情緒應激對nod小鼠腦內c-fos表達和胰島細胞凋亡的影響

越來越多的證據表明，適應可以影響糖尿病和其他心理疾病的發生和發展。耐心可通過胰島內細胞的死亡來發揮糖尿病的作用。然而盡管我們知道應激是通過下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感-腎上腺髓質軸等影響免疫系統,而影響自身免疫性疾病的發生,但應激引起胰島內細胞凋亡增加的中樞及外周機制仍不清楚。本研究給予NOD小鼠情緒應激,觀察應激對腦內相關核團即刻早期基因C-fosmRNA表達和胰島細胞凋亡的影響,探討應激在1型糖尿病發病中的中樞神經機制。對象和方法1.1實驗動物及飼養條件采用由從澳大利亞WEHI醫學研究中心引進的NOD小鼠(210d齡時1型糖尿病自然發病率約70%),在我院動物實驗中心(二級標準)進行近親繁殖,選取二月齡小鼠進入實驗,雌雄各半。飼養條件為光照8Am-8Pm,室溫24℃,相對濕度60%,飼料、墊料及飲水均嚴格消毒。動物隨機分為對照組、應激1天組、應激2天組、應激3天組,每組6只。1.2方法1.2.1箱、瓶前應激采用飲水沖突模型裝置,該實驗方法結合了Vogel沖突實驗模型與Geller-Seifter沖突實驗模型所設計的操作箱(45cm×32cm×18cm)。箱的底部為不銹鋼柵欄,在頂部一端插入帶有不銹鋼瓶嘴的水瓶,瓶嘴伸入箱內6cm,距底柵6cm,并與底部柵欄一起通過導線和電腦時控儀、刺激器相連,瓶嘴外套絕緣膠皮,以防小鼠受到額外電擊。利用時控刺激器自動隨機地給予0.5mA電擊,全天進行,使小鼠經常在口渴與害怕預期電擊的趨避沖突中產生應激。為防止小鼠對應激習慣化,同時給動物予限制應激。應激裝置為自制不透明塑料小瓶(直徑為4cm,長8cm),小鼠在內難以轉身但不受壓。限制應激每天隨機給予1次,每次120分鐘。1.2.2石蠟切片和凋亡細胞原位使用Promega公司TUNEL凋亡檢測試劑盒。①鈍性分離胰腺,從胰尾部取約2mm×2mm×2mm組織,制作常規石蠟切片。②切片常規脫蠟至水。③0.3%H2O2室溫5-10min以滅活內源性過氧化物酶,蒸餾水洗2min×3次。④根據試劑盒所示操作步驟進行凋亡細胞原位未端標記。⑤蘇木素輕復染,蒸餾水洗。⑥梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。⑦顯微鏡觀察,在鏡下隨機數5-10個胰島,觀察其中凋亡細胞數(陽性細胞為胞核棕黃色著色)。1.2.3小鼠腦c-fos表達動力學檢測①斷頭后立刻鈍性分離小鼠腦部,用含0.1%DEPC的4%多聚甲醛/0.1MPBS固定120分鐘,20%蔗糖中過夜。②-20℃下的恒低溫冷凍切片機上行30μm連續冠狀切片,0.5%H2O2中處理5分鐘。③采用博士德公司提供的c-fos原位雜交檢測試劑盒,根據其說明書進行原位雜交法測定腦內c-fos的表達。DAB顯色。④用數碼相機在顯微鏡下采集小鼠腦片圖像。⑤計算機上用HPIAS病理圖文系統對c-fos表達進行分析,陽性細胞表示為個/104μm2。1.3統計處理采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析和相關分析。結果2.1lsd對小鼠應激的影響對照組與應激1、2、3天組胰島內細胞凋亡數分別為:0.82±0.93、3.93±1.05、5.73±2.60、5.77±2.75,方差分析顯示組間差異有顯著性(F=2.25,P<0.05))。LSD兩兩比較發現,應激組小鼠應激1、2、3天比未應激前有顯著升高(t=4.46、3.58、3.41,P<0.05或P<0.01)。根據形態學觀察應激后增加的凋亡細胞的主要成分為浸潤的淋巴細胞。2.2氧指數和c-fos檢測取腦切片后對額葉皮質(Fr,Frontalcortex)、海馬三區(Ca3,cornuAmmonis)、杏仁中央核(Ce,Centralamygaloidmuclei)、下丘腦背內側核(Dm,Dorsomedialhypothalamicnucleus)、下丘腦室旁核(Pa,HypothalamicParaventricularnucleus)、下丘腦外側區(LH,lateralhypothalamicarea)表達的c-fos進行檢測。結果如表1所示,在應激1天時,c-fos在Fr、Ca3的表達顯著高于對照組,2天時段應激組小鼠c-fos在除Ce外各核團的表達顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05),3天應激時小鼠c-fos在各核團表達均顯著高于對照(P<0.01或P<0.05)。2.3胰島細胞凋亡的相關性Ca3、Ce、Pa的c-fosmRNA表達與胰島細胞凋亡間存在統計學意義的正相關關系,相關系數分別為0.79、0.69、0.64,P<0.05或0.01,其它不存在相關性(P>0.05)。情緒應激與胰島細胞凋亡B細胞凋亡是糖尿病發病過程中B細胞損傷的主要形式。Lally等的研究發現胰島內細胞凋亡水平是糖尿病易患性動物的胰島功能下降和糖尿病發生情況的一個良好的指標。本研究發現胰島炎和胰島內細胞凋亡水平在應激后顯著增加,應激前后凋亡水平增加了近5-7倍。說明了情緒應激可以在1型糖尿病的發生發展中起著重要的作用。即刻早期基因(IEG)是腦內在接受了外界信息后最先被活化的基因,其中c-fos和c-jun是目前研究最多的IEG,是表示腦區激活的良好指標。大量文獻表明應激時腦內有廣泛的區域被激活。在本研究中,限制應激和飲水焦慮沖突應激引起了腦內包括額葉皮質、海馬、杏仁核、下丘腦外側區、下丘腦室旁核等核團的c-fos表達水平升高,這和前人的研究基本相符。與胰島細胞凋亡的相關分析顯示,海馬、杏仁核、下丘腦室旁核中的c-fos表達其時間趨勢與胰島細胞凋亡之間存在正相關關系,相關系數分別為0.79、0.69、0.64,這表明有可能應激時三者的激活與胰島細胞的凋亡相關。杏仁核和海馬是調節下丘腦室旁核功能的重要中樞,而室旁核則可啟動HPA軸和SNS軸的應激反應。杏仁核、海馬有廣泛的來自高級腦區同源投入投射聯系,同時兩者之間存在雙向的神經聯系,這三者是對下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感-腎上腺髓質軸的反應進行調控的關鍵中樞。終紋是杏仁核傳出到下丘腦的主要神經聯系。杏仁核通過多突觸聯系支配下丘腦室旁核小細胞部,研究顯示杏仁核外側區在情感反應中起到激活神經內分泌細胞的作用,杏仁核可能是通過GABA神經元抑制這些腦區的抑制性神經元的活動從而興奮下丘腦室旁核小細胞區的神經內分泌細胞的。而海馬則通過其皮質激素受體等對室旁核的反應起反饋調節作用。室旁核激活后則通過其對應激激素通路(HPA軸及神經內分泌應激激素)和神經通路(自主神經系統)的作用來調節免疫系統。應激可能就是通過以上對免疫系統調節的過程引起胰島細胞凋亡從而影響自身免疫型1型糖尿病的發生的。綜上所述:情緒應激可促使NOD小鼠胰島內細胞