件PPT

對(duì)無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行反選擇P1λcIT1P2外源基因T2轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株溶源性細(xì)菌質(zhì)粒丟失重組細(xì)菌λcI缺陷的λphageλ阻遏物喪失細(xì)菌死亡溶菌60可編輯課件PPT3.mRNA轉(zhuǎn)錄物的分子特性對(duì)表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄起始序列的影響：SD序列的影響：起始密碼子上游的5-10nt，核糖體的結(jié)合位點(diǎn)。與