第三章細胞生物學研討方法1

第一節細胞形狀構造的察看方法一、光學顯微鏡(lightmicroscopy)技術

二、電子顯微鏡(Electromicroscopy)技術

21.分辨率(resolusion)：區分兩個質點間的最小間隔。R=0.61λ/nsinα/2其中:n=標本和物鏡之間介質折射率;λ=入射光線波長；α=鏡口角〔樣品對物鏡鏡口的張角〕nsinα/2稱為物鏡的數值孔徑(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思索題：如何提高顯微鏡的分辨才干？樣品物鏡α342.放大倍數(magnification):最終成像的大小與原物體大小的比值。光學顯微鏡的最大放大倍數為1,000倍.電子顯微鏡的最大放大倍數為1,000,000.5一、光學顯微鏡〔一〕普通復式光學顯微鏡6〔二〕相差顯微鏡78Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.91.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現為明與暗的對比。2.兩個特殊構件：環狀光闌〔annulardiaphragm〕：位于光源與聚光器之間。相位板〔annularphaseplate〕：涂有光吸收物質和相位推遲物質。3.用途：能察看無色、透明、活細胞中的構造。1932年P．Zernike發明，1953年,諾貝爾物理獎。101.原理：利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示構造的三維立體投影。〔三〕微分干涉顯微鏡11122.運用：適于研討活細胞中較大的細胞器、顆粒及其運動。計算機輔助的DIC分辨率比普通光鏡提高了一個數量級。運用這一原理制備的錄像增差顯微鏡〔video-enhancemicroscopy〕可以察看微管上顆粒的運動。13〔四〕熒光顯微鏡141.原理：以紫外線為光源照射被檢物體，使之發生熒光，然后在顯微鏡下察看物體的形狀及其所在的位置。2.特點：光源不直接照明，而是激發能源；需特殊的濾色鏡；分辨率高。3.用途：在光鏡程度用于特異蛋白質等生物大分子的定性、定位。

既可以察看切片，也可以進展活體察看。有免疫熒光技術和熒光素直接標志技術。15Fluorescenceimageofepithelialneuroncell16Singapore’sNationalInstituteofEducationUKUniversityofFloridaFrenchSingaporeSouthKorea17〔五〕激光掃描共聚焦顯微鏡181.原理：激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描，獲得樣品不同層面的圖像〔稱為光切片〕，再經過計算機組合成三維重構的影像。2.優點：分辨才干比普通光學顯微鏡提高1.4-1.7倍。3.用途：類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構成立體圖像，在研討亞細胞構造與組分方面廣泛運用。19laserconfocalscanningmicroscope,LCSM20LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/21〔六〕倒置顯微鏡221.特點:物鏡與照明系統顛倒。2.用途:用于察看培育的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光安裝。23(七)熒光共振能量轉移技(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)檢測活體中生物大分子納米級間隔和納米級間隔變化的有力工具,檢測某一細胞中兩個蛋白分子能否存在直接的相互作用。24490nm熒光供體〔CFP〕430nm激發光受體〔YEP〕25受體〔YEP〕490nm熒光供體〔CFP〕430nm激發光530nm黃色熒光FRET26(八)熒光漂白恢復技術27暗視野顯微鏡〔darkfieldmicroscope〕聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡.背景黑,物體的邊緣亮,增大反差,提高分辨率.主要察看輪廓,適于察看活細胞內的細胞核、線粒體液體介質中的霉菌等。28〔九〕當代顯微鏡的開展趨勢采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、DIC、攝影安裝于一體。自動化與電子化。291932年德國學者MaxKnolls和ErnstRuska用波長比光短得多的電子作光源,發明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開辟了超微世界。光學顯微鏡中察看不到而只能在電子顯微鏡下察看的構造稱為亞顯微構造〔submicroscopicstructure〕或超微構造〔ultrastructure〕。二、電子顯微鏡301.根本構造:(1)電子槍：包括燈絲陰極和陽極。陰極電壓50~120KV，陽極0V，兩極電壓差為加速電壓。電子束波長與加速電壓的平方根成反比。(2)電磁透鏡：改動電子方向。(3)真空系統：堅持電鏡真空。(4)照相系統：〔一〕電子顯微鏡的根本知識31顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理光鏡200nm可見光（400-700nm）玻璃透鏡不要求真空利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化電鏡0.1nm電子束（0.01-0.9nm）電磁透鏡1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差2.電鏡與光鏡的比較顯微鏡成像的根本要素有哪些?32電鏡與光鏡光路圖比較33透射電子顯微鏡(1)透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)3.電鏡的類型3435(2)掃描電子顯微鏡〔Scanningelectronmicroscope，SEM〕36

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.3720世紀60年代問世，利用二次電子信號成像來察看樣品外表形狀。任務原理：電子束掃描樣品，在樣品外表激發出二級電子，由探測器搜集，信號經放大后在熒光屏上顯示出與電子束同步的掃描圖像。分辨率為6~10nm，有效放大倍數為0.2mm/10nm=20000X。38(3)掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelmicroscope,STM)Binning和Rohrer1981年發明，1986年獲諾貝爾物理獎根據量子力學的隧道效應原理制成，分辨身手高，可在真空、大氣、液體等多種條件下任務，非破壞性丈量。是納米生物學研討領域中的重要工具,可在原子程度上提示樣本外表的構造。39掃描隧道電鏡下的DNA雙螺旋401.超薄切片技術〔二〕電鏡制樣技術412.負染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技術(1)負染色:使整個載網都鋪上一層重金屬鹽,而凸出的樣品那么沒有染料.(2)投影技術:又叫噴鍍技術,加強背景和待察看樣品反差.423.冰凍蝕刻(freeze-etching)

冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來察看膜斷裂面的蛋白質顆粒和膜外表構造。43快速冷凍深度蝕刻技術(AYeastCell)444.電鏡三維重構技術

英國生物物理學家A.Klug提出,獲得1982年諾貝爾化學獎。

電子顯微術、電子衍射與計算機圖像處置相結合，分析難以構成三維晶體的膜蛋白、蛋白-核酸復合物等大的復合體。Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.451、離心機:低速離心機：轉速<10,000r/min高速離心機：轉速為10,000~25,000r/min超速離心機：轉速>25,000r/min。目前超速離心機的最高轉速可達100,000r/min一、細胞器與生物大分子的分別第二節細胞組分的分析方法46LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation47

〔1〕特點：介質密度均一；主要根據被分別物質的體積差別；速度由低向高，逐級離心。〔2〕用途：初步分別大小相差懸殊的細胞和細胞器，常需進一步經過密度梯度離心再行分別純化。2、差速離心〔Differentialcentrifugation〕483、密度梯度離心〔densitygradientcentrifugation)介質在離心管內構成一延續或不延續的密度梯度，待分別的各組分分別停留在介質的密度不同的層面。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。類型：速度沉降密度沉降49Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.501.Feulgen反響顯示DNA2.PAS反響顯示多糖3.四氧化鋨顯示脂肪4.米倫反響顯示蛋白質二、細胞組分的顯示511、免疫熒光(immunofluorescence)技術將免疫學方法與熒光標志技術結合起來研討特異蛋白在細胞內的分布。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。有直接免疫熒光和間接免疫熒光。三、特異蛋白質的定位與定性52

Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.53Indirectimmunocytochemistry542、免疫電鏡〔immunoelectronmicroscope〕技術將樣品進展特殊標志加強反差，從而進展亞細胞構造和分子的定位。根據標志方法不同分為：免疫鐵蛋白技術、免疫酶標技術和免疫膠體金技術。55Immunogoldelectronmicroscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspheres.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes.56原位雜交〔insituhybridization〕用標志的核酸探針經過分子雜交確定特殊核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置。(1)光鏡原位雜交：放射性同位素或熒光素標志。(2)電鏡原位雜交：生物素等小分子標志，膠體金顯示。四、特異核酸序列的定位與定性57放射自顯影〔autoradiography〕是利用放射性同位素所發射出來的帶電粒子(α或β粒子)作用于感光資料的鹵化銀晶體,從而產生潛影。這種潛影可用顯影液顯示,成為可見的“像〞。用于測定細胞內被放射性標志的物質。五、放射標志研討生物大分子的合成動態58放射自顯影術591、顯微分光光度術將顯微鏡技術與分光光度計結合起來，以物質的光吸收、熒光發射和光反射特性作為測定根底，用來分析生物樣品細微構造中的化學成分，同時進展定位、定性和定量。2、流式細胞儀〔flowcytometry〕即可以對單個細胞或其他生物微粒進展定量分析，還可以對細胞或染色體進展分選。六、定量分析60Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.Whenacellpassesthroughthelaserbeam,itismonitoredforfluorescence.Dropletscontainingsinglecellsaregivenanegativeorpositivecharge,dependingonwhetherthecellisfluorescentornot.Thedropletsarethendeflectedbyanelectricfieldintocollectiontubesaccordingtotheircharge.Notethatthecellconcentrationmustbeadjustedsothatmostdropletscontainnocellsandflowtoawastecontainertogetherwithanycellclumps.Thesameapparatuscanalsobeusedtoseparatefluorescentlylabeledchromosomesfromoneanother,providingvaluablestartingmaterialfortheisolationandmappingofgenes.61細胞工程技術是細胞生物學與遺傳學的交叉領域，主要是利用細胞生物學的原理和方法，結合工程學的技術手段，按照人們預先設計，有方案地改動或發明細胞遺傳性的技術。主要內容包括：細胞交融、細胞生物反響器、染色體轉移、基因轉移、細胞及組織培育等。目的是獲得細胞產品或利用細胞本身。第三節細胞工程技術62一、細胞培育指在體外模擬體內的生理環境，培育從機體中取出的細胞，使之生存和生長的技術。1.體外細胞培育的條件(1)營養：培育基提供。(2)生存環境：無菌、適宜的溫度、一定的浸透壓、和氣體。(3)廢物的排除：定期改換培育基。632.動物細胞培育(1)原代培育〔primaryculture〕：即培育直接來自動物機體的細胞群。通常指１～１０代以內的培育。(2)傳代培育：將細胞從一個培育瓶轉移到另外一個培育瓶稱為傳代或傳代培育。(3)貼壁培育：培育細胞貼壁生長，呈多態性，單層生長，堅持接觸抑制〔contactinhibition〕，也叫單層細胞培育。(4)懸浮培育：細胞在培育過程中不斷懸浮在培育液中，不貼壁。64(5)細胞系〔cellline〕：可以傳代40-50次并且仍堅持原來染色體的二倍體數量及接觸抑制行為的傳代細胞。(6)細胞克?。河脝渭毎寺∨嘤蛩幬锾暨x的方法從某一細胞系中分別出單個細胞，并由此增殖構成的具有一樣遺傳外形的細胞群體。(7)細胞株〔cellstrain〕：經過生物學鑒定具有特殊遺傳標志或性質的細胞克隆。65實驗室中常用的幾種延續細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacksBHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin195166Hela細胞CHO細胞673.植物細胞培育(1)外植體培育：利用葉片、莖、根等誘導產生愈傷組織