土木動(dòng)物源性神經(jīng)肽y對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠下丘腦神經(jīng)肽y的影響

動(dòng)脈硬化（as）是各種心血管疾病的病理基礎(chǔ)。as的病因包括：血脂異常、血流量動(dòng)力學(xué)變化、肥胖、遺傳和感染等。as的發(fā)生機(jī)制和新的治療方法一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。八角莽草酸(shikimicacid)是植物代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物,有研究表明其有明顯抗血栓形成的作用,我們前期研究發(fā)現(xiàn)莽草酸可改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂水平和血液流變學(xué)指標(biāo),但其機(jī)制尚未明確。下丘腦是代謝調(diào)節(jié)的整合中樞,與機(jī)體代謝紊亂有關(guān)。本課題我們擬建立AS大鼠模型,探討八角莽草酸對(duì)AS大鼠下丘腦神經(jīng)肽Y(neuropeptideY,NPY)的影響。1試劑和儀器SD大鼠48只,雌雄不分,體質(zhì)量200～250g,由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,證號(hào):SCXK桂2007-0001。八角莽草酸由桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供,膽固醇(上海新興化學(xué)試劑公司,批號(hào):020628),膽酸鈉(德國(guó)Serva公司,批號(hào):040832),丙硫氧嘧啶(上海復(fù)興制藥廠,批號(hào):030615),維生素D3注射液(上海第九制藥廠,批號(hào):070603),免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司,兔多克隆NPY抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。2方法2.1動(dòng)脈血流試驗(yàn),造模成功檢測(cè)大鼠動(dòng)脈將SD大鼠隨機(jī)分為4組:模型組、莽草酸低、中、高劑量組,各12只,按文獻(xiàn)方法建立模型,一次性腹腔注射維生素D365萬(wàn)U/kg,高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料配方:膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、白糖5%、豬油10%、普通飼料81.3%)。喂養(yǎng)30d,每組隨機(jī)抽樣2只,檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈,以病理切片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊為造模成功。所有大鼠稱體質(zhì)量后,莽草酸低、中、高劑量組(25,50,100mg/kg),每天灌胃給藥1次,模型組灌胃等體積蒸餾水,自由進(jìn)食與飲水,連續(xù)6周。2.2連續(xù)冠片切片SD大鼠禁食12h后稱取體質(zhì)量,用10%水合氯醛腹腔麻醉,剪開胸廓暴露心臟,先行采血測(cè)血脂,然后進(jìn)行心臟灌注固定,去除顱骨取腦,30%蔗糖溶液浸泡,待組織沉底后,入恒冷切片機(jī)經(jīng)下丘腦行連續(xù)冠狀切片,片厚30μm裱于用明膠處理的載玻片上,置于冰箱中備用。2.3水岸民族地區(qū)各組織中ny免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)情況切片經(jīng)3%H2O250μl處理10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS沖洗,加正常山羊血清工作液封閉20min,傾去血清,滴加NPY抗體(1∶100)50μl,4℃過(guò)夜,PBS沖洗,加入生物素標(biāo)記二抗工作液50μl,37℃孵育40min,PBS沖洗,加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液50μl,37℃孵育40min,PBS沖洗,加新鮮配置的DAB工作液100μl顯色,以鏡下觀察為準(zhǔn),中性樹膠封片,鏡下觀察和照相。每批標(biāo)本均用0.01mol/LPBS代替一抗為陰性對(duì)照。參照腦立體定位圖譜,觀察下丘腦不同部位NPY免疫陽(yáng)性神經(jīng)元,結(jié)果判定:隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于細(xì)胞總數(shù)的5%為0分,5%～25%為1分,25%～50%為2分,50%～75%為3分,大于75%為4分。另一方面按陽(yáng)性細(xì)胞中染色的強(qiáng)度積分,弱陽(yáng)性為1分,中等陽(yáng)性為2分,強(qiáng)陽(yáng)性為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)積分與染色強(qiáng)度積分相加即為NPY表達(dá)水平。2.4.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)數(shù)資料兩樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料以算術(shù)平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差xˉ±sxˉ±s表示,比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1高密度膽固醇hdl的變化研究結(jié)果顯示,30例莽草酸組大鼠血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)分別為(0.97±0.13)mmol/L、(3.10±0.93)mmol/L、(1.87±0.37)mmol/L,與模型組比較,有顯著性差異(P<0.05),高密度脂蛋白膽固醇(HDL)未見明顯變化(P>0.05);莽草酸組體質(zhì)量增加值為(51.20±18.16)g,明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。3.2酸組中高校黃秋葵軟膜神經(jīng)核檢測(cè)免疫組化結(jié)果顯示,NPY陽(yáng)性染色主要位于胞漿中,為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒,胞核不著色,核周質(zhì)和突起被染為棕褐色,部分呈彌漫性胞漿染色。10例模型組大鼠中有8例顯示有NPY表達(dá),陽(yáng)性率為80.00%,30例莽草酸組中有11例顯示有NPY表達(dá),陽(yáng)性率為36.67%;兩者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較,有顯著性差異(χ2=5.65,P<0.05)。NPY陽(yáng)性神經(jīng)元在下丘腦以視前區(qū)和腹外側(cè)區(qū)處最為密集,并向腹內(nèi)側(cè)延伸,細(xì)胞數(shù)也逐漸減少,神經(jīng)纖維也逐漸稀疏。在視上核和室旁核,NPY陽(yáng)性神經(jīng)元呈卵圓形、圓形或多角形,細(xì)胞核呈空泡狀,細(xì)胞突起多少不等,多為2～6個(gè),而在弓狀核的陽(yáng)性神經(jīng)元染色較淺,數(shù)量較少并呈散在分布。對(duì)下丘腦視上核、室旁核和弓狀核的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行積分比較,結(jié)果顯示NPY在弓狀核的表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于視上核和室旁核(P<0.01),而在同一神經(jīng)核的不同劑量莽草酸NPY表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。4路徑一:養(yǎng)血?jiǎng)?duì)乳糜中游離脂肪酸的激活作用莽草酸是從中藥八角茴香中提取的一種單體化合物,具有抗菌抗腫瘤的作用,可通過(guò)影響花生四烯酸代謝,抑制血小板聚集,抑制動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成,肌注和靜注莽草酸均使小鼠血凝時(shí)間延長(zhǎng)。莽草酸可改善AS大鼠血漿黏度和血小板黏附率,抑制升高的血脂水平。本研究結(jié)果顯示,莽草酸可明顯降低AS大鼠TG、TC和LDL水平,并能抑制高脂飲食AS大鼠的體重增長(zhǎng),但對(duì)高密度脂蛋白膽固醇無(wú)影響。血漿LDL升高是AS發(fā)生和發(fā)展的必備條件,是最重要的致病性危險(xiǎn)因素,TG與血液的高凝狀態(tài)有關(guān),極低密度脂蛋白與乳糜微粒可活化凝血因子Ⅶ,TG濃度增高時(shí)從乳糜微粒釋放出來(lái)的游離脂肪酸可提供激活的接觸表面,吸引Ⅶ并使之激活。近年來(lái),源自神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部的神經(jīng)體液因素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響逐漸受到人們的關(guān)注,NPY是含36個(gè)氨基酸的多肽,分布于神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織,參與下丘腦飲食和能量代謝的調(diào)節(jié),中樞應(yīng)用NPY能促進(jìn)食物的攝入、體重增加、血甘油三脂升高,肝臟和白色脂肪組織的生脂活性增強(qiáng)。梁若斯等研究顯示,NPY可下調(diào)人血管平滑肌細(xì)胞的低密度脂蛋白(LDL)受體表達(dá),導(dǎo)致通過(guò)LDL受體介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝障礙,使血脂升高和低密度脂蛋白在血管壁中沉積。本研究結(jié)果顯示,NPY陽(yáng)性神經(jīng)元在AS大鼠下丘腦中的陽(yáng)性率為80%,應(yīng)用莽草酸可改善血脂水平,NPY在下丘腦的陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05),說(shuō)明NPY可能參與了AS大鼠血脂水平的調(diào)節(jié)。另有報(bào)道,高脂血癥大鼠下丘腦形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張、脫顆粒,高爾基復(fù)合體腫脹,極性消失,髓鞘板層松散,突觸結(jié)構(gòu)模糊,毛細(xì)血管內(nèi)皮中細(xì)胞器改變等。吳連仲等研究認(rèn)為,高脂血癥大鼠弓狀核NPY神經(jīng)元的數(shù)量、截面積和光密度減少,弓狀核神經(jīng)元中出現(xiàn)線粒體腫脹、空泡樣變性以及大量脂質(zhì)空泡等變化。本實(shí)驗(yàn)我們對(duì)莽草酸改善AS大鼠血脂指標(biāo)與下丘腦NPY表達(dá)關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示在不同劑量莽草酸作用下,NPY在弓狀核的表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于視上核和室旁核(P<0.01),認(rèn)為弓狀核可能在莽草酸對(duì)AS大鼠血脂水平調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用,推