乙酰膽堿酯酶陽性神經元在鼠腦中的分布和形態特征

腦內膽堿能機制的研究是目前神經生物學領域的一個相對活躍的課題。由于缺乏理想的顯示方法,對中樞膽堿能結構的形態學,遠不如單胺類了解清楚。現有資料大多來自乙酰膽堿酯酶(AChE)的組織化學方法研究。AChE在中樞的分布比較廣泛,具有ACh上的神經元,并非都是膽堿能的,它們中的一些,既非膽堿能細胞,可能也不是膽堿敏感細胞。這樣,AChE作為膽堿能神經元的標志物,其特異性也就受到了懷疑。為了探討AChE和膽堿能神經元的關系,了解膽堿能神經元的分布,本文應用AChE再生技術,研究AChE陽性神經元在鼠腦的分布和形態特征。采用dfp注射降低k-b.me大白鼠30只,體重200～250g,肌肉注射氟磷酸二異丙脂(di-isopropylfluoropnosphateDFP)1.2mg/kg體重。注射后分別存活3、6和10h,戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,以生理鹽水30ml(4℃)經心臟灌注,然后灌注10%的中性福爾馬林,后固定2h。再將腦塊移入20%蔗糖磷酸緩沖液中過夜。冰凍切片40μm,取切片兩套(一套為對照Ⅱ),切片入孵化液孵化2h(40℃)。孵化液組成為乙酰膽堿碘化物(底物)112mg、蒸餾水25ml、80mmol/L甘氨酸液12.5ml、16mmol/L硫酸銅液12.5ml、0.1mol/L醋酸緩沖液50ml、鹽酸異丙嗪12.5mg(抑制假性膽堿脂酶ChE)。10%鐵氰化鉀顯色10min,充分水洗后,裱片、晾干、常規封片。對照Ⅰ:1例動物未經DFP注射;對照Ⅱ:孵化液中免去底物。dfp處理細胞在鼠腦內的表達AChE反應產物為棕紅色亞鐵氰化銅沉淀。對照Ⅰ:由于染色的神經纖維、終末、膠質和神經細胞混淆在一起,使背景著色深,細胞形態無法辨認(圖1)。對照Ⅱ:因孵化液中無底物,切片不顯色。DFP處理標本,因腦內原有的AChE全部受到抑制,而細胞體本身能夠合成新的AChE,短期內新合成的AChE不及運輸到遠端突起和軸突終末,結果背景不著色,胞體染色明顯,近端突起清晰。本文將DFP處理后3h出現的染色細胞定為強染色,6h為中度染色,10h為輕度染色。它們在鼠腦的分布見圖2。本研究著重觀察AChE強染色細胞。一、ache形態結構(一)紋狀體:尾、殼核內可見大、中、小三類染色細胞,大細胞染色深,梭形或長多極形,一般有2～4個突起,中、小細胞淡染或中度染色。偶爾可見巨大的圓形或長多極形細胞(圖3)。同類細胞也見于床核和嗅結節,其排列較在尾、殼核密集。蒼白球見有大、小兩種分別為強和中度染色細胞,主要位于蒼白球的腹內側段,沿內囊排列和腳內核延續(圖4,5)。(二)基底大細胞核(NBM):該結構包括內側隔核(SM)、斜帶核(DBB)、視前大細胞核(MPO)、未定帶(ZI)等。這些核的神經元形態相似,且都呈高AChE活性,胞體較大、偏長,具3～4個突起,分支少,呈等樹突形式,軸突和樹突不能分辨(圖6,7)。在冠狀切面上,這種細胞沿Broca氏斜束,在基底前腦形成一個連續的細胞帶(圖2)。(三)皮質和海馬:整個皮質有少數AChE中度染色細胞散在,主要位于皮質的深層。海馬內見有輕度染色細胞位于多形層。二、周區細胞中ache染色(一)間腦:丘腦的AChE陽性神經元主要位于非特異丘腦核團,前腹核、前背核腹側部細胞染色稍深,丘腦網狀核、中線核和板內核細胞呈中度染色。外側膝狀體的腹側核、韁外側核有少量中度染色細胞。下丘腦的視上核、室旁核、視交叉上核細胞呈AChE強染色,胞體卵圓形,排列密集,突起染色不明顯(圖8,9)。乳頭上核、穹窿周區的細胞也呈強AChE染色。此外,下丘腦外側區中散有大的類似NBM細胞的強染色神經元。(二)腦干:所有腦神經運動核神經元都呈強AChE染色,它們包括橫紋肌運動核和副交感節前神經元。前者是強染色的大多極細胞,有3～5個突起(圖10,11),后者染色略淡,胞體偏小,卵圓或梭形,排列密集(圖12,13)。除前庭神經上核和三叉神經中腦核輕度著色外,大多數感覺核都不著色。腦干其他核團呈AChE強染色的有黑質致密部、紅核大細胞、藍斑和亞藍斑核細胞。藍斑細胞的染色和下丘腦的視上核、室旁核細胞有些類似(圖14)。腳間核的外側部、上橄欖核、橋核細胞呈中度染色。(三)腦干網狀結構(RF):中縫核群的大細胞多呈AChE中度染色,小細胞輕度著色。RF的內側區中,散在許多深染色或中度染色的大細胞(圖15,16)。RF中最大的AChE強染色細胞簇,是從中腦的腹側被蓋區一直延伸到腦橋嘴側被蓋區域(圖2)。它們由一些多極形細胞松散排列而成,在第四腦室腹側及結合臂周圍,相應分為橋被蓋核、腳橋被蓋核和臂旁核。它們形態上類似于NBM細胞。討論一、chat和ache的生物化學研究AChE是ACh的水解酶,作為膽堿能神經元的標志物,多年來對它進行了大量的研究。雖然AChE在中樞的分布比較廣泛,它不僅存在于膽堿能細胞,也存在于非膽堿能細胞.但是,完整的膽堿能功能體系應該包括ACh及其合成分解酶類,即ChAT和AChE。生物化學測定發現,腦內大部分區域這三者間有著較好的一致性。實驗證明損毀膽堿能纖維后,在胞體和近端突起有AChE堆積,末梢部分AChE消失,說明AChE和ChAT一樣,是膽堿能神經元的一個組成部分。將本實驗的觀察結果和ChAT的免疫組織化學資料進行比較(附表),結果凡是ChAT免疫組織化學研究較恒定的,認為是膽堿能神經元,均呈現強的AChE染色。反之,除黑質、藍斑、腹側被蓋區和下丘腦神經分泌細胞外,所有AChE強染色細胞都顯示了強的ChAT染色。而多數AChE中度染色細胞,被Kimura鑒定為膽堿敏感細胞。據此,我們認為AChE仍然不失為一個有效的膽堿能神經元標志物,進一步支持“高濃度的AChE是判斷膽堿能神經元的必要條件”的經驗準則。二、是否膽堿能中間神經元/細胞間腦的ache分布(一)前腦:在前腦基底部,AChE強染色細胞分布于SM、DBB、MPO等結構,形成一個連續的細胞帶,它們的形態和染色程度基本一致,統稱為基底大細胞核,相當于靈長類的Meynert細胞,有些資料報道,它們是皮質和海馬膽堿能支配的主要起源。皮質本身是否存在膽堿能細胞,還有較大爭議。離子透入ACh,皮質出現抑制和興奮雙重生理效應,說明皮質內有膽堿敏感細胞。這和本研究所見皮質內存在AChE中度染色細胞相一致。新紋狀體內的大細胞屬AChE強染色,一般認為它們是傳出神經元,但近年來又認為AChE強染色細胞是新紋狀體的膽堿能中間神經元。(二)間腦:丘腦的AChE陽性細胞都是中度染色,主要位于非特異丘腦核團,與Parent等的報道基本一致。AChE中度染色,說明它們可能是膽堿敏感細胞,但也不能排除它們是膽堿能的可能性。因為有的報道指出,丘腦板內核損害后,尾核頭部ChAT和ACh明顯減少。下丘腦的視上核、室旁核細胞含高濃度的AChE,其意義尚不清楚,可能和神經分泌有關。(三)腦干:腦神經運動核為已知的膽堿能神經元,在本實驗中,它們顯示強的AChE染色。藍斑、黑質致密