蛹蟲草培養基的優化研究

蛹草科又稱北蟲，屬于囊性菌科、肉科、麥角形菌科和甘草科。它是一種稀有的藥物和食品菌。它具有抗疲勞、抑制腫瘤和提高身體活力的作用。市場需求量與日俱增，具有很大的研究和開發空間。天然蟲草資源十分匱乏,而半人工栽培生產周期長,且技術不易掌握。通過液體深層培養法可獲得與天然蟲草化學成分相近的菌絲體,還可獲得次生代謝產物,且能大大縮短生產周期。所以,液體發酵培養蟲草菌絲是獲得蟲草產品的重要手段。大多學者研究了蛹蟲草固體培養基的栽培技術,而忽略了液體發酵深層培養的重要性及優勢。為此,本研究對蛹蟲草菌絲液體發酵條件進行了系統研究,以明確不同碳源和氮源對蛹蟲草菌絲生長的影響,篩選出符合要求的碳源和氮源,從而篩選出優質液體培養基配方,旨為蛹蟲草生產及相關科學研究提供技術參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒蛹蟲草斜面固體菌種,由遼東學院實驗中心微生物實驗室提供。1.1.2試劑1.1.2.1碳源葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉。均為AR試劑,國藥集團化學試劑有限公司生產。1.1.2.2.氮的來源蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏,均為BR試劑,天津大茂化學試劑廠生產;檸檬酸氫二銨,為AR試劑,國藥集團化學試劑有限公司生產。1.1.3儀器和設備LDZX-F50立式電熱高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠),超凈工作臺(北京亞泰科隆實驗科技開發中心),Hps-160bs-Ⅱ恒溫恒濕培養箱(北京泰亞賽福科技發展有限責任公司),SHA-C型水浴振蕩器(金壇市高爾實驗儀器廠),離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司),遠紅外快速恒溫干燥箱(吳江華東標準烘箱有限公司),SHZ-ⅢA循環水式真空泵(河南一恒儀器有限公司)。1.1.4培養基1.1.4.1種子的扁平梯度馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀2g,瓊脂20g,水1000mL,pH值自然。1.1.4.2.基礎液體發酵培養基葡萄糖20g,蛋白胨5g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂1g,鹽酸硫胺素15mg,水1000mL,pH值自然。1.2培養子平板培養基先進行菌種活化。將斜面固體菌種接種在種子平板培養基上,在恒溫培養箱內20～22℃條件下培養7d,菌絲長滿后轉色,備用。本研究分適宜碳源和氮源2個部分進行。1.2.1關于碳源的研究1.2.1.培養基的碳源制備試驗設葡萄糖(CK)、乳糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉5種碳源處理,分別以20g/L濃度替代液體發酵基礎培養基中的唯一碳源(葡萄糖)制備培養基。液體培養基分裝在250mL三角瓶內,每瓶100mL,5次重復。所有培養基均常規滅菌。在無菌條件下,用打孔器取活化菌種接到液體培養基內,于20～22℃、130r/min條件下振蕩培養。7d后將發酵液過濾,菌絲用蒸餾水沖洗干凈,于60℃條件下烘干后稱重。比較菌絲干重,篩選出最佳碳源種類。1.2.1.培養基的制備以1.2.1.1篩選出的最佳碳源種類為碳源,分別以10、15、20、25和30g/L濃度制備培養基。利用與1.2.1.1相同的方法接種、培養、過濾、烘干和稱重。比較菌絲干重,確定最佳碳源適宜的濃度。1.2.2關于氮源的研究1.2.2.培養基的制備試驗設蛋白胨(CK)、牛肉膏、酵母浸膏和檸檬酸氫二銨4種氮源處理,分別以5g/L濃度替代液體發酵基礎培養基中的唯一氮源(蛋白胨)制備培養基。利用與1.2.1.1相同的方法接種、培養、過濾、烘干和稱重。比較菌絲干重,篩選出最佳氮源種類。1.2.2.培養基的制備以1.2.2.1篩選出的最佳氮源種類為氮源,分別以10、15、20、25和30g/L濃度制備培養基。利用與1.2.1.1相同的方法接種、培養、過濾、烘干和稱重。比較菌絲干重,確定最佳氮源適宜的濃度。2結果與分析2.1蔗糖培養產量5種碳源培養基中,可溶性淀粉培養的菌絲產量(菌絲干重2.091g/L)最高,且顯著高于其他處理;蔗糖培養產量(菌絲干重1.891g/L)次之;麥芽糖培養的菌絲產量最低(菌絲干重1.324g/L),但與乳糖培養的菌絲產量(菌絲干重1.366g/L)差異不顯著(表1)。因此,確定液體發酵培養基的最佳碳源為可溶性淀粉。2.2可溶性淀粉用量對枯草芽孢桿菌生長的影響菌絲產量隨可溶性淀粉濃度的升高而增大,濃度為20g/L時,菌絲產量最高為2.135g/L;當可溶性淀粉濃度增加到25g/L時,菌絲產量增加不明顯;當可溶性淀粉濃度再增加時,菌絲生長呈停滯趨勢(表2)。因此,確定液體發酵培養基中可溶性淀粉的最佳濃度為20g/L。2.3其他處理前后織物上添加3.5%的時率4種氮源培養基中,酵母浸膏培養的菌絲產量(菌絲干重2.231g/L)最高,顯著高于其他處理;牛肉膏培養的菌絲產量<CK,但差異不顯著;而檸檬酸氫二銨培養的菌絲產量顯著<CK(表3)。因此,確定液體發酵培養基的最佳氮源為酵母浸膏。2.4不同濃度5g/l時枯草芽孢芽孢桿菌干重5g/l在試驗濃度范圍內,菌絲產量隨酵母浸膏濃度的升高而增大,在濃度為5g/L時菌絲產量出現高峰值(菌絲干重2.390g/L),其后產量稍有下降但并不明顯(表4)。因此,確定液體發酵培養基中酵母浸膏的最佳濃度為5g/L。3酵母粉用量對各培養菌株的影響本研究結果表明,在蛹蟲草菌絲液體發酵培養基中,碳源以可溶性淀粉最為適宜,適宜濃度為20