rs組分對乳酸菌發酵產生廣抗菌肽bac-j23的影響

抗感菌活性是指在代謝過程中產生的一種具有抗菌活性的蛋白質或茶多酚。它被認為是天然食物制劑和飼料添加劑，具有廣闊的開發和應用前景，但低發酵合成能力是限制大規模生產和應用的瓶頸之一。目前對抗菌肽發酵生產的優化研究主要集中在培養基優化、培養環境、發酵方式等方面。前人研究發現,Nisin發酵中最佳的碳源是葡萄糖和蔗糖,乳酸鏈球菌分泌合成Nisin培養基關鍵組分為氮源;PO43-對Nisin合成具有刺激效果,Ca2+能明顯促進Nisin的活性,但Mn2+對Nisin的合成具有負面影響。本課題組前期從我國傳統發酵食品中成功篩選獲得一株產廣譜抗菌肽Bac-J23的乳酸菌LactobacillusJ23,為了開展該菌株發酵合成抗菌肽Bac-J23的研究,對乳酸桿菌培養專用MRS培養基的組分對Bac-J23合成影響進行了研究,旨在選擇一種既適合LactobacillusJ23生長且利于Bac-J23合成的組分相對簡單的培養基,為將來從發酵代謝角度對LactobacillusJ23合成廣譜抗菌肽Bac-J23進行調控奠定基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇乳酸菌LactobacillusJ23由本實驗室分離。1.1.2mnmn-3-苯基液mse蛋白胨10g,肉膏10g,酵母提取物10g,檸檬酸二銨2g,K2HPO42g,葡萄糖20g,乙酸鈉5g,MnSO4·4H2O0.25g,吐溫801mL,MgSO4·7H2O0.58g,加水至1000mL,調pH值至6.3,121℃滅菌15min。葡萄糖溶解于200mL水中單獨滅菌后混合。1.2儀器、設備和顆粒pH計,德國SartoriusAGPB-10;紫外可見分光光度計(上海儀器有限公司);無菌操作臺(蘇州凈化設備有限公司);生化培養箱(廣東省醫療器械廠);電子天平(賽多利斯有限公司);電子水浴鍋(江蘇國華儀器廠);滅菌鍋(上海華線核子儀器有限公司);離心機(湖南星科儀器有限公司)。1.3方法1.3.1最佳碳源的確定對葡萄糖、乙酸銨、檸檬酸氫二銨各自組合,以不含上述3種碳源的MRS培養基為對照,研究對LactobacillusJ23發酵合成Bac-J23的影響,分析確定最優碳源及其最佳濃度。1.3.2最佳碳源的確定對MRS中蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏各自組合,以不含上述3種有機氮源的MRS培養基為對照,37℃發酵24h,研究對Bac-J23合成和LactobacillusJ23生長的影響,分析確定最優碳源及其最佳濃度。1.3.3lactabacisj23的發酵合成分別對MRS培養基中其他組分(吐溫,MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O),研究其對LactobacillusJ23發酵合成Bac-J23的影響,分析確定最優碳源及其最佳濃度。1.3.4指示菌最佳稀釋度采用瓊脂擴散法,細菌素活力定義為用對指示菌觀察不到抑菌圈出現的最高稀釋度,其倒數為細菌素效價值(AU/mL),計算式為AU/mL=2n×(1000/x),x為細菌素加樣體積,n為對指示菌顯示抑菌圈的孔數;1000為體積換算值。2結果與分析2.1合成bac-j23葡萄糖(A:20g/L)、檸檬酸氫二銨(B:2g/L)、乙酸鈉(C:5g/L)為MRS培養基的主要碳源。上述3種碳源及其各自組合對Bac-J23合成的影響結果見圖1。結果表明,葡萄糖(20g/L)和檸檬酸氫二銨(2g/L)抑制了Bac-J23的合成;乙酸鈉(5g/L)對Bac-J23的合成具有刺激誘導作用,但合成誘導作用方式及機理還有待于進一步深入研究。進一步研究了其他有機碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖)對合成Bac-J23的影響,結果見圖2。麥芽糖最有利于菌體生長,而蔗糖最有利于Bac-J23合成;Bac-J23的合成與菌體生長進程表現出不一致性。2.2培養基中主要氮源的確定蛋白胨(A:1%)、酵母提取物(B:0.5%)、牛肉膏(C:1%)、檸檬酸氫二銨(0.2%)為MRS培養基中的主要氮源。研究了上述幾種氮源及各自組合對Bac-J23發酵合成和菌體生長的影響。從圖3可知,酵母提取物對菌體的生長和Bac-J23的合成均最有利于,而蛋白胨沒有明顯效果,因此將牛肉膏和酵母提取物作為優選氮源,從而簡化了培養基組分。2.3kh2po4對bac-j23的合成影響從圖4可知,不同濃度的KH2PO4對Bac-J23合成和菌體生長具有不同的影響。當KH2PO4濃度大于5g/L時,對菌體生長不利;相對而言,KH2PO4(15g/L~20g/L)對Bac-J23的合成更有利,但當KH2PO4高于20g/L時,對菌體生長和Bac-J23的合成均出現負面影響。VUYSTL等研究了KH2PO4對Nisin的合成影響,發現KH2PO4對Nisin合成和菌體生長均有明顯的刺激作用。2.4bac-j23發酵條件對bac-j23發酵的影響MgSO4在MRS中的濃度一般為0.58g/L,考察了不同濃度MgSO4對Bac-J23發酵合成和菌體生長的影響。從圖5可知,當培養基中MgSO4為0.2g/L時,對Bac-J23的合成最有利,而MgSO4濃度變化對菌體生長的影響不明顯。2.5mnso4對bac-j23生長和菌體生長的影響MRS中MnSO4的初始濃度為0.25g/L,研究了不同濃度的MnSO4對Bac-J23合成和菌體生長的影響。從圖6可知,MnSO4對Bac-J23合成和菌體生長都沒有明顯影響。2.6tween-80對bac-j23活性的影響MRS中Tween-80的初始濃度為0.1%,考察了不同濃度的Tween-80對Bac-J23合成和菌體生長的影響。從圖7可知,Tween-80對LactobacillusJ23的生長和Bac-J23的合成沒有明顯影響。當Tween-80的濃度大于0.2%,對Bac-J23抗菌活性有負面影響,這可能是由于Tween-80與合成的Bac-J23結合形成了復合體,導致Bac-J23的活性降低或完全失去活性。液體培養基中Tween-80含量過高不利于Bac-J23的分純。3氮源中酵母提取物對bac-j23合成的影響研究了MRS培養基各組分對LactobacillusJ23發酵合成廣譜抗菌肽Bac-J23的影響。乙酸鈉對Bac-J23的合成具有誘導作用,外加有機碳源中蔗糖對Bac-J23合成最有利,氮源中酵母提取物對LactobacillusJ23的生長和Bac-J23的合成均具有明顯的促進作用,高濃度的KH2PO4比低濃度的KH2PO4更有利于Bac-J23的合成,MgSO4最適濃度為0.2g/L時,而MnSO4和Tween-80對Ba