2024/1/141分子生物學(xué)研究之所以從20世紀(jì)中葉開始得到高速發(fā)展，其主要的原因之一是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。

DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。一、重組DNA技術(shù)2024/1/14240年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息傳遞問題。50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

1重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)2024/1/1432關(guān)鍵性實驗技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠基

1)DNA分子的切割與連接技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學(xué)家有了進行DNA操作的基本工具。2)載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細胞經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收λ噬菌體的DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞也能攝取質(zhì)粒DNA。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。3)Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈反應(yīng)

2024/1/144重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique):是按照人們意愿，在體外對DNA分子進行重組,再將重組分子導(dǎo)入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝。3重組DNA技術(shù)的概念2024/1/1454重組DNA技術(shù)的基本步驟1)四大要素

①外源基因②載體③工具酶④受體細胞

2024/1/1462)重組DNA技術(shù)的基本步驟

①目的基因的獲得與載體的制備②目的基因與載體DNA的連接③重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞④重組體的篩選與重組DNA的鑒定⑤克隆基因的表達及表達產(chǎn)物的檢測與分離純化2024/1/147重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交2024/1/1485重組DNA技術(shù)的意義

重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝

重組DNA技術(shù)縮短了進化時間重組DNA技術(shù)使人能對生物進行定向改造體外大量擴增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。2024/1/149酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5’-OH末端末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3‘末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶Ⅲ從DNA鏈的3’末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5’末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5’或3’末端的磷酸基團6重組DNA實驗中常見的主要工具酶2024/1/1410限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶2024/1/1411第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶2024/1/14127重組實驗中的主要載體定義：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。2024/1/1413克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。2024/1/1414載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。2024/1/1415噬菌體載體：雙鏈DNA病毒，約50kb,兩端有一個12個核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌體黏粒、YAC、BAC：高容量載體2024/1/1416不同克隆載體所容納的外原DNA片段的大小質(zhì)粒：10kbλ噬菌體：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb2024/1/1417

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程2024/1/1418二、常見的DNA操作技術(shù)

1細菌轉(zhuǎn)化細菌轉(zhuǎn)化：將一種細菌的DNA導(dǎo)入到另外一種細菌菌株而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。細菌轉(zhuǎn)化方法：CaCl2法和電刺激法2024/1/14191）CaCl2法

原理：大腸桿菌在低溫（0℃

）預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細胞膨脹，膜透性改變，易與外源DNA粘附并在細胞表面形成復(fù)合物。然后42℃熱刺激，外源DNA就可能被細胞吸收。將轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選陽性克隆。2024/1/1420大腸桿菌載體0℃CaCl2選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選陽性克隆得到大量目的基因CaCl2法2024/1/14212）電擊法

原理：電脈沖在細胞表面造成小凹陷，形成納米級疏水孔洞。隨著電壓增加，疏水孔洞變成親水孔洞。這樣，介質(zhì)中的DNA就易于通過孔洞進入細胞質(zhì)。電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，最好在0－4℃進行。2024/1/14223）體外包裝法

原理：利用噬菌體能夠?qū)NA注入到寄主細胞中的特點。包裝的基因工程噬菌體顆粒能夠借助細菌表面的噬菌體接受器位點將DNA注入受體細菌，并在細胞中得到繁殖和表達。2024/1/1423噬菌體作載體將DNA注入到寄主細胞中的方法插入型替換型限制性內(nèi)切酶切割加入外源DNADNA連接酶連接噬菌體外殼蛋白包裝感染細菌通過受體蛋白將外源DNA注入宿主細胞內(nèi)2024/1/14242、PCR技術(shù)－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)

是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。

經(jīng)n次擴增后,一個DNA分子可變?yōu)?n個DNA分子。2024/1/1425原理：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的引物。引物與互補DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在TaqDNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由臁⒆詣雍铣尚碌腄NA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴增。2024/1/1426

新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴增。

2024/1/1427

PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。2024/1/14282024/1/1429待擴增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl緩沖液+兩條引物+TaqDNA聚合酶+Mg2+95℃變性30″60℃退火30″72℃延伸1′

雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA；使引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上

●在DNA聚合酶的作用下，從引物的3’-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互補鏈。2024/1/1430PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察2024/1/14313、cDNA噬菌體文庫原理：cDNA是從mRNA反轉(zhuǎn)錄來的DNA。cDNA組成特點是其中不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列，做cDNA克隆時應(yīng)是先從獲得mRNA開始，在此基礎(chǔ)上，通過反轉(zhuǎn)錄酶作用產(chǎn)生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復(fù)制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。2024/1/1432高質(zhì)量mRNA的制備反轉(zhuǎn)錄生成cDNA與噬菌粒載體分子相連接噬菌粒的包裝

cDNA噬菌粒文庫的主要步驟：2024/1/14331）高質(zhì)量mRNA的制備用試劑盒提取總RNA加入與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育加入與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNA2024/1/14342）反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以寡聚dT或隨機6核苷酸為引物反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準(zhǔn)備與載體連接2024/1/14353）與噬菌體載體分子相連接帶有接頭的cDNA噬菌粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶切割含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA2024/1/14364）噬菌粒的包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌粒DNA體外蛋白質(zhì)外殼的包裝反應(yīng)有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體進行基因組學(xué)的研究含有某種組織或器官的噬菌粒文庫2024/1/14372024/1/14384基因敲除技術(shù)概念：基因敲除技術(shù)（geneknockout)又稱基因打靶（genetargeting）。這種技術(shù)是通過基因工程的方法將一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又稱基因敲入），然后從整體觀察實驗動物，從而推測相應(yīng)基因的功能。這種人為地把實驗動物某一種有功能的基因完全缺失的技術(shù)稱為基因敲除技術(shù)。2024/1/14391）完全基因敲除完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性。原理:應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。

2024/1/1440基本路線:表型分析構(gòu)建載體同源重組篩選已擊中的ES細胞顯微注射回交得到X被敲除的動物ES細胞的獲得得到純合體2024/1/1441正－負雙向選擇：neo:正向選擇基因，插入載體靶DNA的外顯子；HSK-tk:負向選擇基因，目的片斷外側(cè)，不能在選擇培養(yǎng)基上生長。2024/1/14422）條件型基因敲除

條件型基因剔除是指某一特定細胞類型或細胞發(fā)育的特定階段剔除某一特定基因的技術(shù)。

常用的條件型基因敲除有：噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)、R/RS系統(tǒng)2024/1/1443

原理：通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP

的(“l(fā)oxP

floxed”)ES

細胞產(chǎn)生“l(fā)oxPfloxed”小鼠,然后，通過將“l(fā)oxP

floxed”小鼠與Cre

轉(zhuǎn)基因鼠雜交，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式修飾的條件性突變小鼠。2024/1/1444

在“l(fā)oxP

floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxPnoxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當(dāng)它與Cre

轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時，產(chǎn)生的子代中將同時帶有“l(fā)oxP

floxed”靶基因和Cre

基因。Cre

基因表達產(chǎn)生的Cre

重組酶就會介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的1oxP間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個loxP

和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre

的表達為前提的。2024/1/1445

Cre

的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre

在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細胞；而Cre

的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。所以只要控制Cre

的表達特異性和表達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。2024/1/14462024/1/1447構(gòu)建打靶載體同源重組篩選中靶ES顯微注射雜交刪除neor基因特定階段誘導(dǎo)Cre酶切除目的片段動物觀察分析Cre-loxP重組系統(tǒng)進行條件性基因剔除的程序：體外培養(yǎng)2024/1/1448三、基因克隆技術(shù)簡介1RACE(rapidamplificationofcDNAends)一種通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴增出某個特異位點到3′或5′端之間未知序列的方法。

2024/1/1449mRNA的獲取去磷酸化加寡聚接頭（5′）反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA

5′RACE，擴增5未知序列3′RACE擴增3′未知序列5′已知的接頭序列；基因特異反向序列3′寡聚dT下游序列；基因特異反向序列2024/1/14502cDNA差示分析法(cDNA-RDA法)差減雜交與RT-PCR方法相結(jié)合，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增目的基因片段2024/1/1451主要步驟是：mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用4堿基識別酶消化，與接頭1連接，PCR擴增；去除接頭1，擴增子接上接頭2，與驅(qū)逐子雜交，PCR擴增；去除接頭2，加上接頭3，再與driver雜交，再擴增，篩選出目的片段、克隆、測序。2024/1/14523酵母雙雜交體系

（Yeasttow-hybridsystem）

Two-hybridsystem也叫interactiontrap（相互作用陷井），是90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（targetprotein）相互作用的基因。2024/1/1453基本原理：

真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨立的結(jié)構(gòu)域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結(jié)合域（BD），其C端768-881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應(yīng)基因啟動子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，而此時，AD則推動了轉(zhuǎn)錄起始。

若用基因工程的方法，將GAL4AD和BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細胞株中表達，效應(yīng)基因無法被激活,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的AD或BD區(qū)域連成一個功能基因。2024/1/14542024/1/1455主要實驗過程：

a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株

b.研究的獵物(或稱靶蛋白)蛋白的基因與編碼AD的序列結(jié)合

c.誘餌(bait)蛋白的基因與編碼BD的序列結(jié)合,形成兩段融合基因

d.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于選擇培養(yǎng)基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白（激活報告基因轉(zhuǎn)錄）的陽性菌落。2024/1/1456酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能研究抗原和抗體的作用（細胞內(nèi)）篩選藥物的作用位點建立基因組蛋白連鎖圖2024/1/1457

局限性：

⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報告基因的表達，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。2024/1/14581986年提出，根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達產(chǎn)物的有關(guān)信息，但必須建立遺傳分離群體主要用于與遺傳病相關(guān)基因等致病基因的克隆4基因的圖位克隆法（Map-basedcloning）2024/1/1459通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計算的，1cm（厘米）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，1cm≈3500kb。2024/1/1460主要包括以下6個步驟：

1.篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。利用目標(biāo)基因的近等基因系或分離群體分組分析法（BSA）進行連鎖分析，篩選出目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記。

2.構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫。用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫，得到陽性克隆。

3.構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群。以陽性克隆的末端作為探針基因組文庫，并進行染色體步行，直到獲得具有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段跨疊群。

2024/1/1461

4.目的基因區(qū)域的精細作圖。通過整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標(biāo)記，提高目的基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜的密度

5.目的基因的精細定位和染色體登陸。利用側(cè)翼分子標(biāo)記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因。接著以目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針通過染色體登陸獲得含目標(biāo)基因的陽性克隆。

6.外顯子的分離、鑒定。陽性克隆中可能含有多個候選基因。用篩選cDNA文庫，外顯子捕捉和cDNA直選法等技術(shù)找到這些候選基因，再進行共分離，時空表達特點，同源性比較等分析確定目標(biāo)基因。2024/1/14622024/1/14632024/1/14641、基因表達系列分析技術(shù)（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）

基因表達系列分析（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）技術(shù)在理論上來說可以檢測到一個細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄體的表達，而且可以給每一個轉(zhuǎn)錄體定量，不管它是低豐度還是高豐度。

四、基因表達研究技術(shù)2024/1/14651995年Velculescu提出的，是近幾年來發(fā)展起來的一種快速分析基因表達信息的技術(shù)。它通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息。它的顯著特點是能夠大量獲取基因組范圍基因表達的類別與豐度。2024/1/1466

SAGE技術(shù)已成功地應(yīng)用于特異組織或細胞的轉(zhuǎn)錄組研究和mRNA群體間差異表達基因的鑒定。基因表達系列分析（SAGE）以構(gòu)建能獨特代表基因轉(zhuǎn)錄本序列的標(biāo)簽（tag）為宗旨，標(biāo)簽長度約9－12bp，同一tag在某組織中出現(xiàn)的頻度反應(yīng)了該tag所代表基因在這種組織中的表達豐度。2024/1/1467SAGE的原理

從三方面保證能唯一性的鑒定轉(zhuǎn)錄本并精確的反映其表達豐度。首先，SAGE從每個轉(zhuǎn)錄本特定位置唯一性的截取10－11bp的序列，該序列即為SAGE標(biāo)簽。通過測序，特定標(biāo)簽的出現(xiàn)數(shù)目就可以反映它所代表的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度。其次，為了克服這種基于測序的方法可能存在的通量限制，SAGE采取了系列化處理，從而測得的每個序列可以包含25－50個標(biāo)簽。最后，同其他方法一樣，SAGE也采用了聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）擴增，但是，特定的識別機制避免了可能產(chǎn)生表達譜的擴增偏倚（AmplificationBias）。

2024/1/1468

具體的實驗路線：

1.以oligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以一種限制性內(nèi)切酶（錨定酶）酶切。

2.將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。每一種接頭都含有標(biāo)簽酶酶切位點序列。

3.用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段（約9-10堿基），混合并連接兩個cDNA池的短cDNA片段，構(gòu)成雙標(biāo)簽后，以引物A和B擴增。

4.用錨定酶切割擴增產(chǎn)物，抽提雙標(biāo)簽（Ditga）片段并克隆、測序。

2024/1/1469SAGE的主要過程分為三個階段：第一階段是SAGE文庫的構(gòu)建。包括五個步驟：1、雙鏈cDNA的獲得。2、生物素化的3`-cDNA的獲得。3、帶接頭的SAGE標(biāo)簽的獲得。4、SAGE雙標(biāo)簽的獲得。5、SAGE雙標(biāo)簽多聚體的獲得以及克隆。第二階段是SAGE文庫的測序。利用質(zhì)粒載體上的通用引物，對插入片斷進行單向測序。

2024/1/1470第三階段是標(biāo)簽序列的提取。主要有6個步驟：1、在雙標(biāo)簽多聚體序列中定位NlaIII酶切位點（即CATG）；2、提取CATG位點之間的20－26個堿基長的雙標(biāo)簽序列；3、去除重復(fù)出現(xiàn)的雙標(biāo)簽序列，包括在反向互補方向上重復(fù)的雙標(biāo)簽序列；4、截取每個雙標(biāo)簽序列最靠近兩頭末端的10堿基，即為標(biāo)簽序列；5、去除與接頭序列相對應(yīng)的標(biāo)簽（即TCCCCGTACA和TCCCTATTAA），同時去除含有不確定堿基（即除A、C、T、G四種堿基以外的堿基）的標(biāo)簽；6、計算每個標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)，以列表的形式給出一個包含每個標(biāo)簽及其表達豐度的報告。

2024/1/1471Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技術(shù)流程反轉(zhuǎn)錄酶切連接測序單條測序＝＝對30－40條EST測序分析由于采樣量大大提高，可對低表達基因進行分析：基因表達量分析、尋找新基因等等實驗步驟較長要求較高2024/1/1472SAGE的優(yōu)點：

*發(fā)現(xiàn)低豐度轉(zhuǎn)錄本

*檢測向上或向下調(diào)控的基因

*測量表達的復(fù)合效應(yīng)

*鑒定新基因

2024/1/14732原位雜交（insituhybridization）

將標(biāo)記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。

特點：能在成分復(fù)雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)2024/1/1474原位雜交技術(shù)包括有：菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）、斑點雜交法（Dotblot）、Southern印跡雜交（Southernblot）、Northern印跡雜交（Northernblot）、組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）和基因組原位雜交（Genomeinsituhybridization)2024/1/1475原位雜交技術(shù)主要步驟：材料處理及細胞樣品的固定；樣品的制備和預(yù)處理；探針的制備和預(yù)雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測雜交信號，進行結(jié)果分析。2024/1/1476基因組原位雜交大小麥雜交后代中大麥遺傳物質(zhì)的鑒定以特異序列為探針鑒定rDNA在染色體上的分布

2024/1/14773.基因的定點誘變（site-directedmutagenesis）

使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。

a.盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。2024/1/14782024/1/14792024/1/14804、RNAi技術(shù)一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。siRNA（smallinterferingRNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標(biāo)，降解特定的mRNA。2024/1/1481dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi

抑制基因表達的機理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA2024/1/1482一般路線：2024/1/1483Dicer降解后的mRNA作為模板在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下形成siRNARNAi作用機制圖解誘導(dǎo)沉默復(fù)合體2024/1/1484＋CHSGene矮牽牛花2024/1/1485

應(yīng)用：

1

RNAi在探索基因功能中的應(yīng)用：由于RNAi技術(shù)可以利用siRNA或siRNA表達載體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時siRNA表達文庫構(gòu)建方法的建立，使得利用RNAi技術(shù)進行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點有重要意義。

2024/1/1486

2

RNAi在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用：在利用RNAi技術(shù)對HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等進行基因治療研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時避免對正常組織的毒副作用。

3

RNAi在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景：使用RNAi技術(shù)剔除黑素瘤細胞的BRAF表達，不僅抑制了腫瘤細胞生長，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。

2024/1/1487五、基因芯片

(DNA芯片,微陣列,microarray)

近年發(fā)展起來的分析基因表達圖式的新方法。將大量DNA片段探針分子固定于支持物上,與標(biāo)記的樣品分子雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度獲取樣品分子數(shù)量和序列信息。其可高效快速地同時測定大通量基因的時空表達信息，已迅速應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。

2024/1/14882024/1/1489酵母全基因組12000geneson5X7cm2024/1/1490基因芯片主要特點

操作簡單,自動化程度高序列數(shù)量大,檢測效率高應(yīng)用范圍廣，成本相對低檢測敏感性高，后繼工作有一定難度2024/1/14912024/1/1492六、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究技術(shù)1.雙向電泳技術(shù)(2DE)

原理:第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離（IEF），第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。2024/1/1493由于2DE是依據(jù)蛋白質(zhì)的兩種不同性質(zhì)，即等電點和分子量進行分析，因此分辨率遠高于其他任何一種單一的電泳方法，是目前分析混合蛋白質(zhì)樣品最有效的手段。完整的雙向凝膠電泳分析，包括樣品制備、等電聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、SDS—PAGE、斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟。2024/1/14942DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）2024/1/14952024/1/1496CyTM5labelledgelSilverstainedgelE.coli

lysate,50

gloading,pH4-72024/1/1497用于分離細胞或組織蛋白質(zhì)粗提物構(gòu)建特定組織或細胞的蛋白質(zhì)“二維參考圖譜”；分析特定時間與病理、生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達情況，進行蛋白質(zhì)組差異比較。2024/1/14982.質(zhì)譜技術(shù)基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。2024/1/14991）特點：分子電離時保留整個分子的完整性，不會形成碎片離子。靈敏度高、快速、能同時提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復(fù)雜體系。2024/1/141002）類型：基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionizationmassspect