放射配基受體結合法

RadioLigand

ReceptorBindingAssay

（RRA）

實驗藥理學

中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所

放射配基結合測定法是可以定量測定配基與受體結合的參數的一種方法。與受體結合的配基可以是激素、神經遞質、生長因子等內源性物質和相關藥物。放射配基結合測定法的基本操作是比較簡單的，將含有受體的制備物與適當的放射配基一起溫孵一段適當的時間，然后對與受體結合的放射活性進行測定。主要包括三種類型的實驗：飽和實驗，競爭實驗和動力學實驗。我們將依次介紹受體制備，放射配基，檢測條件，分離結合與游離放射配基的方法，數據分析等實驗內容。

一、受體制備

1.目的：受體制備是在放射配基結合實驗前將含有某種受體的組織進行預處理，使之更符合實驗的要求。2.步驟1）將組織或細胞在低滲緩沖液中勻漿。通常大部分受體在數小時是比較穩定的。但為了保持活性，經常將組織盡快地放置在冰內。纖維組織，例如肺，應該用尼龍網（～50μm）加以過濾。2）慢速離心（500g）可幫助除去組織中某些不需要的部分(細胞核及大碎片)

。

3）將勻漿在盡可能快的轉速下離心5-10min，但不要用超速（即50,000g）。盡管對于很多受體并不需要低溫，但離心常規是在4℃下進行。4）將沉淀用相同緩沖液再度勻漿和離心。最終的組織制備被稱為粗微粒部分或膜部分。5）兩步離心的目的是去除任何可溶性干擾物，如內源性的神經遞質、鳥嘌呤核苷酸等，它們可能干擾放射配基結合測定。

3.注意事項1）勻漿緩沖液勻漿緩沖液的選擇通常不是關鍵，對于大部分受體制備，在中性pH下的任何緩沖液已經足夠。對于某些受體推薦在勻漿緩沖液和/或溫孵液中加入EDTA，以完全去除各種內源性物質。質

2）受體制備的貯存大部分在冷凍下是穩定的，原組織或膜部分均能貯藏在-20℃或-80℃一段時間。某些受體和小塊組織（10mg）儲存后效果不好，應該用新鮮組織進行測定。

二、放射配基

對于任何受體系統，商業上可提供若干種放射配基，要根據放射配基的特征和要解決的問題加以選擇。應考慮的問題包括：放射性同位素的種類（通常是3H或125I），非特異結合的程度，放射配基對受體的選擇性和親和力以及放射配基是激動劑還是拮抗劑等。

1.放射配基的種類

3H放射配基的優點是在化學上較穩定，生物學上與非標記的化合物沒有差異，有較長的半衰期（12年），標記配基經常使用數月或更長時間，但它的特異活性較低（30-100Ci/mmol）。而125I的半衰期短（60天），它的放射配基通常每4-6周購買和準備一次。碘標放射配基的優點是比較高的特異活性（2,200Ci/mmol），在受體密度低和組織數量少時特別有用。使用碘標配基不需要閃爍液，免除了購買閃爍液的費用和操作步驟，因而方便和價廉。

2.放射配基的親和力

放射配基與受體親和力越高越好，因為測定中可以使用較低濃度的放射配基，且非特異結合的水平也較低。另外，親和力越高，解離速率越慢，操作較方便。

3.放射配基的稀釋有時，為了將一個測定管的特異活性的最大值限制在106計數/min（cpm），可以用非標記配基稀釋125I放射配基，從而降低其特異活性。另外，非標記配基應該使用非活性的含碘配基，而不是非碘的配基，因為后者與放射配基在化學上是不同的，可能有不同的藥理學特征。

4.放射配基的總結合通常放射配基的非特異結合越低越好。一個測定中如果50%總結合是特異的，它被認為是合格的；70%是好的，90%是非常好的。

三、溫孵條件

1.時間和溫度

對于飽和和競爭結合，所用的模型是平衡實驗。溫孵的時間要足夠長，以保證達到平衡（或至少是穩態）。由于達到穩態的時間依賴放射配基的濃度，在預測溫孵時間時，應使用低濃度的放射配基。室溫下，使用接近它們Kd的濃度，20-60min可達到穩態。如果在20和60min之間結合是恒定的，那麼可選定溫孵時間為30min。盡管有人認為生理溫度（37℃）更好，但實際上在室溫下（22℃）測定最為方便。另外，某些測定選在冰中（4℃）進行，因為在這個溫度下的數據重復性較好。

2.緩沖液

通常緩沖液pH在生理范圍，即pH7和8之間。實驗中經常使用Tris作為緩沖液，主要原因是使用方便，因為商品Tris是預先配制好的，不需要調整pH。但Tris不一定是最好的，可試用其它的緩沖液。

3.放射配基的濃度

在測定中，放射配基采用的濃度要依據實驗的類型。對于動力學實驗，濃度應較低，只要保證測定計數（例如＞300cpm）即可，大約為0.2×Kd較好。對于競爭實驗，使用相似的濃度，約為Kd或更低一些。對于飽和實驗，如果可能，放射配基濃度范圍應該是～0.1×Kd～10×Kd。如果放射配基與一個以上受體位點結合，對高親和力位點（低Kd）應采用0.1×Kd，對低親和力位點（高Kd）應采用10×Kd。

4.受體濃度

在合理的范圍內，組織（受體）濃度越高，結合越好。增加受體濃度將增加特異結合對非特異結合的比率，因為非特異結合中的大部分是與玻璃纖維濾膜的結合。粗略地看，如果加入的放射配基有＞10%被結合，那麼組織的濃度就太高了。另外，特異結合的量與組織濃度應該呈線性關系。對于大部分受體測定實驗，一般采用的組織濃度范圍是2-10mg/ml濕重組織，或者～100-500μg/ml膜蛋白。對于轉染細胞，它們的受體是過表達的，測定采用的蛋白濃度應該大大降低。

5.非放射活性藥物的濃度

如果競爭性藥物抑制放射配基結合是按照單一位點模型，那麼大約10倍抑制劑濃度是足夠的。如果涉及多位點結合或親和力狀態，那麼至少需要20倍濃度，跨越更大范圍。

6.確定特異性結合1）特異性結合和非特異性結合

在所有放射配基結合測定中最重要的是確定特異性結合。從概念上講，特異性結合可以被定義為與受體的結合。非特異結合是除此以外其它的結合。實際操作上講，非特異結合是有適當的過量非標記藥物存在（例如：比IC50高100倍），受體被完全阻斷時的結合。非特異結合包括放射配基與其它受體位點、玻璃纖維濾膜的結合，組織的吸附和溶解于膜脂類等。特異性結合是總結合與非特異結合的差值。特征上講，非特異結合達到穩態比特異性結合要快，當放射配基濃度增加時不會飽和。

2）注意事項用于確定非特異結合的藥物濃度不要太高，因為很高的藥物濃度也可能抑制非特異結合。確定非特異結合的一個好方法是用不同的非標記配基進行抑制實驗。在比IC50高100倍濃度下，它們對結合的抑制程度應該是相同的。在測定非特異結合時，最好用與放射配基化學上不相似的藥物。這是因為相似藥物可能抑制與放射配基同樣“特異的”結合，但并不是受體的結合位點。如果可能，應避免使用放射配基的非放射活性形式。有很多例子表明，在確定非特異結合時，由于未很好選擇藥物或濃度，導致錯誤的數據和結論。放射配基的總結合、非特異性結合和特異性結合。

四、結合與游離放射配基的分離

受體結合測定的一個關鍵步驟是分離結合與游離放射配基。在進行分離時，防止受體-放射配基復合物的解離是很重要的。降低溫度可以減慢解離的速率，快速操作可以縮短解離的時間。

對于膜結合測定經常使用的技術是玻璃纖維濾膜的真空過濾。通過過濾將含有放射配基-受體復合物的膜碎片留在濾膜上，游離的（未結合的）放射配基與濾液一起穿過濾膜被棄去。用大量的緩沖液洗滌膜碎片和濾膜可降低非特異結合。另外，預先將濾膜用某種溶液（如0.1%聚乙烯亞胺水溶液）洗滌或浸泡一段時間，也可減少濾膜上的非特異結合。在某些測定中，選擇濾膜的材料也是很重要的。

過濾法的優點是快速和方便。缺點是只有在放射配基-受體復合物的親和力高于10nM時才能應用。它的主要非特異結合是與濾膜而不是與組織制備的結合。對于放射配基與受體的親和力在10nM-1μM范圍（這時解離可能太快）的測定，以及與濾膜的非特異結合高得不能應用時，經常使用離心技術來代替過濾。五、配體結合試驗類型和結果分析

（一）飽和曲線

用一固定濃度的受體蛋白和不同濃度的放射配體一起孵育，將特異性結合與配體濃度作圖，可畫出一矩形拋物線即飽和曲線。放射配基受體結合的飽和曲線

1.

Clark模型：配體受體結合反應為可逆雙分子反應（L+R→LR）；所有受體都是等效和獨立的；配體本身不代謝，也不與其它位置結合；生物效應正比于結合受體數目。根據質量作用定律：平衡時（LT）>>(RL)(LT)≈(L)KD＝

（1）

故

KD=

（2）

(LT)總配體濃度；（L）游離配體濃度；（RL）結合配體濃度；(RT)總受體濃度，即最大結合；KD平衡解離常數；KA親和常數

KA=1/KD2.Scatchard作圖：（2）式變換

（3）

用對（RL）作圖，可得直線，其斜率為－

，橫軸截距為（RT）。

飽和實驗的Scatchard作圖

3.Hill作圖：當配體受體結合反應不是簡單的雙分子反應時，

R+nL=RLn根據質量作用定律

經變換有log(

)=nlog(L)-log(kD)

n為大于1的整數時，結合過程是n+1個分子反應。n不是整數時n>1,正協同作用；n<1，負協同作用協同是一種現象，指配體與受體部位結合后，可影響與另一受體部位的特性。

（二）競爭結合試驗

用于測定非標記藥物與放射配體競爭同一受體的能力。常用非標記藥物取代50％放射配體與受體結合的濃度（IC50）來表示。設競爭性抑制劑為IR+L→RLR+I→RI根據質量作用定律

KI＝

IC50的測定：固定放射配體濃度。受試藥選擇6-7個不同濃度，測定受試藥對放射配體與受體結合的抑制百分數（I%）

I%=

×100%

用半對數表，以抑制百分數（I%）為縱軸，被試藥物濃度（I）的對數為橫軸作圖。求得IC50和斜率。競爭結合實驗中競爭劑對放射配基的抑制曲線。用分對數對藥物濃度的半對數作圖求IC50

將S形曲線轉化為直線最有效的是分對數（logit）轉化法

I9180