1DB36/T—2019芋脫毒種莖生產技術規程本標準規定了芋試管種莖生產所需的儀器設備及化學試劑，培養基配制，材料選取、莖尖脫毒培養，脫毒苗增殖，試管種莖誘導，脫毒種莖移栽與貯存，脫毒種芋繁育的操作規程。本標準適用于芋脫毒種莖的生產。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29378-2012馬鈴薯脫毒種薯生產技術規程DB36/T919-2016綠色食品紅芽芋DB36/T921-2016紅芽芋脫毒種芋繁育技術規程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1脫毒苗應用莖尖組織培養技術獲得的再生試管苗，經檢測確認不帶芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）等病毒，即確認為脫毒苗。3.2脫毒種莖用脫毒苗在無菌環境下誘導形成的微型球莖。3.3原原種利用試管苗在容器內生產的試管芋或在防蟲網室內無菌營養基質條件下培養生產出來的、不帶病毒、類病毒的種芋。4組培所需的儀器設備及化學試劑4.1儀器設備2DB36/T—2019培養基制作及滅菌設備：天平、純水機、酸度計、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風干燥箱等。無菌操作設備：超凈工作臺、滅菌器等。培養室設備：空調、定時器、培養架、搖床、光柵培養箱、人工氣候室等。藥品儲存與配制設備：冰箱、萬分之一天平。觀察分析儀器：解剖鏡、顯微鏡、切片機等。4.2常用器皿及器材包括培養器皿（試管、錐形瓶、培養皿及各類專用培養瓶等）、培養基分注器、細菌過濾器、金屬操作器械（鑷子、剪刀、解剖刀等）、盛裝器皿（燒杯、試劑瓶等）、計量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。4.3常用化學試劑包括組培苗基本培養基所需的無機鹽類、有機物類及植物生長調節物質類等。MS基本培養基成分及母液配制參見附錄A；其它常用試劑及植物生長物質的配制參見附錄B。5培養基制作5.1培養基配制制作培養基前需先配制MS基本培養基母液（配方及配制方法見附錄A），配好后4℃保存（保存期不超過180d）。采用附錄C方法配制好固體MS培養基，組培瓶分裝后放入高壓蒸汽滅菌鍋（0.1Mpa，121℃)滅菌20min，取出冷卻凝固后備用。5.2培養基配方莖尖成苗培養基：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養基；組培苗增殖培養基：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養基；脫毒種莖誘導培養基：MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖+7g瓊脂粉，pH5.8，固體培養基；6材料選取選擇具備多子芋品種（如紅芽芋、白芽芋、花果芋等）典型性狀的株系，挑選植株健壯、長勢良好的子芋球莖作為誘導材料。7莖尖脫毒培養7.1莖尖剝離3DB36/T—2019首先，選取符合品種特性、形狀規則的子芋帶芽球莖，切下0.5cm左右的頂芽或側芽，剝下外層鱗片2-3層，清水沖洗干凈。其次，將芽置于干凈燒杯中，在超凈工作臺上進一步消毒（75%酒精浸泡45s，無菌水沖洗，0.1%氯化汞浸泡8min，無菌水沖洗干凈）。第三，將消毒后的芋芽置于解剖鏡操作臺，用鑷子和解剖刀片對芋芽莖尖進行剝離，一手用鑷子固定芋芽，一手用解剖刀片進行鱗片剝離，直至將鱗片剝離至可見近似球形莖尖（大小約0.2~0.4mm用解剖刀片挑起剝離好的莖尖，接種于MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，調pH至5.8左右）試管培養基中。7.2莖尖培養將接種莖尖的試管培養基放置于人工氣候培養箱中培養（25℃,4000lx，14h/d待莖尖長至1個月時，將莖尖移至組培瓶中培養（MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，調pH至5.8左右）），進一步培養成苗。7.3組培苗病毒檢測莖尖培養的組培苗在誘導增殖之前進行病毒檢測，芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）等病毒，可采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測法（DAS-ELISA）和（或）反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測法，具體檢測方法按GB/T29378-2012執行。然后送到國家法定植檢部門復檢認定，沒有檢出DsMV和CMV等病毒的脫毒苗，即為脫毒苗?？蓪γ摱久邕M一步進行增殖擴繁。8脫毒苗增殖將脫毒苗基部自發根系切除，然后將其轉接到增殖培養基上培養（MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA），培養1個月后，將增殖的芽再繼續切成單芽在增殖培養基上繼代培養，每繼代1次單芽可增殖5~7個，每株脫毒苗繼代擴繁5次后，可獲得3000~4000株脫毒苗。9脫毒種莖誘導選取株高4cm~5cm的健壯試管苗，將莖基部自發根系切除，轉接到MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖固體培養基上，在室溫25℃,4000lx光強和16h/d條件下培養，7d后可見脫毒苗基部膨大，40～50d試管芋發育到縱徑1.0cm，橫徑0.5cm以上時可以收獲。10脫毒種莖移栽收獲時將試管芋從培養瓶中取出，用清水多次沖洗，直至洗凈表面附著的培養基，種植在滅菌后的草炭+蛭石（2:1）的營養基質中，在人工氣候培養室培養成苗，當年收取地下微球莖，作為芋原原種。11脫毒種莖貯存4DB36/T—2019從培養基上收獲的試管芋洗凈后，于陰涼處晾干，再貯藏于透氣的容器中，置于4°C條件下保存。試管芋經國家法定植檢部門檢驗合格后，方可作為芋生產用種。12脫毒種芋繁育在3月下旬至4月上旬，按照DB36/T919-2016的要求進行生長環境的選擇，脫毒種芋的繁育按照DB36/T921-2016的規定實施。附錄AMS培養基母液配方及配制母液成分用量定容每升用量母液1（50倍）NH4NO382.5g1000mL20mLKNO395.0gMgSO4·7H2O母液2（100倍）CaCl2·H2O44.0g1000mL母液3（100倍）KH2PO41000mL母液4（100倍）Na2-EDTA3.730g1000mLFeSO4·7H2O2.780g母液5（50倍）H3BO30.31g1000mL20mLMnSO4·4H2OZnSO4·7H2O0.43gKI0.0415gNaMoO4·2H2O0.0125gCuSO4·5H2O0.00125gCoCl2·6H2O0.00125g母液6（200倍）肌醇20.0g1000mL5mL甘氨酸0.4g煙酸（VB3）鹽酸吡哆醇（VB6）煙酸硫胺素（VB1）0.020g注：用少量蒸餾水將藥品分別溶解，依次混合，加蒸餾水定容至所需體積。5DB36/T—2019附錄B植物生長調節物質母液配制MS培養基配制1LMS基本培養基配制：根據培養基成分準備好蒸