微生物在納米生物合成中的應用

納米生物合成技術是指由生物活性分子在細胞內或細胞外自生物活性分子中或細胞外自生物活性分子組成的新型納米技術。近年來，它是納米技術、生物技術和科學研究的接口，并發展起來。與傳統的物理和化學納米合成技術相比,納米生物合成技術清潔、無毒、環境友好和可持續發展,反應條件溫和可控,不需添加任何還原劑,效率高等優點成為納米合成領域研究熱點。由于富含蛋白質、脂類、多聚糖等生物物質,賦予納米材料獨特的生物學特性,使其在生物醫學領域及材料學領域具有廣泛應用前景。微生物在自然界分布廣,易分離培養,生長繁殖快,結構簡單易于操作,已廣泛用于納米材料生物合成研究,并取得了較大的研究進展。本文對細菌、放線菌、酵母菌以及真菌等微生物合成納米材料的生物方法、合成機制、納米材料形貌和尺寸微生物調控合成方法以及生物納米材料應用進行了評述,旨在為我國該領域的研究提供參考。1納米生物合成技術微生物代謝類型多,具有極強的生命力和適應性,在自然界分布廣,最早被應用于納米生物合成技術的生物類群。納米材料微生物合成研究最早可追溯到1989年,Nature雜志首先報道了光滑念珠菌(Candidaglabrata)合成細胞內CdSe納米材料的生物合成方法。1993年,Science雜志報道了磁細菌細胞內礦化合成磁納米顆粒(Fe3O4)研究。2001年,NanoLett雜志發表文章報道了尖孢鐮刀霉(Fusariumoxysporum)合成細胞內Ag納米顆粒的生物合成方法,并首次提出納米生物合成技術概念。隨后,美國化學會以及歐洲權威學術雜志也紛紛發表文章報道納米材料生物合成技術。納米生物合成技術由此引起納米合成研究者極大興趣,成為納米技術研究熱點。近年來,國內也有多個研究小組開展相關工作,并取得了一些可喜成績。目前,細菌(Bacteria)、酵母菌(Yeast)、真菌(Fungi)等多種微生物應用于納米材料合成研究;包括球形、三角形、菱形、立方體以及納米線等多種形貌的Au、Ag、磁等金屬納米材料,Silica等半導體無機納米材料,CdSe、CdS等量子點納米材料,以及Au-Ag、BaTiO3等合金納米材料可被微生物合成;粒徑多分布在1-200nm;具有單晶或多晶典型的納米晶體結構。表1總結了近年來用于納米生物合成技術的微生物及其合成的納米材。2納米材料基因合成方法根據微生物合成特點及納米材料性質,已報道的微生物合成納米材料方法主要分為三類。根據合成的納米材料屬性可分為金屬納米材料、半導體納米材料及雙金屬復合納米材料微生物合成方法;根據合成方式分為細胞內或者細胞外微生物合成方法;根據細胞活性分為活細胞生物合成與死細胞或者細胞溶解物的合成方法。目前,各類微生物合成納米材料的應用水平不盡相同,細菌和真菌研究較為深入。2.1-20nm細胞內au納米顆粒生物合成細菌生物合成納米材料反應條件溫和,產量高,納米材料易純化,被稱為“納米材料加工廠”。比較而言,利用活細菌合成包括金屬與非金屬納米材料的生物方法研究較多。當活細菌與溶液金屬或非金屬離子共孵育,菌體吸收或吸附溶液金屬或非金屬離子,利用生物活性分子細胞內或細胞外自組裝具有典型的單晶或者多晶結構特征的納米材料。已報道細菌合成的納米材料包括Au、Ag、Pa、磁、ZnS、CdS等。B.subtilis168菌株與氯金酸溶液共孵育后,細胞可合成5-25nm八面體Au顆粒,TEM表征發現納米顆粒分布于細胞周質空間或包埋在細胞壁,與菌體形成Au-細菌復合體。厭氧條件下,S.algae與氯金酸溶液共孵育可合成細胞內納米Au顆粒。室溫條件下,Lactobacillussp.與氯金酸溶液孵育可合成20-50nm細胞內Au納米顆粒,呈簇分布,形貌多樣,產量達35%細胞干重,這為大規模生產提供了很好基礎。當200℃加熱Au納米顆粒時,顆粒可被分解為Au原子,表明了生物活性物質參與Au+還原與納米顆粒的組裝。不添加任何穩定劑或者表面吸附劑等輔助分子條件下,R.capsulate(已更名為R.capsulatus)及菌體溶解物與Au+共孵育均可合成Au納米顆粒。當改變氯金酸與細胞溶解物濃度比,還可選擇性自組裝成Au納米線,這也是首次報道Au納米線生物組裝方法。趨磁細菌M.gryphisnaldense最早被發現可細胞內合成和組裝磁性納米顆粒(BMPS,又稱磁小體),趨磁細菌可選擇性吸收溶液中Fe3+,轉入細胞后被還原,與細胞內磁小體被膜組裝成5-120nm的磁小體,主要成分為Fe3O4和Fe3S4,基本不含其他雜質;磁小體呈順磁性,鏈狀(單鏈或多鏈)排列;正方形、長方形、菱形、六邊形和子彈頭形多種形態(圖1)。銀耐受菌首先用于Ag納米顆粒生物合成。例如,石油脫硫菌P.stutzeriAG259與Ag+溶液孵育后,細胞內合成35-46nmAg納米顆粒,顆粒為球形、三角形和六角形等多種形貌;EDX分析表明納米顆粒為純Ag組成。SilverS等報道銀耐受菌與Ag+溶液共孵育后,細胞內還原與組裝的Ag納米顆粒產量可達25%細胞干重,為生物來源的銀納米材料大量合成提供很好方法。最令人振奮的納米生物合成技術之一是實現發光量子點(Quantumdots,QDs)的生物合成。量子點是一種具有獨特發光性質無機半導體納米晶體,其發光特性與有機熒光染料和熒光蛋白相比,具有激發光譜寬、發射光譜窄且、熒光量子產率高、光穩定性好等優點,已被廣泛應用于生物醫學成像和樣品檢測。通常只能采用化學方法合成,合成條件苛刻,產量低,而且具有環境毒性。與其他微生物比較,細菌用于量子點合成種類最多。如,C.thermoaceticm與CdCl2共培養可在其細胞壁合成CdS量子點納米材料。K.aerogenes合成20-200nm的CdS納米材料。E.coil合成細胞內CdS量子點納米材料,其合成產量受細胞周期影響。硫還原菌合成細胞外2-5nm單分散性ZnS量子點納米顆粒。2.2au納米顆粒的合成與細菌相比,放線菌(Actinomycete)應用于納米生物合成研究比較晚,目前僅Rhodococcussp.及Thermomonosporasp.用于納米材料生物合成。Rhodococcussp.菌絲與氯金酸溶液孵育后,在細胞內合成5-15nm球形的Au納米顆粒,TEM表征發現顆粒分布于細胞膜。Thermomonosporasp.與氯金酸溶液孵育后,在細胞外組裝7-12nmAu納米顆粒;FTIR分析以及生化分析表明Au顆粒存在至少4種蛋白酶,分子量為80-10kDa。2.3形成新材料的生物合成粒徑酵母菌用于納米材料的生物合成研究比較早,可能受1989年DameronCT利用酵母菌細胞合成量子點研究影響,迄今為止,酵母菌主要用于量子點納米材料生物合成。隨著研究逐漸深入,表明了以活酵母細胞作為生物反應器合成出尺寸可控、閃閃發光的量子點,為生物合成量子點提供很好材料。一般方法,將酵母菌與一定濃度Pb2+、Cd2+、Cd2+、Zn2+等離子溶液共孵育,菌體吸收或吸附溶液中離子后,生物還原與組裝具有特定光譜性質的量子點納米晶體顆粒。包括光滑念珠菌在內,已有多種酵母菌合成量子點納米材料的生物方法報道。例如,Torulopsissp.合成2-5nm細胞內PbS納米晶,330nm存在紫外特征吸收峰。S.cerevisae生物合成粒徑8-35nm細胞內TiO2納米顆粒。室溫條件下,S.pombe合成1-1.5nm細胞內CdS。最新報道,利用活的酵母菌細胞作為生物發生器,生物合成了發出紅、黃、綠不同熒光的量子點CdSe,等等。2.4ag-q-ms/au-ag復合納米顆粒真菌用于合成納米材料是近年來發展的生物合成方法。已生物合成Au、Ag、磁、Titanium等金屬納米材料、Silica等半導體納米材料以及CdS、CdSe量子點納米材料。更有科學意義是利用真菌生物合成包括Au-Ag、BaTiO3復合納米材料。不僅實現了生物合成方法的重大突破,同時拓展了生物合成納米材料種類。目前,報道用于生物合成的真菌有F.oxysporum、Verticilliumsp.、A.oryzaevar.viridis、Penicilliumsp.以及P.brevicompactumWA2315、Volvariellavolvacea等。F.oxysporum為真菌合成納米材料模式菌株,已合成多種金屬、半導體以及復合納米材料。通常,將F.oxysporum與金屬、非金屬離子溶液共孵育后,菌體可細胞內及細胞外合成金屬、半導體及量子點納米材料。溶液同時存在AuCl4+及Ag+時,F.oxysporum分泌以NADH為輔酶的蛋白酶還原AuCl4+及Ag+,并細胞外組裝Au-Ag復合納米顆粒,X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)分析表明Au-Ag復合納米顆粒同時含有Au及Ag元素。此外,黃曲霉(A.oryzaevar.viridis)及其菌絲溶解物用于Ag納米材料的生物合成,生物學效應研究還表明,生物Ag納米材料顆粒同樣對S.aureusKCCM12256有較強的抑菌作用。P.brevicompactumWA2315與Ag+共孵育可合成粒徑為58±17nm細胞外Ag納米顆粒,在420nm有特征吸收峰。V.volvacea菌絲溶解物可生物合成Au、Ag納米顆粒以及Au-Ag雙金屬復合納米顆粒。3磁小體膜囊及磁藥物的作用目前,雖有多種微生物合成金屬、非金屬以及量子點和雙金屬復合納米材料的方法報道,但微生物活細胞及其細胞溶解物如何實現金屬、非金屬、量子點以及雙金屬復合納米材料的自主裝的機制尚不完全清楚。普遍觀點認為微生物或細胞溶解物與金屬以及非金屬離子共孵育后,生物活性物質包括蛋白質、還原糖、還原性谷胱甘肽等生物活性分子對金屬以及非金屬離子進行富集、還原并組裝成具有典型納米晶體結構的納米材料,生物分子對納米晶體穩定起著重要作用。而已有的研究表明,微生物合成納米材料是一種非常復雜的生物化學過程,特別是活細胞的生物合成過程,不同的納米材料生物合成機制各異。例如,Magnetospirillumsp.AMB-1菌株細胞內組裝磁小體機理研究表明,磁小體形貌、顆粒尺寸、細胞內排列方式等均受菌體基因表達調控。趨磁細菌與Fe3+孵育后,細胞受刺激首先合成磁小體膜囊(Magnetosomemembrane,MM),被吸收的Fe3+在細胞內被還原為Fe2+,然后轉運入磁小體膜囊;Fe2+在此被氧化為Fe3+離子,形成水合Fe3+(Ferrihydrite),MM對磁小體形成與裝配起著關鍵作用。電子斷層掃描術(Cryo-electrontomography,cryo-ET)研究表明,MM含有大量來源于細胞膜的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油等氨基化脂肪酸物質。同時,蛋白二維電泳、氨基酸Edman及串聯式質譜等分析表明MM存在18種主要蛋白,占菌體總蛋白的0.1%,MMPs對離子轉運、晶體成核和生長等非常重要。例如,分子量分布在15-19kDa的manC、mamF、mms16蛋白在MM中含量高,且穩定,與MM松弛結合,主要穩定MM。而manB和manM蛋白對陽離子的運輸有重要調控作用。mamE和mamO蛋白主要作用為促進磁小體的形成和成熟。此外,大腸桿菌細胞內合成CdS納米晶體機制研究表明,細胞還原性巰基化合物(Reducedthiols)及谷胱甘肽(Glutathione)對CdS納米晶體合成具有重要作用,對數期及穩定期細胞還原性巰基化合物及谷胱甘肽含量高于衰亡期細胞,因而檢測表明對數期細胞合成的CdS產量為衰亡期產量20倍。光滑念珠菌(C.glabrata)合成CdS納米材料機制研究表明,當細胞與Cd2+溶液共孵育后,細胞首先合成螯合素酶(PCs,(γ-Glu-Cys)n)生物活性物質,PC與Cd2+結合,形成Cd-PC復合物被運送到細胞內形成的囊泡,在此Cd-PC復合物被降解,CdS晶體在囊泡中形成。F.oxysporum細胞外合成納米材料機制研究表明,菌體主要分泌了4種依賴ATP和NADH胞外酶,分子量為80-10kDa。蛋白酶對納米材料成核、大小和形貌起著重要作用。為探討真菌合成納米材料的機理,我們選用了Penicilliumsp.、Aureobasidiumpullulan及Fusariumsp.為生物材料,并以F.oxysporum為對照,研究了其細胞內Au納米材料生物合成機制。發現Penicilliumsp.及A.pullulan主要利用細胞還原糖為活性物質合成Au納米顆粒;Fusariumsp.與F.oxysporum為同屬真菌,均利用細胞蛋白質為活性組分組裝Au納米顆粒,與報道相符。可見,微生物合成納米材料機制的多樣性和復雜性。4合成au納米顆粒尺寸的調控眾所周知,納米材料尺寸和形貌對其光譜特性、生物學效應等多種性質有重要影響,如何實現納米材料生物調控合成也成為納米生物合成技術領域前沿研究課題。納米材料生物合成在生物體系中發生,具有生物系統性特點,特別是活細胞生物合成反應,因而其調控方式不同于物理化學方法。研究結果表明,溫度、離子強度、溶液pH等對微生物生長有重要影響的因素對微生物合成納米材料尺寸有調控作用。例如,我們利用溫度調控Penicilliumsp.合成細胞內Au納米顆粒研究表明,溫度可實現對Au納米顆粒尺寸調控(圖2)。當Penicilliumsp.在處于4℃合成條件,菌體合成了4-10nm單分散性球形Au納米顆粒;處于28℃合成溫度,菌體可合成20-37nm的單分散性球形Au納米顆粒;而在20-30℃波動的合成溫度條件下,菌體合成了粒徑分布為16-110nm多分散性的Au納米顆粒;機理研究表明,溫度主要影響細胞對AuCl4+吸收速度,從而調控AuCl4+在細胞內還原和Au成核,進而可控Au納米顆粒尺寸。此外,pH值調控S.algae合成Au納米顆粒研究表明,溶液pH值對顆粒粒徑有調控作用。當溶液pH值為7時,菌體可合成10-20nm細胞內Au顆粒;溶液pH降低至1時,則形成50-500nm細胞外Au顆粒。Ag+濃度對P.stutzeriAG259合成Ag納米顆粒尺寸有重要影響,低濃度的Ag+濃度,菌體可積累35-46nmAg納米顆粒,菌體與高濃度Ag+環境孵育,可合成200nm左右或更大的Ag顆粒。5在生物檢測方面的應用生物合成納米材料富含蛋白質、脂類、多聚糖等生物物質使其在生物醫學領域及材料學領域具有廣泛應用前景。目前,僅磁小體的應用研究相對比較成熟。人們首先發現磁小體對磁場非常敏感,可在磁細菌細胞內排列成磁陣列的特