大鼠下丘腦視上核內一氧化氮合酶和雌激素受體的分布

雌花是近年來研究較多的神經類固醇激素。它的合成和釋放受到基底和垂體-腺體軸的控制。雌激素受體(ER)在下丘腦分布較廣,主要分布于視上核、室旁核、視前區和腹內側核等核團,雌激素通過與其受體結合,參與和介導了下丘腦內的諸多功能。如對下丘腦-垂體-性腺軸的調控以及下丘腦內神經肽的表達和調控。雌激素與神經營養因子一樣,在促進神經元的分化、存活、保護神經元、維持神經元正常功能等方面起重要作用。一氧化氮(NO)是腦內的重要信使,由一氧化氮合酶(NOS)合成,是一種氣體信息遞質。NOS陽性神經元的胞體和突起廣泛分布于整個下丘腦,集中分布于視上核、室旁核、下丘腦外側區和弓狀核等區域。NO和雌激素一樣都介導和參與了下丘腦的許多重要功能。如NO介導和調控催產素(OT)和加壓素(VP)、促性腺激素釋放激素(GnRh)的釋放,及其他神經遞質的釋放,并參與突觸可塑性的形成。由于NOS與ER在分布上有共性區域,二者在視上核、室旁核均有表達,另一方面從功能上來看二者也有一定聯系,因此我們設計采用NADPH-d組織化學法和免疫組織化學技術相結合的方法對下丘腦視上核內NOS和ER共存進行形態學的觀察和研究,以期為進一步探討NO與雌激素之間的內在聯系提供形態學的依據。1材料和方法1.1飼養動物中心采用SD雌性大鼠30只(山西醫科大學實驗動物中心提供),體重220-260g,將動物置于溫暖,安靜,避強光環境下飼養,使之適應周圍環境保持基礎狀態。1.2試劑和試劑盒雌激素受體(ER)購自武漢博士德生物工程有限公司,硝基四氮唑藍(NBT)購自上海生工生物工程技術服務有限公司,還原型輔酶Ⅱ-黃遞酶(NADPH-d)購自華美生物工程公司,SABC試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。1.3灌注pbs液大鼠麻醉后,經左心室升主動脈依次灌入生理鹽水、4%的多聚甲醛磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)、10%的蔗糖PBS液,灌注后取腦,入4%的多聚甲醛液后固定3h,然后入20%的蔗糖PBS液(4℃)冰箱過夜。待腦組織浸泡沉底后取出,截取下丘腦部分腦組織,做冠狀面連續冰凍切片,隔3取1,片厚約40μm。1.4染色將切片分成3套,一套行NADPH-d組織化學染色,一套行ER免疫組化染色,另一套行NADPH-d/ER雙重染色。1.4.1羊抗兔igg片圖1將經山羊血清孵育過的切片放入濃縮型兔抗ER血清(1∶100PBS稀釋)中37℃恒溫箱孵育3h,后置4℃冰箱過夜,入生物素標記的羊抗兔IgG液(即用型)中,37℃恒溫箱孵育0.5h,入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素37℃恒溫箱孵育0.5h,PBS液漂洗3次,DAB顯色后裱片制片。1.4.2-ndh-d-nadph-d將切片在0.01mol/L的PBS液漂洗3次后,入孵育液37℃恒溫箱孵育1.5h,孵育液組成包括:0.3%Tritonx-100,1mg/mlβ-NADPH-d,0.5mg/mlNBT的PBS緩沖液,用PBS緩沖液(pH7.4)終止反應后,裱片制片。1.4.3正常羊血清學組pbs在NADPH-d染色的基礎上再行ER免疫組化染色,用0.01mol/L的PBS液(pH7.4),漂洗3次,入正常山羊血清37℃孵育1h;以后步驟同ER免疫組化染色程序。1.5比較試驗另取一只鼠腦冠狀連續切片分4組分別作以下反應。1.5.1抗感染試驗①空白試驗:分別省去兩套染色中的NADPH-d、兔抗ER血清,分別孵育切片。②置換試驗:用正常兔血清代替兔抗ER血清。1.5.2dab/雙氧水呈色在行NADPH-d組織化學染色后,切片經PBS液漂洗,直接進行ER免疫組化染色中的DAB/雙氧水呈色步驟,證實是否有殘余的NADPH-d、NBT與DAB反應而導致反應產物混雜。1.6mpusbl2顯微檢測先于明視野顯微鏡下對各切片逐一觀察,后用OlympusC-5050ZOOM數碼相機在OlympusBH2顯微鏡下攝片。每只動物選片5張,每張切片測4個視野,在捷達801形態圖像分析系統下進行圖像分析,分別計數下丘腦視上核內NOS陽性神經元數目,ER陽性神經元數目及NOS/ER雙染神經元數目和測量其各自神經元截面直徑,并計算出雙染神經元數占所有神經元的百分比。2結果2.1nos陽性神經元NOS陽性神經元在視上核內分布廣泛,呈內側稍寬的帶狀分布于視交叉的外上部,大部分集中分布在視上核的背內側部和背外側部。視上核NOS陽性神經元密集成團簇狀,NOS陽性神經元呈藍色或藍黑色,細胞核不著色,胞質著色,胞體上發出的突起清晰可見,胞體和樹突的極性與核團長軸平行。NOS陽性神經元以梭形或橢圓形細胞多見,胞體較大,胞質著色較深,胞核透亮,可見到突起交織成叢和“串珠”樣外觀。細胞以大細胞為主,偶見小細胞型,直徑多在15-20μm(圖1,2,見封3)。2.2外側部er陽性神經元/類型分布ER陽性神經元在視上核的表達不及NOS陽性神經元廣泛,集中分布于視上核的外側部,視上核的ER陽性神經元呈棕黃色,胞核著色較深,胞質著色不明顯。ER陽性神經元多呈卵圓形,突起不明顯,偶可見較短突起。少數細胞著色較深,絕大多數著色較淺,但細胞輪廓清晰,分布較密集(圖3,見封3)。2.3nos及er雙染陽性神經元形態觀察下丘腦區NOS及ER雙染陽性神經元分布廣泛,多見于視上核、室旁核、下丘腦外側區等部,其中視上核NOS及ER雙染陽性神經元表達最強,分布最廣。在視上核,低倍鏡下可見藍染的NOS陽性神經元和散在其中的淡染的呈棕黃色的ER陽性神經元以及大量的雙染陽性神經元。NOS和ER雙染神經元胞質呈藍色,胞核呈棕黃色。高倍鏡下,NOS神經元著色深,呈藍或藍黑色,密集成簇,胞體上發出的突起清晰可見。少數細胞突起較長,直徑較粗,多伸向視交叉腹側,與遠端的雙染神經元突起交織在一起,可見明顯的“串珠”樣外觀。ER神經元著色淡,多散在分布,胞體多呈梭形或橢圓形,可見到有突起發出,但數目不多,偶可見到突起相互交織。雙染神經元胞核呈棕黃色,有的透亮,胞質藍染,細胞多呈梭形或橢圓形,突起明顯,呈“串珠”樣外觀。在少數雙染的陽性神經元中,還可見到胞核內深染的核仁。視上核雙染神經元胞體較大,直徑達20μm左右,多為大細胞型神經元。NOS及ER雙染陽性神經元多位于視上核的背外側和背內側部。在視上核內雙染神經元占70%-80%(圖4,見封3)。對照試驗分別省去NADPH-d和兔抗ER血清,不出現相應的染色陽性結果。用正常的兔血清代替兔抗ER血清,也不出現陽性免疫反應,表明本實驗無抗體交叉反應存在。呈色混合試驗陰性,表明兩套反應程序之間互相不干擾,具有一定的特異性。3討論3.1no、no的誘導國內外資料顯示,雌激素在中樞和外周神經系統有一個廣泛的生理學效應,如調節神經內分泌活動,機體自律活動調節,神經保護效應及提高認識活動等,這些效應都是通過NO介導和影響的。婦女絕經后冠心病用E2治療后,NOSⅢ在血管內皮表達增高,在腦內許多區域可見NOS表達增多,在海馬神經元中,NO介導了E2誘導神經突觸的產生。在去勢的大鼠體內已經證實了E2對因生理壓力應激引起的血壓增高有削弱作用,這個影響是由腦內的NO介導的。所有這些資料表明,NO在雌激素對神經組織的作用上是一個很重要的介質。研究進一步發現,在人的SK-N-SH細胞體外培養中證實E2能誘導NO產生,并且E2是通過活化cNOS(即nNOS和eNOS特定組成合酶)而產生NO的,這個過程受細胞內外Ca2+調控。上述實驗為NO介導雌激素作用提供了強有力的證據。即NO是雌激素作用ER后,產生的第二信使,介導和完成了雌激素的作用。本實驗中發現在下丘腦視上核可見NOS與ER雙染神經元,使得NO介導雌激素受體的作用在形態學上得到了證明。3.2er和vp神經元的調控本實驗發現視上核和室旁核均有NOS與ER雙染的神經元,且表達較強。視上核的雙染神經元多分布在背內側和背外側部。視上核的神經元可分為大細胞和小細胞兩種分泌神經元。視上核主要以大細胞分泌神經元為主,主要分泌催產素(OT)和加壓素(VP)。國外研究表明NOS與VP和OT神經元分布有共存。在成年大鼠下丘腦神經垂體系統中NOS可與加壓素及催產素共存,NO能調節VP和OT的釋放,NO是由視上核和室旁核大細胞型神經分泌細胞的功能活躍增加而產生的。在等滲、有效循環血量正常時,NO抑制OT和VP的分泌;當失血、脫水、血容量減少時,NO對VP神經元抑制作用減弱,而對OT神經元的抑制卻加強了。其作用機制是優先釋放VP,對抗或更正身體水分的失衡。在去勢大鼠,45%-98%的OT與88%-99%的VP神經元含有ERβ(雌激素β受體),ERβ和VP神經元共存于視上核背外側部,在室旁核ERβ和VP共存于大細胞后外側區。ERβ與OT神經元雖也有雙標,但在室旁核(PVN)和視上核(SON)都較少,主要是在PVN內。在高滲狀態下ERβmRNA表達下降,同時ERβ也下降,證明ERβ對滲透壓改變呈負相關。可以看出,NO和ER對OT和VP的分泌都起到了調控的作用,二者對VP的調節都呈負向的調節。ER在受高滲刺激時,它表達減弱,而NO在等滲狀態時抑制VP和OT釋放。有報道表明,睪酮、雙氫睪酮、皮質醇同樣可以抑制因滲透壓改變引起的VP釋放,類固醇激素對因滲透壓改變引起的VP釋放的抑制作用很可能是通過興奮性氨基酸(谷氨酸)來介導完成的。NOS與谷氨酸受體在下丘腦神經垂體軸及室周器分布廣泛,γ-氨基丁酸對大細胞型神經分泌細胞的神經支配在此處也較廣。其機制為谷氨酸通過與N-methyl-D-aspartate(NMDA)型谷氨酸受體結合后使NO釋放,進而使γ-氨基丁酸能神經元活性增加,抑制大細胞型神經分泌細胞分泌OT和VP。結合本實驗結果,ER與NOS神經元在PVN和SON共存,主要分布在SON的背內側、背外側部,在此處的大細胞分泌OT和VP神經元。所以,我們有理由相信ER對OT和VP的調節是通過NO來實現的。此外,從雌激素本身的意義來看,女性進入絕經期后,伴隨著體內雌激素水平的下降,患各種疾病的風險增加。絕經后女性易患心血管疾病、高血壓、冠心病、骨質疏松,以及神經退行性疾病等,由此可以看出雌激素對預防和減少這類疾病的發生有重要意義。另一方面雌激素在對上述疾病發揮其保護作用恰恰又是通過NO實現的,